双光子显微镜
双光子显微镜原理
双光子显微镜原理
1 、双光子显微镜原理
双光子显微镜是一种新型的三维显微技术，它由一个复杂的光子传输仪、一个激光源和一个光学探头组成。
双光子显微镜的基本原理是利用微米级的激光束分别照射样品表面，多达几千个光子则被反射到仪器的探头，这些光子经过聚焦到固定的电子探测器上，并被计算机整合，获得了样品的三维结构信息。
双光子显微镜最大的优点在于可以实现快速、高分辨率、高空间分辨率的三维显微成像。
此外，由于光学部分的几乎完全抑制，可以大大减少在样品上的损伤。
双光子显微镜的应用可以分为两个主要方面：一是定量构象成像，在生物和材料科学等领域有着广泛的应用，可以用来获得更多的生物结构信息以及揭示细胞活性的详细机理；另一个是影像计算术，主要是利用图像分析的方法来解决复杂的问题，如双光子显微镜可以用来分析样品深度和结构，从而获得物质成分、表面形貌以及更多的三维信息。
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双光子显微镜工作原理
双光子显微镜工作原理
双光子显微镜的工作原理
双光子显微镜是一种新型的显微技术，它是在光学观察下观察生物样本的最新技术，它可以实现非常高的分辨率和原位观察，比传统的显微镜技术更加的灵敏和准确。
双光子显微镜的工作原理是利用双光子分子吸收谱来观察生物样品。
双光子显微镜的工作原理是借助双光子的趋向性，当双光子吸收谱以较低的功率射射入样本的时候，双光子就会释放出另外一个光子，这个光子会受到样本的影响，从而形成一个分子图像，而这个图像就是我们看到的图像。
双光子显微镜的观察深度是非常深的，可以达到纳米级别的分辨率。
此外，由于双光子吸收谱的低功率，因此样本不会受到任何损伤，这意味着可以进行原位观察。
由于双光子显微镜的优势，它已经受到了各界的广泛应用。
它主要用于细胞学、药物研究、病毒检测、微生物观察等领域。
同时，由于它可以实现非常高的分辨率，也可以用于医学影像学等领域。
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双光子显微镜的独特优势.
相关技术指标与进口必要性双光子显微镜的独特优势有以下几点：1）双光子显微镜采用长波长激发，长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本，双光子显微镜的穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍。
对于皮层较深处神经元的活动观察更加全面。
2）焦平面外的荧光分子不被激发，成像的亮度和信噪比高。
更加适合活体下微弱荧光信号的观察。
3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小，比较适合活细胞长时间的动态观察。
4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。
所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。
利用活体双光子显微镜，我们可以对脑科学的几个前沿领域进行更加深入的研究。
利用活体双光子显微镜的光遗传学操作能力，我们可以对某类神经元的激活和失活进行高精度的操作，对这些神经元的特殊功能的进行研究。
在活体水平下，我们可以对皮层在清醒、静息状态下就存在有组织的脑功能活动进行观察，从而加深我们对大脑在内外环境的监测、情节记忆及自我意识方面的理解。
利用活体双光子显微镜的多点光激活能力，我们可以研究多个神经细胞之间的连接和控制，来更好的了解神经信号之间复杂动态的编码过程。
目前国内没有同类产品，其他设备在各个技术层面都无法满足我单位要求，为更好的开展神经学研究，故申请购置此套设备。
主要技术指标：1 显微镜1.1 适用于活体动物操作的正置显微镜，物镜下自由空间高度≥23 cm；1.2 显微镜镜体置于XY电动载物台之上，可通过移动显微镜镜体的方式对样品进行定位和观察；1.3 显微镜镜体移动通过软件控制，XY方向行程≥35 mm，步进≤100 nm；1.4 配备长寿命落射荧光光源；1.5 配备可观察FITC和DsRed的滤色块；1.6 配备全角度物镜转盘，物镜可旋转、可倾斜，能够以任何角度垂直接近样品表面；1.7 配有放大倍率为4倍, NA≥0.2, WD≥20mm的物镜。
双光子荧光显微镜的研究
浙江大学』Ⅲ！｛ｊ学位论文第二章双光ｆ成像理论吒。
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２唧陶㈦，．ｓ，（ａ）（ｂ）图２—３荧光强度径向归一化分布（ａ）甲光子荧光光强径向归～化分布（ｂ）双光予荧光光强径向归～化分布蔫浙江大学顺士学位论文第三章双光于实验系统简介第三章双光子实验系统简介在了解了双光予成像理论的基础上，介绍实验中双光子成像系统的流程以及备个组成部分。
通过前期的实验，分析和总结得到的实验数据，经理论计算后，对取光子系统的性能做了一个测试，为双光子荧光成像实验，以及双光子、ＯＣＴ相结合实现结构功能成像等后期科研的展开打下基础。
本章首先介绍了双光子荧光成像系统的流程，然后对其主要部分：光学成像设计、光电转换、机械扫描做了一个简要的介绍，研制了新型的扫描探头。
§３．１双光子荧光成像实验系统流程双光予实验系统的总体构架如图３一ｌ所示图３，ｌ双光子荧光显微镜实验系统图对于一个完整的双光子荧光成像系统，一般应包括：光学成像、光电转换、机械扫描、计算机控制、数据采集、数据处理和显示等几个部分。
其系统流程如第二章职光予实验系统简介在探测器前面放置了荧光滤光片，来选择适当的荧光范围，过滤背景光，提高系统的信噪比。
图３—３中虚线框内表示的是ＮＩＫＯＮ５０Ｉ显微镜丰体，其详细结构如图３－４所示：图３．４ＮＩＫＯＮ５０Ｉ显微镜光路图箭头的方向表示光束入射的方向。
