管碟法抗生素效价测量实验
抗生素效价计算过程
USP Cylinder-plate assay 美国药典 管碟法---（标准曲线法）1、 美国药典规定的管碟法抗生素效价方法简述：首先制备5个标准溶液浓度（U/ml ），分别为S1、S2、S3、S4和S5，其中S3为中间浓度。
除S3外的每个浓度准备3个碟子，每个碟子放置6个牛津杯，其中不相连的三个分别加入Si （i 为1、2、4或5），另外三个不相连的加入S3。
待检样品（Unknown ）加样方式如Si ，具体放置方法如下图1：图1：标准及样品管碟放置方式图例2、在以上方法的基础上以具体数据进行计算举例： 下表2为按以上方法进行抗生素效价检测的一组测量结果：表2：抗生素效价检测测量结果表Replicate1Replicate2Replicate3Set S1 Set S2 Set S4 Set S5 Sample U1备注：Zone1、3、5表示每个平皿中不相连的三个S3的直径值；Zone2、4、6表示每个平皿中不相连的三个Si的直径值；U1表示待测样品1。
2.1 进行初始计算：对于每种浓度的三个平板，分别求出得到的9个中间浓度标准品的平均值以及9 个Si和U1直径的平均值。
例如：15.867=（16.1,15.6,15.8,16.0……15.8）9个数据的平均值14.167=（14.6,14.1,13.5,14.5……14.1）9个数据的平均值2.2 变异性的适用性检查：然后求出每三个平板得到的9个数值的标准偏差（包括标准对照和样品的），进而计算出其相对标准偏差值（RSD，该值应不超过10%）。
例如：标准偏差0.200 = s(16.1, . . ., 15.8)相对标准偏差1.3% = (0.200/15.867) *1002.3 进行平板间的差异校正：计算公式如下。
X C = X S– (X R– P)X C = 标准品平均值的校正值X S = 原始的标准品的平均值X R = 对照值的平均值P = 校正值例如：14.022 = 14.167 – (15.867 – 15.722) = 14.167 – 0.1452.4 建立标准曲线：标准曲线由2.3计算的标准品平均值的校正值Xc和标准品浓度值的对数值构成。
抗生素的生物效价测定法(管碟法)
抗生素的生物效价测定法(管碟法)work Information Technology Company.2020YEAR抗生素的生物效价测定法测定抗生素效价的方法比较多，一般可以分为物理学方法、化学方法、生物学方法、和两种方法配合等四大类，可根据具体情况选择使用。
生物学方法以抗生素的杀菌力作为衡量效价的标准，其原理恰好和临床应用于的要求一致这是它的优点；又其灵敏度较高，需用检品的量较小，也是其它方法所不及的。
抗生素的生物效价测定法，常用的有稀释法、比浊法和扩散法（或称渗透法）。
稀释法这一方法是用培养基将检品抗生素稀释到各种浓度，并依次分装到一系列的容器内，再加入等量“试验菌种”菌种菌液，并放在37 ℃保温箱内培养一定时间，观察何种稀释度适能抑制细菌的生长，该稀释度即为测定终点（或以细菌生长所引起的PH改变及溶血现象等生化反应作为测定终点），再与同样处理的标准抗生素的终点作比较，即可求得检品的效价。
这种方法可以使用液体培养基，也可以使用固体培养基。
所用的材料及培养基都必须严格无菌，并要注意无菌操作。
由于测定终点是以有无细菌生长来判断的，因此所得结果公是一个范围。
比浊法原理及操作大致与稀释法相同。
比浊法也是将不同量的检品及标准品分别加入培养基中，观察其对“试验菌种”的效应——即细菌生长所引起的混浊。
这一方法和稀释法的区别有二：a.比浊法的稀释间隔的密度比较近，准确度高一些；b.比浊法不以细菌有无生长的区分为终点，而是将标准品浓度和细菌生长所引起的混浊度求得一定的比例，再由检品的细菌生长混浊度推算检品的效价。
这一方法易受杂质的影响，并且不适用于有色或混浊的检品。
扩散法使用固体培养基，在培养基凝固以前将“试验菌种”混合进去，在这样备妥的培养表面，可以用种种设计使检品液或含有抗生素的物质与有菌种的培养基接触。
经过培育后，由于抗生素向培养基中扩散，凡抑菌浓度所能达到之下细菌不能生长因而形成透明的抑菌范围，此种范围一般都呈圆形，称为“抑菌圈”。
抗生素效价
用管碟法（2.2）法，测定链霉素活菌剂的效价，估计效价为1 000 000 u/g，供试品最终浓度为1.4u/ml 及0.7u/ml。
链霉素的效价测定抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效性）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
第一法管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液的制备枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液取枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。
用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)悬液取短小芽孢杆菌［CMCC(B)63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面,用培养基Ⅲ或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）悬液取大肠杆菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
管碟法测定抗生素
管碟法测定抗生素
总结与展望
管碟法是一种经典的抗生素效价测定方法，具有操作简 便、直观等优点，广泛应用于药物研发、生产和质量控 制等领域。然而，随着科学技术的不断进步和新药的不 断涌现，管碟法也面临着一些挑战和改进的空间。未来 ，可以通过改进实验条件、优化操作流程和提高数据分 析能力等方式，进一步提高管碟法的准确性和可靠性， 为抗生素的研究和应用提供更加准确可靠的依据
操作规范：实验过程中应严格遵守无菌操作规范， 避免杂菌污染干扰 数据分析：在数据分析过程中，应采用适当的统计 方法对实验数据进行处理和分析，以获得准确可靠 的实验结果
管碟法测定抗生素
管碟法测定抗生素的优缺点
优点：(1)操作简便、直观，可快速获得实验结果； (2)适用于多种抗生素的效价测定，具有较好的通用 性；(3)可同时比较不同抗生素的ຫໍສະໝຸດ 菌效果，方便进 行药物筛选和质量控制
