色谱分离技术 (1)

33
EBA色谱的凝胶选择原则

凝胶介质的颗粒大小和密度能使原材料的生物体 和吸附剂颗粒间的临界沉积流速产生明显的区别 凝胶介质的颗粒大小和密度分布应使EBA扩展过程 尽量小的固液轴向混合 吸附剂应能耐受培养基中生物体、核酸、脂类物 质等的污染 连接到吸附剂上的配基应足够稳定 吸附剂的物质转移能力在EBA色谱应用中足够有效
2
（二）色谱分离过程的特点
• • • •
应用范围广 分离效率高 操作模式多样 高灵敏度在线检测
3
二、基本原理
（一）、分离原理

色谱分离过程的实质是溶质在不互溶的固定相和 流动相之间进行的一种连续多次的交换过程 它借助在两相间分配的行为差别而使不同的溶质 分离 不同组分在色谱过程中分离情况首先取决于各组 分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是 否有差异
质量平衡方程
传质动力学
色谱过程很复杂，获得的动力学方程也 非常复杂，难以得到方程的解。
15
（四）、普遍化速率模型
色谱柱为等温体系 柱内任意截面上流动相线速度相同，径向浓 度梯度可忽略 扩散和传质系数在操作过程中保持不变，且 不受混合效应的影响 多孔颗粒为球形，大小均一，填装均匀，孔 内固定相浓度和液相浓度处于平衡状态 多孔颗粒孔内流动相处于静止状态，没有对 流流动，溶质传递仅靠扩散进行 溶质由流动相主体向固定相颗粒传递的过程 遵循也摸传质机制
13
轴向扩散理论
是Amudson等在大量实验的基础上提出的 理论认为：在色谱过程中，组分在流动相中的轴向扩散 影响色谱区域谱带扩张的主要因素，而有限的传质速率 对区域谱带扩张没有影响。 基本方程为：
D轴
2 cm cm 1 cs u 2 z z t
该理论考虑了溶质在流动相和固定相中的传质速率即流 动相的流动状态，具有较好的指导意义。
14
（三）、非线Hale Waihona Puke Baidu色谱理论
平衡等温线 通常用多组分的 Langmuir方程描述
ac ac 2 K Q 1 bc bc 2 K
注入函数
矩形输入和矩形阶梯输入 输入组分量=输出 组分量+积累量
(ucm ) 2cm 1 ( cs cm ) D 2 t z z
4
（二）固定相
色谱过程常用柱填料的种类如下：

硅胶衍生固定相 离子交换树脂 大孔吸附树脂 凝胶 手性固定相 纤维素衍生物 环糊精相 聚（甲基）丙烯酰胺 n-酸和n-碱固定相
5
（三）、色谱柱及柱技术
柱装填方法 高压匀浆法 干法 径向压缩法 轴向压缩法 环向压缩法 色谱柱设计
23
SMB分离一种药物中间体喹啉甲羟戊酸乙酯外销旋
混合物（称DOLE)的实例
图为Novasep公司 生产的Licosep12100装臵。它由12 根内径为100mm 高为150mm的不 锈钢柱、五个膜 式泵、多个双向 阀和UV检测器组 成。床层内填料 的高度可在50150mm范围内调 节,温度控制在 10-50℃之间，系 统的耐压能力为 不超过100bar。
轴向扩散系数： 液膜传质系数：
Db 1Dm 2 (2Rp )u
p k f Sc
2 3
u
1.15Re 0.5
固定相孔隙率和床层孔隙率
对于硅胶固定相近似认为： b p 0.40
固定相孔内扩散系数
估算式为： Dpi Dmi (1 2.104 2.093 0.955 ) / t
分子排阻或凝胶过滤色谱 离子交换色谱 疏水作用色谱 亲和色谱 正相/反相色谱
9
四、色谱分离过程基本理论
（一）保留值、分离度和柱效率
• 保留值
保留值是色谱过程的基本热力学参数 之一，也是 色谱定性的基础数据。通常以保留时间及容量因 子来表示。 从进样开始到柱子另一端流出的样品的浓度达到 最大值时所需要的时间为保留时间 ，它与固定相 和流动相的性质、柱温、流速和柱体积等有关。
20
根据结构特点可分为三带和四带SMB色谱：
三带SMB色谱
四带SMB色谱
21
• 建立SMB色谱分离工艺的步骤
设臵工 艺要求 确定溶 解度 选择固 定相 优化分 离条件
中试 研究 被分离的物质在 流动相中的溶解 度要足够高，才 能实现经济有效 的分离
工艺参 数模拟
以保留时间、 被分离物质在 流动相中的溶 解度和选择性 为条件
31
EBA色谱具有如下特点：

