海洋浮游细菌研究
海洋浮游病毒生态学研究方法概述
海洋浮游病毒生态学研究方法概述【摘要】海洋浮游病毒是海洋生态系统中丰度最大的生物有机体，在海洋生态系统中发挥着中要的作用。
海洋浮游病毒的生态学研究一直是海洋生态学研究的热点。
其研究方法也在不断发展和完善。
本文分别对病毒丰度、生产力的测定方法、多样性的检测方法以及分离培养鉴定方法及其发展等方面进行了总结和阐述，并对各部分研究方法的优缺点进行了讨论分析。
【关键词】海洋浮游病毒；研究方法；丰度；生产力；多样性；分离培养海洋浮游病毒是海洋生态系统中丰度最大的生物实体[1]。
海洋浮游病毒在海洋生态系统中发挥着重要的作用，对宿主的侵染和裂解作用，介导着大约20% 的宿主死亡率，大大加快了物质循环的速度[1]，并且调节着宿主群落结构的组成。
与此同时，病毒也扮演着介导水平基因转移，促进宿主类群进化的重要角色[1]。
除此之外，海洋病毒宏基因组学的研究表明海洋浮游病毒类群有着巨大的多样性，并且包含着大量未知的基因[1，2]。
海洋浮游病毒重要的生态作用必然使海洋浮游病毒生态学的研究成为热点。
目前，海洋浮游病毒的生态学研究主要从丰度，多样性，病毒介导的宿主死亡率，病毒与宿主的相互作用等方面开展。
而目前在各方面生态学研究中使用的方法可总结如下。
1. 海洋浮游病毒丰度的检测方法目前用于水生生态环境中浮游病毒丰度的测定方法主要有以下3种：透射电子显微镜技术（TEM），表面荧光显微镜技术（EFM）和流式细胞分析检测技术（FCM）[3，4]。
1.1 透射电子显微镜技术（TEM）透射电子显微镜技术是早期海洋病毒学研究中病毒定量最常用的方法。
使用这项技术时，要求浓缩海水中的病毒，把浓缩液滴置于铜网上，负染后镜检观察。
这项技术在检测病毒丰度的同时还能获取病毒形态方面的信息[5]。
但该项技术的检测的下限高，涉及到海水浓缩，染色，观察等诸多可能产生误差的环节，并且步骤繁琐，对操作人员的技术，仪器的要求都较高[6]。
1.2 表面荧光显微镜技术（EFM）表面荧光显微镜技术是目前检测病毒丰度使用最为普遍的方法。
海洋浮游病毒最主要的组成部分
海洋浮游病毒最主要的组成部分海洋中有病毒吗？有，而且数量惊人。
近一个世纪以来，海洋生物学家一直认为海洋中是没有病毒的。
当他们在显微镜下观察海水时，他们根本没有发现任何病毒，因此他们得出结论，海洋环境太恶劣，病毒无法大量存活。
但是总是有较真儿的人。
1986年，一位名叫丽塔· 普罗科特的生物学家决定进行一次更仔细、更系统的观察。
她对加勒比海和马尾藻海等地的海水进行了调查，发现了数量惊人的病毒。
此后，其他研究人员也陆续证实，海洋确实是一种病毒汤。
病毒是海洋生态系统的重要组成部分1990年1月，海洋传播病毒生态学的先驱福尔曼和丽塔· 普罗科特合作发表在《自然》杂志上的论文，以及一组挪威科学家的另一篇论文，首次证实了病毒是海洋生态系统的重要组成部分。
但是到这个阶段，科学家们只是模糊地意识到海洋病毒圈的惊人规模，但许多关于它的最简单的问题多年来一直没有得到解答。
比如，科学家甚至不能说出海洋中有多少种病毒。
学术界逐渐认识到，海洋中大约存在着10000000000000000000000000000000(1×10³¹)个病毒颗粒我们该如何理解这一长串几乎数不过来的数字呢？勉强做一些类比。
在海洋中，病毒的数量是其他所有海洋居民总量的15倍，而它们的总重量则相当于7500万头蓝鲸，如果你把海洋中所有病毒挨个儿排成一排，会延长到4200万光年之外。
蓝鲸是世界上最大的哺乳动物海水中怎么会有这么多病毒呢？海洋病毒具有与陆地病毒相同的增殖方式，它们无法自我复制，而是利用被感染的细胞进行繁殖。