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管碟法测定抗生素
A
管碟法是一种常用的抗生素效价测
定方法，其原理是将抗生素溶液置
于含有敏感菌的培养基中，通过测
定抗生素的抑菌圈大小来确定其效
价
B
下面将对管碟法测定抗生素的步骤 、注意事项和优缺点进行详细介绍
管碟法测定抗生素
管碟法测定抗生素的步骤
培养基制备：将基础培养基加热溶解，灭菌后冷却至50℃左右，加入适量敏感菌悬液 ，摇匀后倒入无菌培养皿中，待凝固后备用 抗生素溶液制备：将待测抗生素溶解于适宜溶剂中，制备成不同浓度的溶液 放置管碟：在培养皿上放置无菌管碟，轻轻按压使管底与培养基紧密接触 滴加抗生素溶液：用微量移液器将不同浓度的抗生素溶液滴加到管碟上，每个浓度至 少做3个平行试验 培养：将培养皿放入恒温培养箱中培养一定时间(一般为16-24小时)，使敏感菌在培养 基上生长
管碟法测定抗生素效价详解
管碟法的操作步骤
预试验→试验准备→ 双碟底层的制备→
供试品、标准品溶液的制备→菌层的制备
→滴加抗生素溶液→双碟的培养→ 抑菌圈
的测量→结果的可靠性检验及效价测定
• 预试验：
确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、 使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑 菌圈的大小符合规定：高剂量浓度溶液所 致的抑菌圈直径在18～22mm。高剂量与 低剂量的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。 高低剂量之比为2:1（如高、低剂量所致的 抑菌圈差别较小时，可用4:1的剂量比率）。
• 试验准备： 双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭 菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、 缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
• 供试品、标准品溶液的制备： 估计供试品的效价，根据试验要求设计供 试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供 试品、标准品相关剂量的溶液。
1. 称量 称量前，将标准品从冰箱取出，使与温室平衡； 供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。供试品与标准品 应用同一天平；吸湿性较强的抗生素，在称量前1～2 ｈ更换 天平内干燥剂。标准品与供试品的称量最好一次取样称取， 不得将已取出的标准品或供试品倒回原容器内，标准品称量 不可少于 20mg，取样后立即将称量瓶及被称物盖好，以免吸 水。样品的称样量最好不少于50mg。
一、试验前准备
• 双碟的挑选
内径约90mm，硬质玻璃或 塑料培养平皿，水平透明， 无色斑气泡
• 物品的清洗、灭菌
培养皿、钢管、刻度吸管清 洗后160℃干热灭菌2小时或 121℃高压蒸汽灭菌30min， 放置室温备用；陶瓷瓦盖要 定期清洗干燥。
牛津杯的挑选
内径（6.0±0.1）mm，高 （10.0±0.1）mm，外径 （7.8±0.1）菌的来源：检定菌种由中监所所提 供的冷冻干燥品。 检定菌的传代和接种： 芽胞杆菌3～6个月（其他细菌每个月） 用普通琼脂斜面传代1次，将新传代的培养物 代替原有的菌种，作为工作用（阳性对照）菌 种。传代和接种在菌种接种室内按无菌操作要 求进行。
管碟法测定抗生素效价
• 抑菌圈的测量：
将培养好的双碟取出，打开陶瓦盖，将钢 管倒入1：1000新洁尔灭溶液或其他消毒液 内浸泡，检查抑菌圈是否圆整，如有破圈 或不圆整圈应将碟弃去，切忌主观挑选抑 菌圈和双碟，是结果造成偏离。
抑菌圈测量仪的使用：每组试验双碟应在 相同的测量参数下进行测量。
• 结果的可靠性检验及效价测定：
冷冻菌种安瓶的接种。
•
用75%酒精棉擦净菌种安瓿的外壁，
稍干。 点燃酒精灯，将安瓿的封口，一端
在火焰上烧灼红热用毛细管吸取灭菌水少许
在灼热处，使其骤冷而炸裂，另取1支灭菌
毛细滴管，在火焰旁吸取少量灭菌水，加至
菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随
即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面，
将营养琼脂斜面琼脂斜面于37℃恒温培养24
一、试验前准备
• 双碟的挑选
内径约90mm，硬质玻璃或 塑料培养平皿，水平透明， 无色斑气泡
• 物品的清洗、灭菌
培养皿、钢管、刻度吸管清 洗后160℃干热灭菌2小时或 121℃高压蒸汽灭菌30min， 放置室温备用；陶瓷瓦盖要 定期清洗干燥。
牛津杯的挑选
内径（6.0±0.1）mm，高 （10.0±0.1）mm，外径 （7.8±0.1）mm，重量差异不超 过±0.01g，光洁平坦
小时。
管碟法的操作步骤
预试验→试验准备→ 双碟底层的制备→ 供试品、标准品溶液的制备→菌层的制备 →滴加抗生素溶液→双碟的培养→ 抑菌圈 的测量→结果的可靠性检验及效价测定
• 预试验：
确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、 使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑 菌圈的大小符合规定：高剂量浓度溶液所 致的抑菌圈直径在18～22mm。高剂量与 低剂量的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。
管碟法
管碟法测定生物效价
衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。
抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。
抗生素生物检定法是利用抗生素对细菌（或真菌）的杀死或抑制的程度，作为客观指标来衡量维生素中有效成分的效力的一种方法。
此法检测灵敏性高，由微量抗生素即可检出（0.5u/ml）。
因此，微生物检定法被作测定抗生素效价的一种经典方法。
生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。
管碟法是扩散法的一种。