由图可以知道，Ｎ１ＫＯＮ５０１显微镜本身结构中就包含了落射式和透射式两种激发荧光的方式，可以根据需要来选择。
由第章ｌ｝，的介绍，可以知道，对本次实验来说，为最大程度的探测荧光，用落射式采集荧光的效率高，所以只利用显微镜上半部分的光路。
双光子显微镜原理
双光子显微镜原理
双光子显微镜是一种先进的显微镜技术，利用双光子激发来实现高分辨率的三维成像。
双光子显微镜原理的核心在于利用两个光子同时激发样本中的荧光分子，从而实现对样本的高分辨率成像。
在传统的荧光显微镜中，通常使用单光子激发样本中的荧光分子，但是由于单光子的激发会导致样本的非特异性激发，从而降低了成像的分辨率。
而双光子显微镜利用两个光子同时激发样本中的荧光分子，只有在两个光子同时到达时才会发生激发，因此可以实现更高的空间分辨率。
双光子显微镜原理的关键在于双光子的激发机制。
在双光子显微镜中，两个光子的能量之和等于被激发的荧光分子的激发能级，当两个光子同时到达时，才能使荧光分子跃迁到激发态，从而产生荧光信号。
由于双光子的激发需要两个光子同时到达，因此只有在聚焦点附近才会发生激发，从而实现了更高的空间分辨率。
双光子显微镜原理的另一个重要特点是深度成像能力。
由于双光子的激发是非线性的过程，只有在聚焦点附近才会发生激发，因此双光子显微镜可以实现深度成像，即在样本内部进行高分辨率的三维成像。
这使得双光子显微镜在生物医学领域的应用具有重要意义，可以实现对生物样本内部结构的高分辨率成像。
总的来说，双光子显微镜原理利用双光子激发实现了高分辨率的三
维成像，具有高空间分辨率和深度成像能力。
这种先进的显微镜技术在生物医学领域有着广泛的应用前景，可以帮助科研人员更好地理解生物样本的内部结构，并促进生物医学研究的发展。
双光子显微镜用途
双光子显微镜用途双光子显微镜（Two-photon microscope）是一种高分辨率的显微镜技术，它利用两个低能量的光子同时激发样本，从而获得三维立体的高清图像。
与传统显微镜技术相比，双光子显微镜具有较大的穿透深度、较低的背景荧光和较少的细胞损伤等优点，因而被广泛应用于生物医学研究领域。
双光子显微镜的原理是利用两个相当低频率的激光束同时通过透镜，进入样品。
当两个低频激光束在样品中的焦点交汇时，只有同时处于两束光子对应波长的区域才会被激发发光，使得仅激发样品焦点位置的荧光信号形成。
这种二次非线性光学过程产生的双光子荧光信号，则可以在样品内深层结构进行高分辨率成像。
另一方面，双光子激发荧光信号仅在焦点内产生，减少了有机染料等光毒性物质对生物样品的损伤。
双光子显微镜的应用范围非常广泛，以下是一些主要的用途：1. 细胞和组织成像：双光子显微镜可以在活体细胞和组织上进行高分辨率的成像，观察细胞内的分子和结构。
它可以提供细胞和组织的立体结构、形态、空间分布和细胞动力学等相关信息，对于研究细胞的表面、核内结构和细胞器的功能有重要意义。
2. 神经活动成像：双光子显微镜可以通过染色剂或染料与生物标记物相互作用，对神经元的形态、连接和电生理活动进行实时观察。
科研人员可以利用这一技术来研究神经元的空间分布、突触传递、突触结构和神经网络的功能等。
3. 癌症研究：双光子显微镜可以观察和追踪肿瘤细胞在活体内的扩张和转移过程。
通过染色剂或荧光标记物，可以定量测量肿瘤细胞或器官中的生化分子表达。
同时，双光子显微镜还可以用于药物研发和评估，以及肿瘤病理过程的研究。
4. 免疫学研究：双光子显微镜可以观察和监测免疫细胞在活体内的迁移和活动过程。
例如，它可以用来研究免疫细胞与细菌、病毒、寄生虫等病原体的相互作用，以及固定免疫细胞和移行免疫细胞之间的相互作用。
5. 皮肤研究：双光子显微镜可以在活体皮肤上观察细胞和组织的生理和病理过程，如麻风病、荨麻疹、红斑狼疮等。
双光子显微镜的独特优势
相关技术指标与进口必要性双光子显微镜的独特优势有以下几点：1）双光子显微镜采用长波长激发，长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本，双光子显微镜的穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍。
对于皮层较深处神经元的活动观察更加全面。
2）焦平面外的荧光分子不被激发，成像的亮度和信噪比高。
更加适合活体下微弱荧光信号的观察。
3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小，比较适合活细胞长时间的动态观察。
4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。
所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。
利用活体双光子显微镜，我们可以对脑科学的几个前沿领域进行更加深入的研究。
利用活体双光子显微镜的光遗传学操作能力，我们可以对某类神经元的激活和失活进行高精度的操作，对这些神经元的特殊功能的进行研究。
在活体水平下，我们可以对皮层在清醒、静息状态下就存在有组织的脑功能活动进行观察，从而加深我们对大脑在内外环境的监测、情节记忆及自我意识方面的理解。
利用活体双光子显微镜的多点光激活能力，我们可以研究多个神经细胞之间的连接和控制，来更好的了解神经信号之间复杂动态的编码过程。
目前国内没有同类产品，其他设备在各个技术层面都无法满足我单位要求，为更好的开展神经学研究，故申请购置此套设备。
