临床PCR实验室的设计及质量管理体系的建立

临床PCR实验室的设计及质量管理体系的建立

卫生部临床检验中心李金明

核酸（DNA和RNA）是生命现象的基础。小到病毒、细菌等微生物，大到动植物和人类，都无一例外。因为主导生命活动的受体、细胞因子、酶、激素等均不过是核酸发挥功能作用的表型，均由核酸决定，在核苷酸序列上哪怕是单个碱基的变异，都会引起表型的完全改变，并进而影响生命功能的发挥，导致疾病的发生。因此，在核酸或称为基因水平上检测，对临床疾病本质的揭示就要更深一步。也正因为核酸是生物体生命活动之源，对于感染性病原体的检测，从核酸着手，最能反映病原体在机体内的出现和消长。

自从美国Cetus公司Mullis博士在1983年发明聚合酶链反应（PCR）这种核酸扩增技术以来，由于其极高的检测灵敏度和特异性，因而在临床感染性疾病、遗传病、肿瘤等的诊断和疗效观察上得到了广泛的应用，在器官移植的基因配型上也是难以替代的技术。其应用大大提高了上述疾病诊断的准确性和快速性。但临床PCR检验必须按规范要求进行，并有严格的实验室质量管理，否则，因其极高的检测灵敏度，实验室稍有以前扩增产物的污染，或在标本核酸提取过程中标本间的交叉污染，均可导致假阳性结果的出现。同时，也会因为试剂和实验消耗品的质量不过关、仪器设备的维护校准不到位，或操作的不规范等，也很容易出现假阴性结果。

第一节临床PCR实验室的分区规划设计

如何规划设计一个合格的实验室是每一个临床PCR实验室首先要遇到的问题，因为一个实验室一旦经过设计并完成装修，如不符合要求，则会出现很大的麻烦，甚至不得不拆了重来。那么怎样才能设计一个合格的实验室呢？简单地说，就是十六个字，“各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作”。同时要注意临床标本的接收问题。

对于临床PCR实验室的分区及其设备配置，卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）中作了明确规定，并且卫生临床检验中心发出的配套文件《临床基因扩增检验实验室工作规范》（卫检字[2002]8号）又对各区的功能及注意事项作了阐述。但具体到某一个实验室，如何根据其实际情况和环境设计一个符合要求、可保证检测质量及方便工作的PCR实验室，实验室技术人员仍时常感到心里没底，因此，本章拟对临床PCR实验室分区规划设计和工作流程的一般原则再作一些具体的阐述，并尽可能举出一些实例加以说明。

一、临床标本的接收

对于诸如血清（浆）、分泌物、痰液、尿液、脑脊液等临床标本的接收、分离血清、编号乃至保存，一个临床PCR实验室究竟应在何处进行较为合适？这是一个非常实际的问题，也是作为一个临床实验室首先要解决的问题，经常有同道提出来。

要回答这个问题，首先让我们来看一下临床标本送到实验室以后我们所要做的是什么？一般来说，当临床标本如血液、分泌物和其他体液等送到实验室后，按照临床基因扩增检验质量保证对标本采集、运送和保存的要求，对标本接收编号后，即应尽快对其分离血清（浆）或预处理后保存待测，并且根据对临床标本较长期保存的要求，最好是在分离血清（浆）时，分出两管来，一管用于测定，一管长期保存备查。因此，最好是在PCR实验室的四个独立测定区域之外的地方接收临床标本，有一台分离血清（浆）用离心机、一台生物安全柜、一台冰箱、加样器及相应一次性经高压处理的消耗品如带滤芯吸头、标本接收编号记录本以及记号笔等即可。如果不在标本接收区分离血清（浆）标本，只是简单的接收，则就不需要分离血清（浆）用离心机、生物安全柜、加样器及其消耗品。

通常，有许多实验室将临床标本的接收处放在标本制备区，而一个医院临床标本的运送至实验室往往不会在同一个时间，标本来了就应该进行接收登记、交接签字和对标本进行编号，并尽快分离血清（浆）或相应处理，因此，如将标本接收处放在标本制备区，就会因为临床标本的接收而使实验室工作人员频繁出入标本制备区，从而增加实验室污染的机会。而且由于条件所限，有相当一部分临床基因扩增检验实验室的设置为一个区套一个区的模式，要进入标本制备区就必须先进入试剂准备区，最后还只能经扩增区从产物分析区出实验室。这种情况下就必须将临床标本的接收处放在四个区之外的地方，可以与其它临床标本的接收、编号和保存处放在一起。如在标本接收处对血液标本进行血清（浆）分离，则要注意防污染，所用器具符合要求并在生物安全柜中进行。