以一种主要的海洋浮游病毒——噬菌体为例，我们看看它是怎么繁殖的。
显微镜下的噬菌体噬菌体是一种病毒，由于病毒在自然界中不能生活以及繁衍，所以病毒需要找一个宿主生存。
地球上绝大多数病毒的宿主是生物，但是噬菌体是个例外，它们的宿主是细菌。
噬菌体其实是这类病毒的统称，在噬菌体家族中，存在着许多种类的噬菌体，而每一种噬菌体只能对应一种细菌，有时也能对应这种细菌的近亲。
《海洋生物学》海洋浮游生物
1．营养生殖型：
活史仅有营养 殖，只能以细胞分裂的 式来进 蓝藻和裸藻等 些单细胞藻类属此。
殖。
2．无性生殖型
是 殖细胞（孢 ）不经结合，直接产 代的 殖 式。 性 殖型是指 活史中没有有性 殖，没有减数分裂。如 小球藻、栅藻等。
waters and warm water gyres • S i l i c o f l a g e l l a t e s : silica internal skeleton... found world wide, partic
Antarctic
• Green Algae: not common except in lagoons and estuaries
OBIS）中；
科学家发现地球上唯一一种“不死生物”
其特征是从水母型能够重新回到水螅型。 主要分布在加勒比地区的海域之中， 普 通的水母在有性生殖之后就会死亡， 但 是灯塔水母却能够再次回到水螅型。
“灯塔水母”（Turritopsis nutricula）
Marine Organisms Grouped by Lifestyle
Tree of Life
Importance of Phytoplankton
Phytoplankton is the base of the food chain
Phytoplankton population decline causes zooplankton and apex predators to decline .
005
Protista
海洋浮游生物
主要浮游生物细分包括细 菌， 浮游植物，浮游动物， 和仅在 其生命周期中临时浮 游者， 例如，鱼卵仔鱼和其 他生物 体（Kennish，1990） 的浮游 幼虫。浮游生物从初 级生产和 再矿化作用，参与 了上层海洋 生态系统的多个 水平，把物质 和能量向较高 的营养水平传递 ，如鱼类，鸟类，爬行动物和 海洋哺乳动物（Harris等
海洋生物学中的海洋浮游生物调查技术
海洋生物学中的海洋浮游生物调查技术海洋浮游生物调查技术是海洋生物学中的重要分支之一，它涉及海洋生态系统的各个方面，包括海洋的营养物质循环、能量流动以及生物多样性的维持等。
本文将从多个方面介绍海洋浮游生物调查技术的原理、方法和应用。
一、海洋浮游生物的分类海洋浮游生物是指在海水中漂浮的微小生物群体，通常包括浮游植物（如藻类）、浮游动物（如浮游动物门、桡足类、甲壳类等）以及微生物（如细菌、病毒等）。
它们生活在开放海洋、沿海水域和深海等各种环境中，是海洋生态系统中不可或缺的组成部分。
浮游生物通常被分为多个类群，如浮游植物、浮游动物和细菌等，具有多样的形态和特征。
根据它们的生长环境和特征，可以进一步将其分类为浮游植物门、浮游动物门、细菌门等。
二、浮游生物的调查方法1. 网采网采是最常用的浮游生物调查方法之一，其原理是利用各种网类捕捉海水中的浮游生物。
通常使用的是水平拖网或竖直拖网，不同网的特点在于网的大小、网孔大小和网的类型不同。
对于不同种类的浮游生物，通常选择不同的网来捕捉。
网采的主要优点在于操作简单，能够捕捉到多种类型的浮游生物。
但是，它也有缺点，如会捕捉到大量的非目标物种，以及可能导致捕捉到的生物受到破坏。