主要技术指标：1 显微镜1.1 适用于活体动物操作的正置显微镜，物镜下自由空间高度≥23 cm；1.2 显微镜镜体置于XY电动载物台之上，可通过移动显微镜镜体的方式对样品进行定位和观察；1.3 显微镜镜体移动通过软件控制，XY方向行程≥35 mm，步进≤100 nm；1.4 配备长寿命落射荧光光源；1.5 配备可观察FITC和DsRed的滤色块；1.6 配备全角度物镜转盘，物镜可旋转、可倾斜，能够以任何角度垂直接近样品表面；1.7 配有放大倍率为4倍, NA≥0.2, WD≥20mm的物镜。
双光子显微成像技术的应用
双光子显微成像技术的应用随着科技的不断发展，显微镜也得以不断更新，其中一个比较先进的显微镜技术就是双光子显微成像技术。
这种技术有着比较多的优点，例如无需染色、可以观察活体细胞、分辨率高等优点，因此越来越被广泛应用。
下面我将从四个方面来讨论双光子显微成像技术的应用。
一、医学领域双光子显微成像技术可以应用于医学领域，用来观察和诊断疾病。
因为这种技术可以实现对细胞和组织的三维成像，所以可以被用来观察细胞和器官的结构，包括神经系统、肾脏、心脏、眼睛等。
这种技术对神经系统的研究尤为重要，因为它能够揭示神经元的分布、连接和功能，这些信息对于研究神经系统疾病，如阿尔茨海默病或帕金森病，很有帮助。
二、药物研发双光子显微成像技术还可以用于药物研发过程中的动态观察，例如药物在体内的传递和作用。
它可以实现对药物和细胞相互作用的实时研究，因此有助于发现新的药物并提高疗效。
同时，这种技术也对了解药物治疗的机制有所帮助，例如药物在身体内的扩散过程以及药物的靶向作用等等。
三、植物科学双光子显微成像技术同样可以用于植物科学领域。
这种技术可以帮助研究植物的不同组织的结构、发育和功能，如根系、叶片、花等。
它还可以帮助研究植物的光合作用、病原体感染和对气候变化的适应。
这些研究对于环境保护和农业生产都有着重要的作用。
四、材料科学最后，双光子显微成像技术还可以用于材料科学领域中。
这种技术可以实现对材料表面和内部的三维成像，例如纳米材料和生物材料等。
它也可以被应用于研究材料性能的动态变化、材料与其他物质的相互作用以及材料制备过程中的结构演变等。
总的来说，双光子显微成像技术在各个领域都有着广泛的应用前景，并且由于其相对较低的毒性和无伤害性，它将会被越来越多地应用于活体细胞和组织的研究。
双光子显微镜行业报告
双光子显微镜行业报告双光子显微镜是一种高级显微镜，利用非线性光学效应，可以实现对生物组织和材料的三维高分辨成像。
它具有深部成像能力、非侵入性和高分辨率等优点，因而在生命科学、医学、材料科学等领域具有广泛的应用前景。
本报告将对双光子显微镜行业进行深入分析，以期为相关研究和应用提供参考。
一、双光子显微镜的原理及技术特点。
1. 原理，双光子显微镜利用两个光子几乎同时被吸收的机制，通过激光激发样品中的荧光分子，实现成像。
相比传统的荧光显微镜，双光子显微镜能够减少样品的光损伤和光散射，实现更深层次的成像。
2. 技术特点，双光子显微镜具有深部成像能力、非侵入性、高分辨率、三维成像能力等特点，适用于活体成像、细胞内部结构观察、神经元成像等领域。
二、双光子显微镜行业发展现状。
1. 技术发展，随着激光技术、探测器技术、成像算法等方面的不断进步，双光子显微镜的成像速度、分辨率和深度都得到了提升，使其在生命科学和医学领域的应用更加广泛。
2. 应用领域，双光子显微镜已经在神经科学、细胞生物学、药物研发、组织工程等领域得到了广泛应用，成为研究和临床实践中的重要工具。
三、双光子显微镜行业市场前景分析。
1. 市场需求，随着生命科学和医学领域的不断发展，对于高分辨、深度成像的需求不断增加，双光子显微镜具有良好的市场前景。
2. 技术进步，双光子显微镜的技术不断提升，成像速度和分辨率得到了改善，使其在临床诊断、生物医学研究等领域的应用前景更加广阔。
四、双光子显微镜行业发展面临的挑战。
1. 成本，双光子显微镜的成本较高，限制了其在一般实验室和临床医院的推广应用。
2. 技术壁垒，双光子显微镜的技术要求较高，需要相关领域的专业知识和技能，限制了其在一般研究人员和医生中的应用。
五、双光子显微镜行业发展趋势。
1. 多模态成像，未来双光子显微镜可能与其他成像技术相结合，实现多模态成像，提高成像的信息量和准确度。
2. 应用拓展，双光子显微镜可能在组织工程、药物筛选、病理诊断等领域得到更广泛的应用。
双光子显微镜技术
双光子显微镜技术作者：细胞生物组刘洋完整ppt请见附件双光子显微镜问世于上世纪90年代，是结合了激光共聚焦显微镜和双光子激发技术的产物。
目前，双光子显微术以其大穿深、低光毒性、低光漂白等优点而被广泛应用于活体和活细胞/组织的成像观察。
本报告将对双光子显微镜发明的背景、实现方式、技术特点、应用领域及发展趋势进行简要介绍。
一、双光子显微镜发明的背景光学显微镜的发展历史是一段不断提高分辨率的历史。
在传统宽场（Widefield microscope, WF）光学显微镜中，来自标本不同纵深的光线都可以投射到同一焦平面上（视网膜或感光元件在此），导致被接收的光线90%是来自焦平面外的杂散光，因此宽场显微镜的成像是整个标本的重叠像，没有纵向分辨能力。
对标本内部细节的表现很差，严重影响了分辨率。
为了消除杂散光的干扰，Malvin Minsky于1957年提出了一种利用狭小针孔（Pinhole）滤除焦平面外杂散光的设想，并由G. J. Brakenhoff于1978年借助激光最终实现，这就是激光共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope, confocal）。
与宽场显微镜不同的是，激光共聚焦显微镜在成像侧的焦点位置设置了一个针孔，只允许来自另一个焦点的荧光通过，而来自其他焦平面的杂散光则被屏蔽。
通过焦点的荧光被感光元件（光电倍增管、CCD或CMOS）接收，形成一个点的荧光强度信号。
为了解决二维成像问题，激发光通过一组高速摆动的振镜，在标本上进行X-Y方向扫描，来自扫描区域内各点的信号最后通过计算机重新合成为一张图片。