本实验采用管碟法测定抗生素的效价。
管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管（牛津杯），将抗生素溶液装满小杯，在含有敏感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量(单位)、抗生素的扩散系数(cm2/h)、扩散时间(即抗生素溶液注入钢管至出现抑菌圈所需的时间)、培养基的厚度(mm)和最低抑菌浓度(u/ml)等因素有关。
抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。
因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。
将已知效价的土霉素标准液先制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检品溶液的抑菌圈的大小，就可算出样品中抗生素的效价。
管碟法测定抗生素效价
管碟法测定抗生素效价（四环素类）一、目的和要求1、了解管碟法的原理。
2、掌握二剂量法测定抗生素效价单位的技术和计算方法。
二、原理抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。
管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。
当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。
三、实验材料1、四环素类抗生素的标准品和样品。
2、试验菌：藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）。
3、培养基：250ml三角瓶分装150ml LB琼脂，150ml三角瓶分装50ml LB琼脂，50ml三角瓶分装20ml藤黄八叠球菌悬液用培养液。
4、灭菌物品：培养皿，牛津杯（内径：6.0±0.1mm，外径：7.8±0.1mm，高度：10.0±0.1mm），滴管，1ml吸管，pH6.0的磷酸缓冲液，弯头镊子，15×150mm试管，瓦盖。
5、其它：分析天平，容量瓶，玻璃板，水平仪，游标卡尺。
四、实验实施1、配制标准品溶液2、配制样品溶液3、制备菌悬液。
4、制备平板：（1）取6套无菌培养皿，分别加入约20mlLB培养基后，置水平玻璃板上凝固，作为底层。
（2）另取冷却至50℃左右的50ml LB培养基，加入1ml试验菌悬液，迅速摇匀后，用10ml破口吸管取6ml混菌培养基倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。
5、在培养基平板底部作好相应标记，用弯头镊子在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯。
6、用滴管分别将高、低浓度的标准品和样品溶液加入到牛津杯中，以滴满为度，换上皿盖。
7、将培养皿平稳送入恒温箱，37℃下培养16～18h。
抗生素生物效价测定详细参考
---一参照秘斗一一页眉页脚可删除一一实验一抗生素生物效价测定【实验目的】1.掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；2.掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。
【实验原理】抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。
管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。
管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。
管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于乂集（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。
后二法已经列入药典。
二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。
取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。
先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。
（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）（式 2.10-1）V=（UH+UL）-（SH+SL）（式2.10-2）式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；（2）求出① 0=D-antilog（IV/W）（式 2.10-3）式中：。
微生物管蝶法测定硫酸新霉素效价试验方案(2)
微生物管蝶法测定硫酸新霉素效价试验方案一、实验目的对硫酸新霉素效价含量进行抗生素微生物管蝶法测定。
二、实验材料实验材料：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003或CVCC1882]、新霉素标准品(130309-200811，效价645 U /mg)，由中国药品生物制品检定所提供、双碟、钢管、毛细滴管、吸管、容量瓶、定量吸管。
仪器：培养箱、pH计、十万分之一天平、高压灭菌锅、游标卡尺。
试剂：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾，抗生素检定培养基II号、氯化钠。
样品：4批原料和4批可溶性粉三、实验内容3.1金黄色葡萄球菌菌悬液的制备取金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35~37℃培养20~22h。
临用时，用0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，制成金黄色葡萄球菌菌悬液，备用。
3.2 II号培养基的制备胨6g 牛肉浸出粉 1.5g酵母浸出粉6g 葡萄糖1g琼脂15~20g 水1000ml除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2~0.4；加入琼脂，加热融化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.8~8.0，在115℃灭菌30分钟。