2. 漂流器漂流器是一种针对浮游生物调查的被动样品收集方法。
漂流器通常会随着海流、气流或风流进行漂流，因此它可以收集到具有广泛分布的、来自各个方向的浮游生物。
漂流器的主要优点在于样本不会被破坏，并且可以收集到散布在广阔水域中的生物群体。
但是漂流器只能在表层水域进行采集，不能获取深水区域的样本。
3. 过滤器过滤器是一种主动样品收集方法，其原理是将水样经过一个过滤器，在过滤器上收集被过滤物质中的生物。
通常使用的过滤器有滤膜、滤管和凝胶等。
过滤器的主要优点在于它能够采集到很小的生物体，而且可以过滤掉许多非浮游生物，但它在样品的收集量有局限。
过滤器可以采集到深层水样，但需要注意采样层数。
4. 浮标/浮球浮标/浮球是一种在海面上悬浮的浮游生物调查方法。
浮游生物群落的监测与分析
浮游生物群落的监测与分析近年来，随着环境污染的日益严重和海洋生态环境的恶化，对浮游生物群落的监测与分析变得越来越重要。
浮游生物群落是指在海洋中漂浮的细小生物，如浮游植物、浮游动物和浮游细菌等。
它们是海洋生态系统中重要的组成部分，对海洋生态环境的稳定和生物多样性维护起着重要作用。
因此，及时监测和分析浮游生物群落的变化，具有非常重要的意义。
一、浮游生物群落监测方法目前，常用的浮游生物群落监测方法包括采用水下显微镜、细胞计数、分子生物学、机器学习等技术。
水下显微镜可以直接观察到微小的浮游生物，如藻类、浮游动物等。
细胞计数则通过在海水中采集一定量的样本，通过显微镜观察和计数细胞数量来获得浮游生物数量和种类的信息。
分子生物学技术则可以通过分析浮游生物DNA序列和蛋白质结构，来了解它们所代表的种类和浓度等信息。
机器学习技术则可以根据浮游生物群落的特征，预测出未来的变化趋势。
二、浮游生物群落分析方法除了监测方法之外，对浮游生物群落的分析方法也十分重要。
分析方法主要包括多样性和功能分析。
多样性分析可以通过浮游生物样本的DNA或RNA序列分析来了解样本中存在哪些种类和数量。
功能分析则可以通过分析浮游生物的代谢物组合来评估它们对环境的响应和功能。
三、应用前景目前，浮游生物群落的监测和分析在海洋环境监测、生态环境保护、生态系统恢复等领域得到了广泛的应用。
例如，在海洋环境监测方面，通过对浮游生物群落的监测和分析，可以及时发现和预测污染事件对海洋生态环境的影响。
在生态系统恢复方面，可以通过引入一些浮游生物种类来改善海洋生态系统的生态环境，促进海洋生物的生长和繁殖，增加生物多样性。
此外，浮游生物群落监测和分析还可以用于科学研究和教育培训等领域，为生态保护和可持续发展提供更加精细化的数据和理论支持。
总之，浮游生物群落的监测和分析是维护海洋生态系统稳定和生物多样性的重要手段。
在未来，我们需要运用现代科技手段以及多学科、全方位的视角来深入研究、分析和应用浮游生物群落监测和分析技术，推动海洋生态保护和可持续发展。
海洋浮游病毒最主要的组成部分是什么
海洋浮游病毒最主要的组成部分是什么
海洋浮游病毒是细菌和原核生物中最小的常见微生物，全部或部分部分由RNA组成的一类病毒。
它们在全球的海洋和淡水里广泛分布，种类繁多。
海洋浮游病毒通常由一个外壳和一个核酸病毒分子组成，主要由脂质和糖代谢产物组成，病毒核酸类型不同，可以是RNA，也可以是DNA。
海洋浮游病毒的结构是无核的，直径大约在20~400nm，形状是不规则的球，尺寸不一，平均分子质量大约在1000Da到2000Da之间，有足够的尺寸和结构，以便识别和控制海洋中其它有机体的活动。
研究表明，海洋浮游病毒主要由脂质、核酸和糖代谢物组成，其中包括脂质，如磷脂类、脂类和脂肪酸，核酸可以是DNA也可以是RNA，糖代谢物主要有烷脂、单糖、多糖和脂类，这些化合物结构都是非常简单的。