由于有效滤除了杂散光，激光共聚焦显微镜的分辨率相比宽场显微镜有了本质上的提高（横向200nm，纵向400nm），拥有了对样本的特定焦平面进行精细成像的能力（称为光学切片或“细胞CT”），解决了标本内部细节的问题。
在此基础上，激光共聚焦显微镜能够结合多种其它参数，得到重建后的三维图像（XYZ模式）、动态图（XYt模式）或光谱图（XYλ）等数据，以供后续的形态学、动力学等定量分析。
双光子共焦显微镜的工作原理
双光子共焦显微镜的工作原理双光子共焦显微镜（Two-Photon Confocal Microscope, 2P-CM）是一种高分辨率的显微镜技术，通过使用非线性光学效应来实现对生物样品的成像。
与传统的单光子荧光显微镜相比，双光子共焦显微镜具有更好的光深穿透能力和较低的光损伤性，因此被广泛应用于生命科学研究领域。
1. 双光子共焦显微镜的基本原理1.1 光的双光子吸收双光子共焦显微镜利用注入样品的高能量激光束，通过非线性吸收效应实现成像。
在常规显微镜中，荧光分子被激发到高能级，然后辐射出较低能级的光子。
而双光子共焦显微镜中，两个低能量光子同时作用于样品的一个分子上，通过吸收两个光子的能量，荧光分子才会被激发。
这种吸收方式只发生在激光束的焦点附近。
1.2 双光子激发荧光在双光子共焦显微镜中，激发的荧光只发生在光束焦点的非线性光学效应区域内。
由于双光子激发荧光只发生在焦点处，因此可以避免样品其他区域的荧光信号干扰。
这样，双光子共焦显微镜可以实现更好的光深穿透能力，同时减少了样品的光损伤。
2. 双光子共焦显微镜的工作步骤2.1 激光光源双光子共焦显微镜使用超快激光作为光源。
这些激光器产生具有较高光能量和较窄脉冲宽度的激光束。
常用的激光器包括钛宝石激光器和光纤激光器。
2.2 光路系统双光子共焦显微镜的光路系统主要包括准直系统、物镜、光学滤波器和探测器。
准直系统通过聚焦激光束，将其聚焦到样品的焦点位置。
物镜收集经过样品的荧光信号，并将其聚焦到探测器上。
光学滤波器用于选择特定的波长范围，以增强成像质量。
2.3 数据采集和成像双光子共焦显微镜通过扫描激光束和收集荧光信号来获取图像。
通常，激光束在样品上进行快速扫描，而探测器记录下相应的荧光信号。
通过逐点记录和成像，可以获得三维样品信息。
3. 双光子共焦显微镜的应用3.1 三维成像双光子共焦显微镜具有较好的光深穿透能力，在生命科学研究中被广泛用于三维细胞和组织成像。
双光子共聚焦显微镜的原理
双光子共聚焦显微镜的原理概述双光子共聚焦显微镜（Two-Photon Confocal Microscopy）是一种高分辨率三维显微镜技术，能够实时观察生物标本的活体动态过程。
相较于传统的单光子共聚焦显微镜，双光子共聚焦显微镜具有更高的分辨率、较大的穿透深度和较小的光损伤。
双光子共聚焦显微镜基于非线性光学效应，利用非线性显微镜技术实现高分辨率成像。
其原理是通过同时或交替地聚焦两束高能量激光光束，在聚焦点附近产生非线性吸收效应，从而实现高分辨率的三维成像。
光学原理1. 激光光源双光子共聚焦显微镜通常使用飞秒激光器作为光源。
飞秒激光器具有短脉冲宽度和高峰值功率的特点，激发样品时光线非常集中，能够有效减小光损伤和光散射。
2. 非线性光学效应双光子共聚焦显微镜利用非线性吸收现象来实现高分辨率成像。
在样品中，通常需要使用荧光标记的染料或者色素进行成像。
这些染料或者色素具有非线性吸收的特性。
在双光子共聚焦显微镜中，两束飞秒激光光束在样品的焦点处交叉，产生高能量密度的光子。
这些光子被样品中的非线性物质吸收，导致非线性激发发生。
非线性激发产生的荧光信号被收集并记录下来，从而实现高分辨率的成像。
3. 深度成像双光子共聚焦显微镜由于使用了长波长的激光束，具有较大的光学穿透深度。
这是因为长波长的光在样品中的散射和吸收较小，能够更好地穿透表面的组织。
此外，由于双光子共聚焦显微镜是基于非线性吸收效应的，只有在激光焦点附近才会发生非线性吸收。
这也意味着只有在焦点位置处的样品才会被激光激发，从而减小了其它位置的光损伤，增加了穿透深度。
操作原理1. 激光扫描双光子共聚焦显微镜通过激光扫描的方式获取样品的三维信息。
通常，激光束经过反射镜和扫描镜，通过改变扫描镜的角度和位置，使激光在样品表面扫描移动。
2. 荧光信号收集双光子共聚焦显微镜在样品表面或焦点处收集荧光信号。
收集的荧光信号经过乳胶片或者光电倍增管进行记录和放大。
由于双光子共聚焦显微镜具有优异的光收集能力和高信噪比，能够对低强度荧光信号进行高灵敏度的接收。
活体双光子显微镜系统技术参数和性能说明
工作条件：
本系统使用220V（土10%）50Hz/60Hz的电源，可在摄氏16〜29度的坏境温度和20-75%的环境湿度卜保持持久运行，可连续使用。
用途：
适用于活体动物（包括：果蝇、蠕虫、斑马鱼、小鼠、大鼠、兔、猫、 猴）大脑皮层深层（400微米）细胞的形态学、生理学研究。
达标本时其脉冲宽度小于150飞秒(以使用APO 63x/Oil NA 1.40物
镜的情况为标准)。
计算机：
主机：PentiumIV3G,Windows XP Professional
-256 MB Video Card
-2GB RAM
-250GB Hard Disk
-2个21英寸液晶显示器
-DVD刻录光驱
显微镜单元：
显微镜镜体：
正置、无底座显微镜，9英寸的物镜下空间。
荧光光源：
EXFO X-CITE120 (120W1500小H株灯)，光 纤导入。
荧光滤块：
1个ET-GFP(FITC/CY2)荧光滤块、和1个
ET-DSRed(TRITC/CY3)荧光滤块。
物镜：
1个OLYMPUS XLUMPLFL20XW NA. 0.95长 工作距离水镜，光通透波长：340nm to> 1100nm；1个OLYMPUS LUMPLFL40XW/IR-2 NA.
