羊软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定

羊软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定
作者：肖旭，石文达，姚青，陈虎，王基云，李晓兵，高岭
【摘要】目的从羊肋软骨中提取纯化Ⅱ型胶原蛋白，并对其进行鉴定。

方法选择羊肋软骨为原料经脱脂、脱钙后，用盐酸胍去除蛋白多糖，经胃蛋白酶消化、氯化钠盐析等步骤，提取纯化蛋白，然后进行鉴定。

结果 4mol/L盐酸胍能有效去除蛋白多糖，用胃蛋白酶的限制性酶解结果满意；氯化钠盐析浓度为3mol/L时最佳。

SDS-PAGE 电泳结果显示提取纯化的蛋白与Sigma公司的Ⅱ型胶原蛋白一致。

Ⅱ型胶原蛋白最大吸收峰为212 nm。

结论从羊肋软骨提取的Ⅱ型胶原蛋白纯度高，且符合II型胶原蛋白的特征。

【关键词】Ⅱ型胶原蛋白；软骨；蛋白多糖
Abstract: Objective To isolate and purify collagen type Ⅱ(CⅡ) from Sheep cartilage and to identify its purity. Methods The Sheep cartilages were collected as raw materials. After degreasing and decalcification, Guanidine hydrochloride was used to remove the proteoglycans. The digestion of pepsin, salting of sodium chloride were performed for extracting CⅡand identification. Results The proteoglycans could be efficiently removed by 4mol?L 1 guanidine hydrochloride. The results were obtained by limited enzyme digestion of pepsin added. The optimizing concentration of sodium chloride for salting CⅡwas 3mol?L 1. It was found that the protein and Sigma
CⅡ were at the same location by SDS PAGE. The absorption peak was at 212nm. Conclusion The CⅡ isolated from Sheep cartilage has high purity and accords with the characteristics of Collagen typeⅡ.
Key words: collagen typeⅡ; cartilage; proteoglycans
Ⅱ型胶原蛋白(collagen typeⅡ，CⅡ)是软骨基质的主要有机成分，是关节软骨中主要的细胞外间质之一。

近年来研究表明，类风湿性关节炎的发病与CⅡ自身免疫反应有关［1-3］，口服CⅡ诱导免疫耐受对类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)有显著的疗效［4］。

对于胶原蛋白的提取目前所报道的方法，操作复杂，条件不一，结果存在很大的差别［5-8］。

本研究选择宁夏富有的绵羯羊肋软骨为原料，来制备较高纯度的Ⅱ型胶原，报告如下。

1 实验材料和方法
1. 1 主要试剂和耗材
胃蛋白酶(Amresco 公司)；盐酸胍（Amresco 公司）；牛Ⅱ型胶原蛋白参照品(C7806 Sigma公司)；46～200 kD蛋白质分子量标志物(宝生物工程有限公司)，阴离子交换载体(DEAE32 上海试剂二厂)，透析袋（德国 Serca Feinbiochemica公司），余试剂均为国产分析纯。

1. 2 主要仪器
电泳仪(Bio-Rad公司)；凝胶全自动图像分析系统(Bio-Ra公司)；冷冻离心机(日立公司 CF16RX)；酸度计(梅特勒-托利多仪器有限公司)；电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；721分光光度计
(Varian公司)；LL-3000型冷冻干燥机（Thermo Electron Corporation）。

1.3 方法
1.3.1 胶原蛋白的提取
从新鲜的羊肋软骨中切取透明软骨，剥去骨膜，去除骨化部分，用生理盐水洗净，切成0.5mm左右的薄片，液氮冷冻粉碎后称重，按照软骨量加入5倍体积的脱脂液(氯仿∶甲醇∶水=1∶2∶0.8)在4℃下搅拌脱脂48h，期间每8h更换脱脂液直到脱脂完全，在同样温度和搅拌条件下用10倍体积的0.lmol/L盐酸进行脱钙处理48h，直到软骨变柔软，离心去除脱钙液，按照每克软骨加入10倍体积的4mol/L盐酸胍，于4℃搅拌48h，12000g离心20 min，沉淀用Tris-HCl （pH7.4）缓冲液和0.5mol/L乙酸充分洗涤后，用5倍体积的胃蛋白酶消化液(0.5mol/L乙酸配成1g/L)混悬，4℃下搅拌24h，12000g离心30 min，收集上清液；沉淀再加5倍体积的胃蛋白酶消化液重复酶解一次，离心收集上清液。