当脂质接触到核酸、糖代谢物等其它原料时，就会出现大量病毒，它们可以在海水中传播。
使用病毒进行海洋生物学考察是一种十分有效的工具，可以促进我们对海洋生物的理解，并有助于我们推断环境的演变。
海洋浮游病毒的多样性不仅表现在它们的结构外，而且也体现在它们的遗传学特征上。
研究表明，海洋浮游病毒具有很高的多样性，它们的核心结构和功能也有所不同，可以利用这种多样性来帮助人们鉴别海洋浮游病毒的分布，以及海洋生物的分类和分类学研究。
海洋浮游动物群落结构与生态功能研究
海洋浮游动物群落结构与生态功能研究海洋浮游动物是海洋生态系统中一大类重要的生物群体，它们具有多样的群落结构和生态功能。
本文将探讨海洋浮游动物群落结构及其对海洋生态系统的生态功能。
一、海洋浮游动物群落结构的组成海洋浮游动物群落结构主要由浮游植物和浮游动物两大类组成。
浮游植物包括浮游藻类和细菌等微小植物，而浮游动物包括浮游甲壳动物、虾类、鱼类等。
1. 浮游植物群落结构浮游植物主要由硅藻、硅藻类、硅藻虾和甲藻等组成。
它们是海洋生态系统中重要的初级生产者，通过光合作用将太阳能转化为化学能，并释放氧气。
浮游植物的生长和分布受到水温、光照、营养盐和浮游动物的控制。
2. 浮游动物群落结构浮游动物包括浮游性无脊椎动物和鱼类等。
无脊椎动物主要有浮游甲壳动物、虾和瓢虫等，它们是浮游动物群落中的重要捕食者，通过摄食浮游植物和其他浮游动物来获取能量。
鱼类在浮游动物群落中处于更高的营养级别，它们通过摄食浮游动物和无脊椎动物来获取能量。
二、海洋浮游动物群落的生态功能海洋浮游动物群落在海洋生态系统中发挥着重要的生态功能，包括能量传递、物质循环、气候调节和环境监测等。
1. 能量传递海洋浮游动物群落是海洋生态系统的能量传递桥梁。
浮游植物通过光合作用转化太阳能为化学能，成为海洋食物链的起点。
浮游动物摄食浮游植物，并成为更高营养级别的生物摄食对象，将能量传递给更高级别的捕食者，实现能量的流动。
2. 物质循环海洋浮游动物群落在生物地球化学循环中发挥着重要作用。
浮游植物通过吸收和固定二氧化碳，将其转化为有机碳，并通过死亡和沉降将有机碳沉入海洋底部，促进碳的储存；同时，浮游动物通过摄食和排泄作用，将营养盐和有机物质重新释放到海洋中，参与了氮、磷等关键元素的循环。
3. 气候调节海洋浮游动物群落通过影响海洋生态系统的光学特性和气溶胶的生成释放，对气候调节起到重要作用。
浮游植物通过光合作用，吸收二氧化碳并释放氧气，稳定大气中的气体成分；同时，浮游动物的代谢作用产生的气溶胶影响大气中的能量和湍流，对气候和气候变化起到调节作用。
海洋浮游病毒最主要的组成部分
海洋浮游病毒最主要的组成部分【摘要】海洋浮游病毒是海洋生态系统中丰度最大的生物有机体，在海洋生态系统中发挥着中要的作用。
海洋浮游病毒的生态学研究一直是海洋生态学研究的热点。
其研究方法也在不断发展和完善。
本文分别对病毒丰度、生产力的测定方法、多样性的检测方法以及分离培养鉴定方法及其发展等方面进行了总结和阐述，并对各部分研究方法的优缺点进行了讨论分析。
【关键词】海洋浮游病毒；研究方法；丰度；生产力；多样性；分离培养海洋浮游病毒是海洋生态系统中丰度最大的生物实体[1]。
海洋浮游病毒在海洋生态系统中发挥着重要的作用，对宿主的侵染和裂解作用，介导着大约20% 的宿主死亡率，大大加快了物质循环的速度[1]，并且调节着宿主群落结构的组成。
与此同时，病毒也扮演着介导水平基因转移，促进宿主类群进化的重要角色[1]。
除此之外，海洋病毒宏基因组学的研究表明海洋浮游病毒类群有着巨大的多样性，并且包含着大量未的基因[1，2]。