所接收的用于PCR检验的标本应收集在原始密闭的一次性无菌容器中，不能接收从其它检测如生化、免疫检验等分出来的标本，因其有较大的发生标本间污染的可能性。接收临床标本时，操作者应穿工作服及带手套，每份标本应放在适当的架子中，防止泄漏，并给出一个唯一性编号。标本的保存按要求进行，冰冻通常在－20℃～－70℃条件下，避免反复冻融。在核酸提取时，由PCR实验室人员将标本带入至标本制备区。

二、临床PCR实验室分区设计的一般原则及工作流程

（一）临床PCR实验室的分区设计的一般原则

前面说到，要设计一个合格的PCR实验室，简单地说，就是要做到十六个字，“各区

独立、注意风向、因地制宜、方便工作”。

各区独立，其含义就是PCR实验室的四个区（如使用实时荧光PCR则只需三个区，因其扩增和产物分析同时完成，不需要产物分析区）即试剂准备区、标本制备区、扩增区和产物分析区，应该是在物理上完全分开的各自独立的区域，并且不能有通过连通各区的中央空调、分区装修隔断不密封、传递窗不密封等发生空气直通的现象。有的实验室在分区设计时，只是考虑实验室在形式上的分区，如实验室各区的分隔不完全，有相通之处；或一个区套一个区的实验室各区间无缓冲间（如图3-1A和B）,或此类实验室有缓冲间却在装修时，采用家庭装修模式，即上吊推拉门或平开门，门的下面留有门缝；或实验室中央空调相通；或试剂物品传递窗闭封不严等。

(A)

(B)

图3-1 不合要求的一个区套一个区的实验室分区模式

在此想着重强调一点的是有关传递窗的设置。传递窗的设置是的一把“双刃剑”,一方面其方便了试剂物品在不同实验区间的传递，但另一方面也增加了交叉污染的危险。因此，一个合格的传递窗应是双开门密封严实的，并且两边的门最好是连锁装置，即当传递窗一侧的门没有关好时，另一侧门不能打开。此外，传递窗内应有紫外照射装置，并在使用后即进行照射。

中央空调如造成了实验室各区间的互通，则其不能使用，需在各区内另行安装分体式空调。

第二是注意风向。由于PCR对原始靶核酸有一个指数扩增过程，因此，每次检测后，均有大量由阳性标本扩增而来的“产物”存在，这种扩增产物如为开放式存在，以及在检测中的吸取，就会因为“产物气溶胶”的形成及扩散，而极易对以后新的扩增反应产生“污染”，为防止这种污染的发生，就需要在对基因扩增检验实验室进行严格分区的同时，还要注意实验室内空气在不同区的流向。关于这一点实验室通常会有什么样的误解呢？曾有同道说，准备将自己的PCR实验室装修成超净的实验室。这是没有必要的，因为基因扩增检验中的产物只是病原体如细菌或病毒核酸中一极小部分，通常也就一二百个核苷酸，实时荧光PCR的扩增产物更小，有的只有几十个核苷酸，这么小的分子可以说几乎是无孔不入，通常的超净装修设计对其来说是没有用的。因此，最关键是要注意空气流向，防止扩增产物顺空气气流进入上游扩增前的“洁净”区域。PCR实验室的空气流向，通常可以通过实验室的相对正压（通常可通过安装新风进气系统）或负压（可通过排风装置）来达到目的，如图3-2A 和B及图3-3、3-4所示。因为在实验室安装正压或负压系统通常比较困难，所以也可以按照从试剂准备区标本制备区扩增（及产物分析）区方向空气压力递减的方式进行（如图3-2C），最简单的做法就是在试剂准备区不装负压排风装置，在标本制备区安装负压排风装置或一个排风扇，在扩增（及产物分析）区安装功率强于标本制备区的负压排风装置或两个排风扇。

第三是因地制宜。PCR实验室不可能是千遍一律的，必须要具体情况具体分析。实验室各区既可是相互邻近，也可以分散在同楼层的不同处，甚至不同的楼层。新建实验室可以做得尽可能合理和规范，并且易于实验室的管理。旧的实验室则只要符合标准即可，不必强求理想状态。图3-2A和B的实验室都是属于满足基本要求的模式。