混合两次上清液，用5 mol/L NaOH迅速调节上清液至pH 7.4。

加入氯化钠（NaCl）使其浓度为3 mol/L，4℃盐析过夜，离心得到上清液和沉淀A1。

调NaCl浓度至4 mol/L时，4℃盐析过夜，离心得到上清液和沉淀A2。

取沉淀A1用0.1mol/L乙酸溶解，2mol/L NaOH中和至pH 7.4，分别再用0.05mol/L Tris-HCl(pH 7.
4)、蒸馏水进行透析平衡后，即得胶原初提液S1。

1.3.2 阴离子交换树脂(DEAE32)的预处理
DEAE-32经过溶胀、酸处理、碱处理后，用去离子水平衡至
中性，处理好的离子交换载体置于4℃冰箱冷却备用。

1.3.3 蛋白批量离子交换
将蛋白初提液S1和3倍体积的Tris-HCl（pH7.4）缓冲液混合后，置于烧杯中，加入适量用缓冲溶液平衡后的阴离子交换载体，使树脂和蛋白溶液的体积比约为1∶5，混合均匀，缓慢搅拌120min 后，12000g离心，收集上清液。

于上清液中加入氯化钠使其浓度为3 mol/L，4℃盐析过夜，12000g离心30min，收集沉淀。

将沉淀用0.1mol/L 乙酸溶解，分别再用0.05mol/L乙酸、0.01mol/L乙酸、蒸馏水进行透析平衡后，得胶原溶液，用冷冻干燥机冷冻干燥16h，收集蛋白冻干粉。

1.3.4 SDS-PAGE电泳检测
将自提纯化的蛋白和牛Ⅱ型胶原蛋白参照品均配成0.01g/L 蛋白溶液。

浓缩胶浓度3% (pH 6. 8)，分离胶浓度8% (pH 8. 8)，电压140 V，电泳时间3h，结束后，凝胶用考马斯亮蓝染色30min，脱色后用凝胶全自动图像分析系统进行图像分析。

1.3.5 吸收光谱测定
用分光光度计在波长180～500 nm范围进行扫描，扫描条件如下：纸速80mm/min，扫描速度180mm/min。

2 结果
2.1 蛋白分子量的测定
在盐析时，当NaCl浓度为3mol/L时，得到大量蛋白沉淀A1；当将NaCl浓度调至4mol/L时，得到的沉淀A2很少。

将沉淀A1和A2经过脱盐、透析处理后，进行SDS-PAGE电泳分析，电泳图谱见图1。

A1在电泳图谱上所表现与Sigma公司的牛Ⅱ型胶原蛋白参照品一致，分子量约为130 kD；A2为小分子蛋白主要在60-90 kD之间，见图1。

2.2 纤维素纯化的效果
蛋白初提液S1经阴离子交换树脂(DEAE32)的处理后，进行SDS-PAGE电泳分析，与处理前比较未见明显变化，见图2。

2.3 提取的蛋白吸收光谱分析
从图3可看出提取的蛋白吸收峰为212 nm，符合CⅡ的吸收光谱［9］。

3 讨论
Ⅱ型胶原是RA的一种自身抗原，抗胶原抗体和胶原特异性T细胞在关节炎的发生和发展中起重要作用，口服同种属或异种属Ⅱ型胶原均有抑制、减轻动物模型关节炎的作用。

鉴于宁夏羊软骨来源丰富，我们采用酶消化法来提取羊Ⅱ型胶原蛋白。

图3 羊软骨Ⅱ型胶原蛋白吸收光谱
Ⅱ型胶原分子间交联键的存在使其分子稳定性增加，这是胶原提取的主要困难。

本研究采用胃蛋白酶降解法，去除部分伸直端尾肽，螺旋结构不受影响，故仍保持Ⅱ型胶原分子完整性，抗原性基本不受影响。

由于关节软骨中含有大量的蛋白多糖，这些物质的存在直接影响纯化质量，盐酸胍溶解可有效去除大量的蛋白多糖，DEAE阴离子交换又进一步去除蛋白多糖［10-11］。

本实验结果提示4mol/L盐酸胍能有效去除蛋白多糖等杂质；并对NaCl为3mol/L时的离心沉淀用0.5mol/L乙酸溶解，再用DEAE32进行纯化，SDS-PAGE电泳未观察到
处理前后的明显变化。

本研究对所提取的Ⅱ型胶原鉴定结果表明：①SDS-PAGE电泳与Sigma公司的样品完全一致，分子量约为130 kD。

②吸收光谱分析显示提取的蛋白紫外最大吸收峰在212 nm处，符合Ⅱ型胶原的特征。

所以此提取、纯化方法简单易行，并且可以工业化生产，为羊软骨CⅡ提取提供了实验方法和便利条件。

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