TriggerSync漂白解笼锁控制触发软件：在成像的同时，可进行漂白 和解笼锁，使图像采集、多点漂白、解笼锁、和外部电生理记录同步。
（512x512, 1帧/秒）和AOD控制的快扫描 装置（512x512, 25帧/秒）。2种扫描方式可方 便切换。
激光能量控制：
使用Pockels Cell高速（响应时间小于10微秒） 控制激光能量，有效避免双光子激光脉冲展宽和 光斑变形；在图像回扫时关闭激光。
双光子激发荧光显微镜的操作指南
双光子激发荧光显微镜的操作指南引言：双光子激发荧光显微镜是一种先进的显微镜技术，可以在深部组织中实现高分辨率的成像。
本文将介绍双光子激发荧光显微镜的基本原理，以及如何正确操作该设备。
一、双光子激发荧光显微镜的基本原理双光子激发荧光显微镜利用两个红外光子通过非线性光学效应来激发样品中的荧光分子。
相比传统显微镜技术，它具有更大的穿透深度和更低的光伤害。
在进行操作前，我们需要了解设备的组成和原理。
1. 激光系统双光子激发荧光显微镜主要由激光系统、扫描器和探测器组成。
激光系统提供激发光源，通常采用飞秒激光器。
激光器的功率和波长需要根据不同实验需求进行调整。
2. 扫描器扫描器是用于控制光束在样品上的移动和聚焦的设备。
它由一个可调节的镜头和一个透镜组成。
通过调整扫描器的焦距和聚焦位置，可以实现高分辨率的成像。
3. 探测器探测器用于接收和记录荧光信号。
常见的探测器有光电倍增管（PMT）和光电二极管（APD）。
选择合适的探测器可以提高信噪比和灵敏度。
二、操作步骤正确使用双光子激发荧光显微镜需要遵循一系列操作步骤，以确保高质量的成像结果。
1. 样品制备首先，我们需要准备好待观察的样品。
样品必须具有较好的透明性，且荧光染料能与激发光相互作用。
在准备过程中，应注意保持样品的湿润和防止氧化。
2. 设定激发光源根据样品和实验需求，设定合适的激发光功率和波长。
过高的激发功率可能导致样品烧伤，而不足的激发功率可能无法产生荧光信号。
此外，还需注意避免激光直接照射眼睛，应佩戴适当的防护眼镜。
3. 调整扫描参数通过调整扫描器的位置和焦距，找到最佳成像条件。
在调整过程中，应注意避免扫描器和样品之间的碰撞，以防损坏设备或样品。
4. 选择合适的探测器根据实验需求和样品特性，选择合适的探测器。
PMT适用于强信号和较大的动态范围，而APD则具有高灵敏度和快速响应的特点。
5. 开始成像确定好各项参数后，可以开始进行成像。
在成像过程中，需要保持样品的稳定和定位准确，以避免图像模糊和偏移。
双光子显微镜原理
双光子显微镜原理双光子显微镜（Two-photon microscopy，TPM）是一种高分辨率、非侵入性的生物成像技术，被广泛应用于生命科学研究中。
它通过使用荧光标记的活体样品来获取图像，同时具有较深的组织穿透深度和较低的光毒性。
双光子显微镜基于双光子激发过程，它的原理与普通激光共聚焦显微镜（laser-scanning confocal microscopy，LSCM）有很大的不同。
在普通激光显微镜中，使用高能量光子来激发组织中的荧光标记，但这可能会引起细胞热损伤和光毒性。
而在双光子显微镜中，使用两个低能量光子同时激发样品中的荧光染料。
这两个光子的能量之和等于荧光染料分子能级间的能量差。
将两个光子同时聚焦于一个空间点上，光子的能量将被累加起来，从而激发荧光染料分子。
这种激发方式被称为双光子共振激发，只有在光子密度很高的情况下才会发生，因此只在焦点处发生激发，大量的光子不会散射到周围组织中。
这样就能够实现较深的确定性成像和较低的光毒性。
双光子显微镜的主要组成部分包括一个脉冲激光器、物镜、光学透镜和探测器。
脉冲激光器产生高能量脉冲激光，现在一般使用飞秒激光器。
这种激光器的输出光束非常稳定，能够提供高能量、窄脉冲和短脉冲宽度，以确保足够高的光子密度。
光束经过空间滤波后，由强度分束器将光束分为两个通道，一个用于成像，一个用于参考。
在成像通道中，光经过一个扫描镜扫描到样本，然后通过一个物镜成像到探测器上。
在参考通道中，光束通过一个参考物镜成像到探测器，用于校正样品的吸收和散射。
探测器可以是单光子计数器或光电倍增管。
在成像过程中，当荧光标记的分子受到双光子激发后，会发射荧光波长的光子。
这些光子被探测器捕获并转换为电信号，然后通过数据采集和图像处理系统得到最终的图像。
其次，双光子显微镜具有较低的光毒性。
由于激发光密度较低，光子与生物组织的相互作用减少，减少了光诱导损伤。
另外，双光子显微镜具有高空间和时间分辨率。
双光子显微镜有什么作用_双光子显微镜工作原理
双光子显微镜有什么作用_双光子显微镜工作原理双光子显微镜（Two-Photon Microscope）是一种基于非线性光学效应的显微镜技术，它可以实现在活体组织内进行高分辨率的三维成像。
与传统的荧光显微镜相比，双光子显微镜具有更深的成像深度、较小的光损伤以及更高的空间分辨率。
本文将介绍双光子显微镜的工作原理并阐述其在生物医学研究中的应用。
双光子显微镜的工作原理基于双光子激发的非线性过程。
普通的荧光显微镜通过吸收单个光子来激发荧光探针，而双光子显微镜则利用两个光子几乎同时地被样品吸收来激发荧光探针。
这种现象是非常罕见的，因为一般情况下，光与物质的相互作用是线性的。
然而，在双光子显微镜中，通过使用具有高光子能量的激光束，可以在样品焦点处实现局部的高光子浓度。
在这种情况下，两个光子能够被荧光物质几乎同时吸收，从而激发出荧光。
双光子显微镜的光源一般采用飞秒激光器，它具有较高的脉冲功率和较窄的频谱宽度。
激光器发出的激光束通过一组镜片和偏振器被调整成为具有高激光功率和适当偏振方向的光束。