海洋浮游病毒重要的生态作用必然使海洋浮游病毒生态学的研究成为热点。
目前，海洋浮游病毒的生态学研究主要从丰度，多样性，病毒介导的宿主死亡率，病毒与宿主的相互作用等方面开展。
而目前在各方面生态学研究中使用的方法可总结如下。
1. 海洋浮游病毒丰度的检测方法目前用于水生生态环境中浮游病毒丰度的测定方法主要有以下3种：透射电子显微镜技术（TEM），表面荧光显微镜技术（EFM）和流细胞分析检测技术（FCM）[3，4]。
1.1 透射电子显微镜技术（TEM）透射电子显微镜技术是早期海洋病毒学研究中病毒定量最常用的方法。
使用这项技术时，要求浓缩海水中的病毒，把浓缩液滴置于铜网上，负染后镜检观察。
这项技术在检测病毒丰度的同时还能获取病毒形态方面的信息[5]。
但该项技术的检测的下限高，涉及到海水浓缩，染色，观察等诸多可能产生误差的环节，并且步骤繁琐，对操作人员的技术，仪器的要求都较高[6]。
1.2 表面荧光显微镜技术（EFM）表面荧光显微镜技术是目前检测病毒丰度使用最为普遍的方法。
CARD-FISH在海洋细菌鉴定中的应用
CARD-FISH在海洋细菌鉴定中的应用摘要用辣根过氧化物酶(HRP)标记寡核苷酸探针和信号扩增系统，称为记者催化沉积(CARD)的荧光原位杂交(FISH)，目前并非普遍适用于海洋异养细菌样本。
HRP分子渗透到细菌细胞需要通透过程，这很可能会造成物种选择性细胞丢失。
在这里，我们提出了一种CARD-FISH的改进方案，用于鉴定海洋浮游和底栖微生物。
在样品过膜浓缩之后，滤膜过滤器嵌入到低凝胶点琼脂糖中，在90min 的溶菌酶孵育（10mg/mL，37℃）过程中，没有观察到细菌细胞数目减少。
用普通的细菌探针（EUB338-HRP）通过CARD-FISH方式所测定的北海沿岸浮游细菌的检出率（平均值：总细胞数的94%；范围：85%--100%）显著高于用单一标记的探针（EUB338-mono；平均值，48%；范围：19%--66%)所测出的检出率。
在用反义EUB338-HRP CARD-FISH之后，几乎没有观察到非特异性染色。
海洋SAR86分支的成员用单一标记的探针FISH是检测不到的；然而，一个大量种群却可以通过CARD-FISH被可视化(平均值：7%；范围：3%--13%)。
EUB338-HRP 在Wadden海洋沉积物中的检出率(平均值：81%；范围：53 %--100%)，几乎是EUB338-mono检出率的两倍(平均值：44%；范围：25 %--71%)。
增强的荧光强度和信号背景比率使CARD-FISH优于FISH——用直接标记的寡核苷酸来染色海洋环境中低rRNA含量的细菌。
1.引言细菌的荧光原位杂交（FISH）在十几年以前被一次提及，并被誉为微生物生态学的一项突破。
然而，研究人员在将该方法应用于除了高度富营养化系统的环境样品中时遇到了困难。
水生生境中的大多数细菌个体体积小，生长缓慢，或饥饿，浮游细菌细胞杂交的信号强度往往低于检测限或迷失在高背景荧光中。
过去几年中，在增强FISH的灵敏度上已作出许多努力，包括使用明亮荧光染料、图像增强影像显微镜、氯霉素处理处于生长状态细菌的rRNA、用不止一个的荧光标记寡核苷酸探针杂交、寡核苷酸探针助手、多标记多核苷酸探针、通过级级联酶扩大信号。
探索海滋奇观海洋浮游植物的生态功能
探索海滋奇观海洋浮游植物的生态功能海洋浮游植物是海洋生态系统中至关重要的一部分，它们具有丰富的生态功能。
海洋浮游植物是指那些随海流漂浮在海洋中的微小植物，包括各类藻类和细菌。
它们在海洋中扮演着重要的角色，对整个海洋生态系统的稳定性和可持续性发挥着重要的作用。
首先，海洋浮游植物是海洋生态系统的主要生产者之一。
