免疫学实验技术

单抗制备原理
如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由 单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针 对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基 础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠 骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞 系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细 胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养， 可形成单细胞系，即单克隆。
效价达到要求的可放血制备血清 • 可一次放血(颈动脉) • 也可多次取血(耳静脉)
多抗的特点
多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个群体综合 的性质。
比单抗更容易捕捉抗原。因为含有抗不同表位的抗体， 多种抗体都可与抗原结合。
特异性相对较差：因为由不同性质的抗体组成，只要其 中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多抗更 容易有交叉反应。
多克隆抗体制备
动物选择：
• 兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大耳 白）
• 小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C,昆 明鼠）
• 大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大 鼠）
• 羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）。 • 马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。 • 豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用。
基本步骤
实验方法
免疫小鼠
选择体重18－20g BALB/C 雌性小鼠，用制备抗原免疫。50—100ug 抗原/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下 多点注射0.5ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏 不完全佐剂充分乳化后，第二次皮下多点注射0.5ml每只，过3周后 用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。
基本步骤
抗原制备： 商品化或自行表达
基础免疫：首次，抗 原用量大，用佛式完 全佐剂（Complate Freund’ adjuvand , 含矿物油,卡介苗等)。
•加强免疫：第2次以后，抗 原量减半，多次，间隔2-4 周，用佛式不完全佐剂
(Incomplate Freund’ adjuvand ,不含卡介苗).
利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非 常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且 在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同 样的结构与机能。
单抗制备原理
HGRPT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 TK：胸腺嘧啶核苷激酶 HAT：次黄嘌呤（H)、胸腺嘧啶核苷（T)、氨基蝶呤（A)
抗体的纯化、标记比单抗难：因为含有各种不同类型、 亚类的抗体，提纯、标记的方法有所差别。同时,血清 中含有的杂蛋白比较多。
什么情况下需要制备单克隆抗体
目的蛋白有结构类似物 抗原不纯，无法分开 多抗效果不好（已排除非特异性反应） 希望将抗体用于治疗，研制成药品 希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂
放血制备血清： 可一次放血(颈动脉) 也可多次取血(耳静脉)
佐剂的作用机理： 延长抗原的作用时间 增强吞噬作用 刺激抗原提呈
取血测效价： 加强免疫两次或 三次以后的第7天取
血。
促进细胞因子分泌 诱导淋巴细胞分裂、增殖 影响T细胞“极化”
实验方法
新西兰大耳白，2000g(雌雄均可),健康,无病原
基础免疫 • 0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108颗粒抗原) • 0.5ml佛式完全佐剂(CFA) • 制备抗原-佐剂乳化液 • 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射
阳性细胞筛选
细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞 覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔。
阳性孔的特异性鉴定采用间接ELISA方法，用包被液稀释成1－10ug/mL的抗原100ul/孔包被 ELISA板，4℃过夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1－10％的脱脂奶粉或1－ 3％ BSA或3－6％牛血清封闭30-60min;加入阳性孔培养上清100ul/孔，37℃ 1－2 小时；PBST 洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司） 1应 性0反后0u应，l/孔的用，阳酶3性标7℃孔仪。读1－取2O小D时49，2的P值BS，T以洗与涤阴四性次O后D，值用比O值P大D-于H22O.12为底阳物性显。色获，分2m别o对l/L上H2述S抗O4原终有止特反异
质免疫共沉淀、免疫荧光技术、ELISA等
多抗来源
动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有 不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当 机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇 分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的 B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记 忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的 抗体分子分布到血液、体液中，即为多克隆抗 体。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-10：1的比 例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去 除培养基，用50% PEG（Sigma）作为融合剂，在37℃下水浴下加 入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融 合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有 饲养细胞的细胞板中，37℃，5%CO2的细胞培养器皿中培养。
加强免疫 • 间隔2-4周,可进行多次 • 0.5ml抗原(蛋白量减半) • 0.5ml佛式不完全佐剂(IFA) • 制备抗原-佐剂乳化液 • 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射
实验方法
免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价 • 酶联法：1:104以上，能达到1:106。 • 免疫双扩散： 1:16以上，能达到1:64
免疫学实验技术
抗体
定义：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞 增殖分化成的浆细胞所产生的、可与抗原发生特异性结合的免疫球 蛋白。
1.诊断：各类血清学检测， 抗人球蛋白测试，早孕检 测等
医学应用：
2.治疗：单克隆抗体疗法 （类风湿性关节炎多发性 硬化症等），肿瘤治疗。
科研应用：免疫共沉淀、免疫印迹、染色