3.3 pH 7.8磷酸盐缓冲液的制备取磷酸氢二钾(K2HP04·3H20)5.59 g，磷酸二氢钾(KH2P04)0.41g，3%氯化钠，溶于1000ml水，灭菌，即得。
3.4预实验确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定。
二剂量法用于抗生素药品效价的常规测定，所以用二剂量法的高剂量浓度溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm。
高剂量与低剂量的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。
高低剂量之比为2:1（如高、低剂量所致的抑菌圈差别较小时，可用4:1的剂量比率）。
3.5抗生素溶液的配制标准品溶液的制备：标准品的使用和保存，应按照标准品说明书规定，临用新制，参照《兽药典》抗生素微生物检定管蝶法设计表中规定的抗生素浓度范围4.0~25.0单位/ml进行稀释。
抗生素生物效价测定
实验一抗生素生物效价测定【实验目的】1. 掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；2. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。
【实验原理】抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。
管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。
管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。
管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。
后二法已经列入药典。
二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。
取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。
先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。
（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）(式 2.10-1)V=（UH+UL）-（SH+SL）(式2.10-2)式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；（2）求出θ：θ=D·antilog（IV/W）(式2.10-3)式中：θ：供试品和标准品的效价比；D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1；I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。
抗生素效价测定实训报告
一、实训目的1. 掌握抗生素效价测定的原理和方法。
2. 熟悉管碟法测定抗生素生物效价的相关操作步骤。
3. 提高实验操作技能和数据分析能力。
二、实训时间2023年11月X日三、实训地点实验室四、实训内容本次实训采用管碟法测定抗生素的生物效价，以青霉素为例进行实验。
五、实验原理抗生素的效价是指在一定条件下，抗生素对特定微生物的抑制作用。
抗生素效价测定通常采用微生物学方法，其中管碟法是目前国际上通用的方法。
管碟法的基本原理是：在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管，管内放入标准品和检品的溶液，经过恒温培养后，抗生素在菌层培养基中扩散，形成抑菌圈。
抑菌圈的大小与抗生素的浓度呈线性关系，通过比较标准品和检品的抑菌圈大小，可以计算出抗生素的效价。
六、实验步骤1. 准备工作- 准备实验所需材料：无菌平板、牛津杯、青霉素标准品、青霉素样品、产黄青霉、琼脂、生理盐水等。
- 将青霉素标准品和样品分别稀释成不同浓度的溶液。
2. 制备琼脂平板- 将产黄青霉接种于琼脂平板，培养至适宜的生长状态。
3. 放置牛津杯- 在琼脂平板上均匀放置牛津杯，每个平板放置4个。
4. 加入溶液- 在牛津杯中分别加入不同浓度的青霉素标准品溶液和样品溶液。
5. 培养- 将平板放入恒温培养箱中，培养16-18小时。
6. 观察和测量- 观察抑菌圈的形成情况，测量抑菌圈的直径。
7. 数据处理- 根据抑菌圈直径，计算青霉素标准品和样品的效价。
七、实验结果与分析1. 实验结果- 青霉素标准品在不同浓度下，抑菌圈直径与浓度呈线性关系。
- 青霉素样品在不同浓度下，抑菌圈直径与浓度呈线性关系。
2. 数据分析- 通过比较青霉素标准品和样品的抑菌圈直径，可以计算出青霉素样品的效价。
八、实验总结1. 通过本次实训，掌握了抗生素效价测定的原理和方法，熟悉了管碟法测定抗生素生物效价的相关操作步骤。
2. 提高了实验操作技能和数据分析能力，为今后的科研工作打下了基础。
抗生素生物效价测定(详细参考)
实验一抗生素生物效价测定【实验目的】1. 掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；2. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。
【实验原理】抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。
管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。
管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。
管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。
后二法已经列入药典。
二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。
取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。
先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。