EBA色谱过程中，有形生物体可通过床层。因此可将生 物工程下游纯化技术中的离心、澄清过滤等多步骤提取 过程简化为简单的一步色谱分离过程，大大简化了工艺， 缩短了提取时间，节约了生物工程中下游纯化的资金投 入

EBA色谱是兼具批量吸附技术和填装吸附色谱（Packed Bed Adsorption，PBA）优点的实用技术，具有对原材 料依赖性低，吸附效率高的特点。因此，EBA色谱可在 短时间内对目标生物分子起到浓缩作用，且分离过程中 凝胶无损失，可重复使用，易于控制，易于规模化等。
11
• 柱效应
衡量色谱柱效率一般使用塔板高度和、塔板数，实际 工作中以下时计算塔板数（N）：
tR N 5.54( )2 w1 / 2
理论塔板高度表示为：
H L N
其中：w1/2 是峰高一半处的峰宽
L 是柱子的长度
12
（二）、色谱理论模型
平衡色谱理论 于1940年由wilson提出，假设在整个色谱过程中，色谱 柱中不存在船只阻力，溶质在固定相和流动相中的分 配平衡能瞬时完成。 能很好的解释谱线的移动速度，以及非线性等温线时流 出曲线的形状。 但由于忽略了非理想流动及各种传质阻力的存在，这个 模型是比较粗略的。 塔板理论 将色谱过程比拟为蒸流过程，色谱柱可看成是有一系列 理论塔板所组成的。 理论板可以对色谱流出曲线分布、谱带移动规律，以及 柱长等对区域扩张的影响给予近似的说明。 是半经验理论
学科进展讲座
色谱分离技术与应用
韩金玉 天津大学化工学院化学工艺系
1
一、概述
（一）发展简史

1903 年，俄国植物学家 Tswett 首先提出了“色 谱法”的概念 20 世纪50年代后期，分析型高效液相色谱技术 开始兴起 由于经典方法难以实现更高的分离要求，制备 规模的色谱逐渐发展起来 为了适应科技和生产的需要，生产规模的色谱 相继出现
C fi ( ) cbi z 0, peLi cbi z C 0i
1 0 imp C0i 0 imp
17
吸附等温线方程
Horvath等认为反相键合色谱的分离机理属于但 分子层吸附可用Langmuir方程来表示
参 数 估 计
HELP等各 种模拟软件 的使用
22
• SMB色谱的应 用 90年代，开始用于药物尤其是手性药物的离，目 前已发展到吨级工艺，如： UDP公司每年可以生产用于制备抗抑郁的药物氟 西丁单一异构体的中间体(R)-3-氯-1-苯丙醇 1000kg 1999年Novasep公司在美国加州的Aerojet公司建 立了柱内径达800mm的SMB体系 2000年Novasep公司又推出了由6个内径1000mm 柱组成的SMB体系
应用实例如下表：
27
大多数SMB色谱分离采用的手性固定相为纤维素 衍生物和淀粉纤维素衍生物。上表中有18个例子 是采用这类手性固定相
SMB色谱技术在生物分离领域也有较广泛的应用，如：

从细胞培养液的上清液中分离纯化单克隆抗体，产率 达90%以上 利用离子交换树脂为固定相，从微生物培养体中回收 氨基酸，赖氨酸纯度达98.5%以上 以PVP树脂为固定相，在10根柱子组成的SMB系统中分 离两种氨基酸，分别由残液中得到纯度96.7%的L-苯 基丙氨酸，由萃取液中得到纯度达99.7%的L-色氨酸
16
模 型 假 设
流动相主体的无因次方程：
1 2cbi cbi cbi i (c bi c pi ,r 1 ) 0 2 peLi z z
模 型 的 建 立
固定相颗粒的无因次方程： 略 初始和边界条件 此处
C fi ( )
0, cbi cbi (0, r , z ); c pi c pi (0, r , z )