然后，激光束通过束直径调节器，可以根据样品的要求调节束直径。
接下来，光束通过一个物镜，聚焦在样品表面上。
当两个光子被样品吸收时，荧光物质被激发到激发态，然后以荧光的形式发射出来，并由探测器进行检测和记录。
通过逐步移动物镜和探测器的相对位置，可以在样品中获取各个层次和位置的图像。
双光子显微镜在生物医学研究中有广泛的应用。
其最大优点是能够在活体组织中进行三维成像。
传统的显微镜成像深度有限，通常仅限于几百微米的范围内。
而双光子显微镜通过使用长波长激光可以减少光在组织中的散射和吸收，从而实现更深的成像深度。
这使得双光子显微镜成为观察活体组织内结构和功能的理想工具。
双光子显微镜在神经科学、癌症研究、心血管研究等领域都有广泛的应用。
在神经科学中，双光子显微镜可以观察到神经元的形态和连接方式，并研究神经元之间的相互作用。
在癌症研究中，双光子显微镜可以观察到肿瘤细胞的生长和扩散方式，以及肿瘤与周围组织的相互关系。
双光子光场计算显微物镜的制作流程
双光子光场计算显微物镜的制作流程双光子显微镜是一种高解析度显微镜技术，利用两个光子的共振吸收来激发荧光物质，其制作流程通常包括以下几个步骤:1.设计激光系统:首先需要设计一个用于产生高功率、短脉冲的激光系统。
这个激光系统通常包括一个超快脉冲激光器和一个调制器，用于调节和控制激光的脉冲宽度、能量和重复率。
2.确定目标光场:根据需求，确定所需的目标光场。
这可以通过数值计算方法或基于经验的方法来实现。
目标光场需要具备高强度和均匀性，以提供高分辨率的成像能力。
3.制作光学元件:根据目标光场的要求，制作合适的光学元件。
这些元件可能包括透镜、准直器、偏振片等。
这些元件需要精确控制入射光的强度、角度和偏振状态，以确保良好的光场质量和分辨率。
4.激光光束形成:使用适当的光学元件，将所需的光场形成在样品上。
这可能涉及到光束展宽、光束转换和光束对准等步骤，以确保光束的尺寸和形状适合样品的需求。
5.荧光物质选择和标记:选择适合的荧光物质，并将其标记在样品中。
荧光物质的选择应考虑到其吸收和发射波长、亮度和稳定性等因素。
6.双光子显微成像:使用所设计的光学系统，将激光光束聚焦到样品上，激发样品中的荧光物质。
荧光物质通过共振吸收两个光子而发射出荧光信号。
该信号经过探测器的收集和处理，形成高分辨率的成像图像。
7.成像数据处理:对于获得的成像数据进行处理和分析。
这可能包括图像去噪、增强对比度和分析荧光信号的定量等步骤，以获得更准确的信息。
总之，双光子光场计算显微物镜的制作流程主要包括激光系统的设计、光学元件的制作和光束形成、荧光物质的选择和标记、双光子显微成像以及成像数据的处理等步骤。
这些步骤需要精确的设计和控制，以确保获得高分辨率和高质量的显微图像。
双光子显微镜
Confocal
n
白炽灯的原理
电子吸收能量跃迁到高能级
高能级不稳定
高能级电子回到基态，发出光子
单光子吸收与荧光显微镜
荧光分子吸收一个光子跃迁 到高能级
高能级电子回到基态，发出
荧光
多光子效应
高能量的激发光照射荧光分子，荧光分
子短时间内吸收两个光子跃迁到高能级 高能级电子回到基态，发出荧光
提高信噪比
多光子显微镜研究—自适应校正
减少组织散射的影响 提高分辨率
多光子显微镜研究—三光子
多光子显微镜研究—微型化
北京大学程和平院士团队
结论
优势：
大深度（800um） 分辨率比宽场高 微型化、同时刺激和成像等的开发 劣势： 价格昂贵 分辨率比共聚焦低
多光子显微镜
双光子显微镜（Leica）
多光子显微镜优势—高分辨率
双光子显微镜
双光子效应是低概率事件，需要很高的激光
能量，因此只有焦点处会发生 需要采用高能量、短脉冲（防止样品发热、 提高信噪比）的飞秒激光器
宽场显微镜
多光子显微镜优势—高分辨率
未发生双光子效应的区域，不会激发荧光
多光子显微镜优势—大深度
双光子显微镜穿透深度深与双光子 效应无关，而是因为双光子显微镜采 用的是长波长（红外）的激光 因此，三光子激光器的波长更长， 穿透深度更深
多光子显微镜优势—大深度
选择波长应处于组织吸收较少的窗口，一般选择 700-900nm之间
多光子显微镜优势—伪彩色
多波长荧光的叠加
多光子显微镜研究—脉冲压缩
双光子显微镜的独特优势
相关技术指标与进口必要性双光子显微镜的独特优势有以下几点：1）双光子显微镜采用长波长激发，长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本，双光子显微镜的穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍。
对于皮层较深处神经元的活动观察更加全面。
2）焦平面外的荧光分子不被激发，成像的亮度和信噪比高。
更加适合活体下微弱荧光信号的观察。
3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小，比较适合活细胞长时间的动态观察。
4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。
所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。
利用活体双光子显微镜，我们可以对脑科学的几个前沿领域进行更加深入的研究。
利用活体双光子显微镜的光遗传学操作能力，我们可以对某类神经元的激活和失活进行高精度的操作，对这些神经元的特殊功能的进行研究。
在活体水平下，我们可以对皮层在清醒、静息状态下就存在有组织的脑功能活动进行观察，从而加深我们对大脑在内外环境的监测、情节记忆及自我意识方面的理解。