（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）(式 2.10-1)V=（UH+UL）-（SH+SL）(式2.10-2)式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；（2）求出θ：θ=D·antilog（IV/W）(式2.10-3)式中：θ：供试品和标准品的效价比；D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1；I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。
抗生素生物效价测定
实验一抗生素生物效价测定【实验目的】1. 掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；2. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。
【实验原理】抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。
管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。
管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。
管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。
后二法已经列入药典。
二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。
取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。
先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。
（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）(式 2.10-1)V=（UH+UL）-（SH+SL）(式2.10-2)式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；（2）求出θ：θ=D·antilog（IV/W）(式2.10-3)式中：θ：供试品和标准品的效价比；D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1；I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。
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管碟法抗生素效价测量实验
抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。
管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。
当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于mic（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。
实验简介
在管碟法抗生素效价测量实验中需要注意的影响因素分析及对策如下:
管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。
但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。
根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。
实验器材的准备
1.1 实验器材的选择
试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。
可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。
小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。
如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。
1.2 实验器材的清洗
抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。
由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素(庆大霉素、争光霉素、链霉素等)或者被清洗用的杀菌剂(如新洁而灭、洗洁精、去污粉等)污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。
因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。
160℃干热灭菌2h后备用。
配制试验所需的样品及药品
2.1 样品与标准品溶液的配制
标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。
供试品应放于干燥器内至少
30min方可称取。
称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。
标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平，样品称量不得低于1/10,000克的分析天平。
天平中的干燥剂应保持经常注意更换。
称量结束后，加入超声波处理后的磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并稀释。
稀释时，都应采用容量瓶，每一步稀释取样量不得少于2mL。
用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀释液冲洗吸管2,3次，吸取溶液后，要用滤纸把刻度吸管外壁多余液体擦去，再从起始刻度开始放溶液。
把稀释后的抗生素溶液分装至干燥灭菌试管待用。
在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。
所以配制抗生素溶液应单独使用一套工作服。
2.2 培养基与缓冲液的配制
配制培养基与缓冲液时要按照文献的配比用量，配制后调节其pH值。
因为在pH值、盐浓度的影响下，即使琼脂培养基上的两个相邻的小管距离足够，还是可能会出现卵圆形抑菌圈。