轴向流动柱 径向流动柱
6
三、分类
根 据 分 离 样 品 量 的 不 同 分 半制备色谱
大规模色谱
生产规模色谱
7
根 据 制 备 与 生 产 中 应 用 的 设 备 分
模拟移动床色谱
扩展床吸附色谱
制备型加压液相色谱
制备型超临界流体色谱
8
根 据 溶 济 和 固 定 相 之 间 的 相 互 作 用 机 理 分
28
• SMB色谱技术的优势 （1）SMB色谱是一个连续色谱分离过程，这个特点使得 制备色谱分离过程实现自动化操作和稳定的产品质 量控制 （2）SMB色谱技术比其它制备色谱的分离效率高 （3）SMB色谱技术可以实现旋光异构物分离过程从分析 型色谱条件快速、可靠地放大 （4）SMB色谱装臵可以适合不同规模的色谱分离过程 因此，SMB色谱有可能成为化学工业及精细化工的一个新 的操作单元，随着系统设计方法及固定相的不断开发研 究，SMB色谱技术的应用将日益广泛
SMB中试工业装臵图
24
SMB分离过程流程图
25
实际操作的工艺条件和运行结果
由上表可以看出在实际的工艺条件下，产品纯度达到了99.4%， 生产能力为每天0.268kg（异构体）/kg(固定相），溶剂消耗量 为440L/kg异构体。在设备允许范围，高流速、短切换时间有利 于提高生产能力。
26
近年来SMB色谱技术已经成功地用于多种手性药物的分离 提纯，这项技术对于制药工艺发展的重要性已被公认。
10
• 分离度
定义为相邻色谱峰顶之间的距离除以二色谱峰的 平均宽度 ，表示为：
t R 2 t R1 2t R Rs 1 / 2( wb1 wb 2 ) wb1 wb 2
其中：tR1、 tR2 分别为两组分的保留时间 wb1、wb1 分别为两峰的基线宽度 RS 表示两组分的分离度
32
EBA色谱常用固定相（凝胶）及选择原则 常用EBA凝胶 Streamline系列凝胶（Amersham Pharmacia Biotech公 司设计生产 ） Cetamic Hypet D系列凝胶（法国Biosepra公司生产 ） Fractosil系列 （德国Merck公司生产，以多孔硅胶为 基质 ） Bioran系列 （德国Schott Glaswerke公司生产，以多 孔玻璃为基质 ） DM-I凝胶 （以纤维素-钛混合为基质 ） Macrosorb K4AX凝胶 （以硅藻土-琼脂糖混合物为基 质的）
18
对流动相主体采用有限元法，对固定 相颗粒采用正交配臵法 模 型 方 程 数 值 解

通过上述两种处理，获得一个由常微
分方程组成的方程组

美国Ohio州立大学的顾庭岳博士编制 了Fortran77计算程序
19
五、典型制备色谱工艺及应用
（一）、模拟移动床色谱（ SMB )
• 原理
SMB色谱是连续操作的 色谱系统，它由多根色谱 柱（大多为5-12根）相连 而成，原理示意如右图：
29
（二）、扩展床吸附色谱 （EBA）
EBA色谱是适应基因工程、单克隆细胞工程等生物工程 的下游纯化工作需要而发展起来的一项色谱技术 EBA色谱的基本原理和特点 EBA色谱的工作原理与一般的吸附色谱相同，但工作过 程不同，其示意图如下：
30
如上图所示， EBA工作过程为： • 凝胶颗粒在向上的流体作用下向上扩展 • 当向上的液体流速与凝胶颗粒的沉降速度达到平衡时，凝 胶颗粒处于平衡悬浮状态，这时形成稳态流动柱床，柱塞 的位臵处于柱床的顶部 • 接着将经离心、澄清过滤等处理的样品液以上向注入柱床， 目标蛋白质吸附在凝胶颗粒上，而有形颗粒直接穿 过 柱床 • 柱床随着液相上向流动而得到冲洗，未被吸附的物质都 流出床层，这时停止上向流动液体，凝胶颗粒沉降下来， 柱塞也逐渐下降至沉降床层表面 • 然后以洗脱液下向流动进行洗脱，得到目标蛋白质的浓缩 液，以便进行进一步纯化工作 • 洗脱完成后，用适当的缓冲液对柱床进行再生。