利用活体双光子显微镜的多点光激活能力，我们可以研究多个神经细胞之间的连接和控制，来更好的了解神经信号之间复杂动态的编码过程。
目前国内没有同类产品，其他设备在各个技术层面都无法满足我单位要求，为更好的开展神经学研究，故申请购置此套设备。
主要技术指标：1显微镜1.1适用于活体动物操作的正置显微镜，物镜下自由空间高度＞23 cm；1.2显微镜镜体置于XY电动载物台之上，可通过移动显微镜镜体的方式对样品进行定位和观察；1.3显微镜镜体移动通过软件控制，XY方向行程＞35 mm，步进＜100 nm；1.4配备长寿命落射荧光光源；1.5配备可观察FITC和DsRed的滤色块；1.6配备全角度物镜转盘，物镜可旋转、可倾斜，能够以任何角度垂直接近样品表面；1.7配有放大倍率为4倍,NA＞0.2, WD＞20mm的物镜。
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双光子显微镜/view/1428311.htm?fr=ala0_1双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。
双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。
双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。
这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100 飞秒，而其周期可以达到80 至100 兆赫。
在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。
双光子荧光显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。
所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。
激光共聚焦显微镜在进行生物样品研究工作中还存在很多局限和问题：一是标记染料的光漂白现象。
因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。
光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。
在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。
在传统荧光显微镜中，一个荧光团吸收一个光子，该光子能量对应于荧光团基态和激发态能量之差。
通过一个较短寿命的虚态，也可以通过同时吸收两个较低能量（即更高的波长）的光子激发荧光。
例如，吸收两个红色波长的光子，可以激发一个吸收紫外的分子。
双光子激发是一个非线性过程，对激发光强度有平方依赖关系。
使用单激发光源，双光子具有相同的波长，该技术被称为双光子激发荧光显微术。
如果两个光子具有不同的波长，就称作双色激发荧光显微术。
双光子吸收几率依赖于两个入射光子在空间和时间上的重合程度（两个光子必须在10－18秒内到达）。
双光子吸收截面很小，对若丹明B一般为10－50cm4 s photon－1 molecule －1，这样，只有在具有很大光子流量的区域的荧光团才会被激发。
钛宝石激光器等锁模的，高峰值功率激光可以为双光子激发提供足够的强度。
由于激发强度随到焦平面的距离的平方变化，在z轴方向双光子激发几率随离焦距离的四次方衰减，荧光团激发只发生在焦点内。
用数值孔径为1.25的物镜，激发波长为780纳米，全部激发荧光的80%被局限在焦平面1微米范围内，激发体积大约为0.1-1飞升，与传统荧光显微镜相比，该体积降低了1010倍。
在激光扫描荧光显微术中，双光子激发具有三维层析能力，该三维层析效果可与共焦显微镜相比拟，它还比具有另外两个优势：因为照明光在时间空间上汇聚，没有离焦光漂白；激发光不会被离焦吸收衰减，因而有较大的穿透深度。
双色激发比双光子激发的优势并不在于较高的分辨率，而是在于小目标物经过较大散射媒质后更容易观察。
事实上，与双光子激发比较，双色激发在焦点内荧光散射增加，而干扰背景荧光只有很小增加。
结合多光子荧光技术，多光子共聚焦显微镜（Multiphoton Excitation－MPE）的发展成功的解决了传统共聚焦显微镜（单光子共聚焦显微镜）所存在的问题，MPE的激光源是超快激光器（多为钛宝石激光器，可以达到皮秒或者飞秒级的扫描速度），具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。
多光子的吸收现象是非线性效应，只发生在聚焦焦点处，不需要共聚焦孔径光阑滤光，从而大大提高成像亮度和信噪比。
在传统激光共聚焦显微镜中，光通过出的所有样品都被激发，所以必须用孔径光阑来选取焦点处样品发出的荧光。
孔径光阑不仅遮挡了焦点以外样品发出的荧光，而且也遮挡了焦点处散射和漫反射的荧光。
在MPE中，焦点处发出的所有荧光，包括散射和漫反射的荧光都可以被收集并探测到。
并且由于多光子实验所用的激发光的波长较长，激发光的散射损失很小，轴向分辨率更高，样品的穿透能力更强。
生物分子光子学转自香山科学会议网--------------------------------------------------------------------------------香山科学会议第217次学术讨论会综述光子学技术在研究基因表达、蛋白质—蛋白质相互作用、疾病早期诊断、新药研究、药效评价等方面正在或将会发生重要作用。