例如四环素易受pH值影响，链霉素易受盐浓度影响[2]。
培养基可以购买厂家生产的产品，因为大批量产品中的成分配比较稳定，可比性较强。
116℃湿热灭菌20min后备用。
加注培养基
3.1 加注底层培养基
无菌室工作台面可能因为使用时间已久，变得凹凸不平或者倾斜，会影响培养基菌层的厚度均匀性。
菌层越薄，形成的抑菌圈越大，会给试验造成很大的误差。
我们可以在桌面上放置一块足够大的玻璃平板，保证双碟放置区域的平整。
在双碟底部预先标记样品的高低浓度区域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。
接下来加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。
这样，即使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上铺开，达到消除误差的目的。
试验中加注的培养基如果温度太低，就容易在内部结块，或者加注到双碟之后不能及时铺开，使得培养基表面为非水平面，会给试验带来误差。
加注60,80?的培养基底层之后，不应立即给双碟加盖。
因为温度过高的培养基会形成大量的水蒸气，在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层上，会给培养基菌层的加注带来影响。
3.2 加注培养基菌层
制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或者受热时间太长都会导致试验菌死亡。
当菌种为非芽孢杆菌的时候，现象尤为明显，甚至会出现无菌生长。
因此，培养基应放在50℃水浴中保温。
当加入试验菌种混匀后，应尽快加注到底层培养基上。
在试验的时候，如果从大瓶内用刻度吸管吸取带菌培养基，吸管中培养基量少极易冷却，加在底层培养基上就不易均匀铺开，导致菌层厚度不均，影响到抑菌圈的直径。
因此可以事先把配制好的培养基分装在具塞试管内，每管5mL，湿热灭菌后放在50℃水浴锅内保温。
试验中，再分别加入菌液混匀，配制成带菌琼脂。
震
荡混匀后继续保温5min使培养基温度回升，然后直接倒在底层培养基上，转动双碟使培养基均匀铺开。
放置小钢管
放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否则会引起相邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。
管与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面，会影响抑菌圈的形状。
可在试验前在双碟的底上用尺测量，作好标记，试验中可以按照双碟底面标记放置小钢管，避免放置位置不恰当产生的问题。
小钢管放置时，要小心地从同一高度垂直放在菌层培养基上，不得下陷，不得倾斜，不能用悬空往下掉的方法。
放置之后，不能随意移动，要静置5min，使之在琼脂内稍下沉降稳定后，再开始滴加抗生素溶液。
滴加抗生素溶液
滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL(二剂量法)或者SH→TH→SM→TM→SL→TL(三剂量法)的顺序滴加[3]。
滴加之前，滴管至少要用被滴液体冲洗3次。
在滴加抗生素到小钢管的时候，由于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，继续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基表面造成破圈。
因此一旦毛细管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，毛细管口应避免太细，滴加的时候离开小钢管口距离不要太高。
滴加中若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破圈。
在滴加中还有可能出现抗生素溶液滴入小钢管后，没有与琼脂培养基菌层接触，有一段空气被压在溶液与培养基之间，这样是不会产生抑菌圈的。
此时可以小心的用滴管吸出小钢管内的抗生素溶液，弃去。
换滴管重新滴加。
抗生素溶液滴加后，液面应该与小钢管管口齐平，液面反光呈黑色。
(抗生素液体加入量不能按滴计算，即使同一滴管，每滴的量也有差异。
)如果抗生素溶液滴加过满，可以用无菌滤纸片小心吸去多余部分。
双碟中菌株的培养
滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。
在搬运到培养箱的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。
双碟在37℃下培养约16h。
时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素的敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。
在培养过程中，如果温度不均匀(过于接近热源)，会造成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。
所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放也不能超过3个。
培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。
应经常注意温度，防止意外过冷过热。
抑菌圈测量
7.1 试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在18,22mm的菌液浓度为试验用浓度(菌液浓度约为106个/mL)。
批量试验中后期，菌液保存的时间过久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。
如若菌株不纯，也会造成这样的结果。
因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。
7.2 用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下测量。
不宜取去小钢管再测量，因为小钢管中残余的抗生素溶液会流出扩散，使抑菌圈变得模糊。
不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。
记录测量结果后进行效价计算。