随着激光技术、光谱技术、显微技术、计算机技术以及荧光标记技术的飞速发展，结合多个学科，探索光子学技术在生物分子研究及医学诊断与治疗中的应用，已成为国际上迅速发展的领域。
以“生物分子光子学”为主题的香山科学会议第217次学术讨论会于2003年11月5～7日在武汉华中科技大学举行。
华中科技大学骆清铭教授和武汉大学庞代文教授担任执行主席。
会议中心议题为：生物分子光学标记技术、生物分子间相互作用的光学成像、生物分子光学成像新技术与三维可视化、在体光学成像等。
来自全国22家单位的36位专家学者参加了此次学术讨论会。
骆清铭作了“生物分子光子学”的主题评述报告。
指出由于光子具有极高的信息容量和效率、极快的响应能力、极强的互连能力与并行能力、极大的存储能力，以及对检测样品的无损伤等优点，光子技术在生命学科中的应用已成为国际上迅速发展的领域。
蛋白质—蛋白质相互作用是现代生命科学研究的重大科学问题之一，因为这些相互作用不仅控制着基因转录、细胞分裂和细胞增殖，同时还介导细胞坏死过程中的信号转导、致癌转化和调整等。
传统研究方法虽然取得了非常重要的研究成果，但还不足以解释生命活动的基本规律，因此非常有必要发展一种能对蛋白质—蛋白质相互作用进行在体无损成像的研究方法。
他还介绍了目前国际同行对动物活体内基因表达与蛋白质—蛋白质相互作用的在体光学成像领域的研究。
他认为此项研究工作在国际上刚刚开始起步，其主要涉及报告基因标记技术和微型正电子发射断层成像与光学成像检测技术。
最新的研究表明，采用报告基因的互补与重组策略，可很好地实现动物活体内基因表达与蛋白质—蛋白质相互作用的无损在体光学成像监测。
他还对活细胞内基因表达与分子间相互作用动力学过程的实时在体光学成像的各项技术进行了评述，并对各项技术的可能应用进行了展望。
一、生物分子光学标记技术王柯敏教授作了“基于生物纳米颗粒和分子信标的荧光识别方法”的中心议题报告。
他指出，人们对生命现象的观察和研究已深入到单细胞、单分子和核酸的单个碱基这样的层次。
为了更加准确地研究生物分子间的相互作用以及重大疾病的早期诊断，迫切需要在更加微观的尺度（纳米尺度和单分子水平）上原位、活体、实时地获取各种生物化学信息。
这对现有许多传统的、常规的分子生物学方法与手段是极大的挑战。
光学标记技术与光学成像技术在研究基因表达以及蛋白质—蛋白质相互作用的过程中，为获取及利用各种生物化学信息提供了革命性的手段。
他还指出，合成各种尺寸的荧光纳米颗粒和荧光量子点纳米颗粒，通过表面修饰的方法使其表面具有生物活性与生物靶向性，利用纳米颗粒显著放大信号的优势，将其用于活体细胞和动物器官的基因表达和蛋白质实时在体光学成像研究；建立核酸切割过程、核酸磷酸化过程以及核酸连接过程的荧光监测方法，实现核酸—蛋白质相互作用的实时监测等，可望在生命活动的基本规律研究方面发挥重要作用。
庞代文教授在“纳米标记”专题发言中，介绍了一种简便、安全、高效、廉价的核/壳型量子点的合成新方法，可大量制备性能优良的CdSe/CdS和CdSe/ZnS等II-VI核/壳型量子点。
该方法操作安全、简便、重复性好、价格低廉，为大规模工业化生产核/壳型量子点奠定了基础。
他们研制出具有生物分子（或特异细胞）识别（靶向）功能、荧光示踪功能、可操纵功能的多功能生物医用新材料并初步实现了癌细胞的靶向可视化富集抓取；研制出基于纳米金标记放大技术的电化学DNA传感器，提出“多级三维双放大” 概念；研制出基于纳米标记放大技术的目视化基因诊断芯片，实现基因检测的直接目视化等。
赵元弟教授在“纳米生物光子学”的专题发言中，介绍了国际上一门新兴的交叉学科，即结合纳米技术用于生物体系的光子学研究的纳米生物光子学。
认为它应包括两个层次的研究，一是在纳米尺度上研究生物问题的光子学，包括纳米分辨光学显微成像技术、及光学纳米操纵与检测技术、以及光学纳米操纵与检测；二是纳米光学技术在生物学中的应用，如荧光共振能量转移(FRET)、分子信标和纳米荧光探针等。
针对纳米荧光探针，他以量子点为例，按分子、细胞、组织和在体等层次介绍了其在生物分子光子学中的应用，并指出，以量子点的生物功能光学成像研究为代表的纳米生物光子学研究将是其实验室下阶段的主要研究方向。
黄振立博士在“高通量药物筛选中的光子学技术”专题发言中，介绍了国内外高通量药物筛选的研究现状、高通量药物筛选在创新药物发展中的作用、高通量药物筛选中的各种光子学编码技术以及高通量药物筛选中用于评价药效的光子学方法等。
他指出发展/研制具有我国自主知识产权的、用于高通量药物筛选的光学系统是现阶段我国创新药物开发研究的迫切要求，这一点应受到国内同行的格外重视。
姚祝军教授在“蛋白质标记和细胞生物学研究”的发言中，指出传统影像学与生物分子影像学的区别在于，一个是“群体和平均行为”，一个是“单个分子和几个分子”水平；一个是“结果”，一个是“过程”；一个是“推测可能的机理”，一个是“清楚认识机理”。
他指出：生物分子影像学的研究领域包括信号传导、基因转录、代谢运输、细胞生长、蛋白质构象变化与功能调节等；小分子有机物标记具有许多优点，如分子量小，透膜性质好，“可药性”强，结构可以优化，性质稳定、对研究对象干扰小等；小分子标签对蛋白质的体内标记可通过基于自剪接多肽(instein)的对蛋白质的小分子标签、第三者的蛋白质专一性小分子标签、可逆且专一的蛋白质标签和共价键专一且不可逆的小分子标签等四种方式实现。
讨论中，大家一致认为，光学标记技术是生物分子光子学的重要基础，它在研究基因表达、蛋白质—蛋白质相互作用、疾病早期诊断、新药研究、药效评价等方面正在发生重要作用。