它们通过光合作用将太阳能转化为有机物质，为海洋中的其他生物提供养分。
海洋浮游植物通过吸收二氧化碳并释放氧气，调节海洋中的氧气含量，维持海洋生态系统的氧气平衡。
同时，它们还是海洋食物链的基础，为其他浮游生物和海洋动物提供食物来源。
这些生物通过摄食海洋浮游植物，将能量转移到更高级别的生物中，形成食物链，维系整个海洋生态系统的生态平衡。
其次，海洋浮游植物对海洋生态系统的碳循环具有重要影响。
它们通过光合作用吸收二氧化碳，将其转化为有机碳，并在其体内进行碳储存。
这些有机碳随着海流的流动沉积到深海底部，形成了巨大的碳汇。
海洋浮游植物的生长和死亡过程中释放出的有机物质，也为深海生物提供了重要的碳源。
这些过程参与着全球碳循环，影响着海洋和大气中的二氧化碳浓度，对全球气候起着调节作用。
另外，海洋浮游植物还对海洋生态系统中的营养循环起着重要的调节作用。
它们在海洋中吸收和存储了大量的无机营养物质，如氮、磷等。
这些营养物质在浮游植物死亡后释放到海洋中，提供了其他生物所需的养分。
同时，海洋浮游植物的盛衰周期也会影响海洋中的营养盐含量，进一步调节海洋生物的生长和繁殖。
这种营养循环的平衡对于维持海洋生态系统的稳定性和生物多样性至关重要。
此外，海洋浮游植物还对水体的光线透明度和水质进行调节。
它们通过光合作用吸收水中的光线，降低水体的透明度，减少有害浮游植物和藻华的生长。
同时，浮游植物通过吸收废弃物和有毒物质，促进水质的净化和改善。
它们作为一个过滤器，对水体中的有害物质起到了一定的净化作用。
总之，海洋浮游植物作为海洋生态系统中的重要组成部分，具有丰富的生态功能。
海洋浮游植物在碳循环中的作用研究
海洋浮游植物在碳循环中的作用研究海洋是地球上最大的生态系统之一，其中包含着许多重要的生态过程和生物群落。
其中，海洋浮游植物在海洋碳循环中担负着不可或缺的角色。
这些小型植物会吸收海洋中的二氧化碳，促进光合作用，并通过生态相互作用带动整个生态系统的稳定和发展。
本文将介绍海洋浮游植物和它们在碳循环中的作用，以及目前的研究进展。
一、海洋浮游植物的简介海洋浮游植物是指在海水中漂浮的植物，主要包括浮游藻类和细菌。
它们是海洋生态系统的基础，为海洋食物链的底层提供能量和营养物质。
海洋浮游植物的种类繁多，包括硅藻、甲藻、绿藻等等。
其中，硅藻和甲藻是常见的浮游植物，它们在海洋碳循环中起着非常重要的作用。
硅藻主要在寒冷的海洋中生长，而甲藻则主要在热带和亚热带的海洋中生长。
海洋浮游植物通常只有微小的体积，但是它们分布广泛，数量极多。
它们的生长和繁殖速度非常快，可以在短时间内大量增殖。
这让它们成为海洋碳循环中的重要参与者之一。
二、海洋浮游植物在碳循环中的作用海洋浮游植物在海洋碳循环中扮演着非常重要的角色，它们通过光合作用吸收二氧化碳并将其转化为有机物质。
这些有机物质可以被其他生物吃掉并消耗，转化为其他物质的能量和营养。
如果没有这些浮游植物的存在，海洋生态系统将无法正常运转。
在海洋碳循环中，海洋浮游植物是其中最重要的碳库之一。
它们吸收和固定了大量的二氧化碳，形成有机物质并将其封存在体内。
这些有机物质可以通过沉积作用沉入海底，形成海底沉积物，从而有效地储存了大量的碳。
另一方面，海洋浮游植物也可以通过呼吸作用排放二氧化碳。
但是总体来说，它们在海洋中的吸收作用比排放作用要强得多，因此对于海洋生态系统的碳储存来说，海洋浮游植物是非常重要的。
三、研究进展目前，越来越多的科学家开始关注海洋浮游植物在碳循环中的作用，并通过各种方法进行研究。
例如，有研究人员通过实验室或野外的方法，测定浮游植物的生长速度、光合作用速率和呼吸速率等。
还有人员使用气体交换技术和同位素标记等方法，对浮游植物的二氧化碳吸收和排放进行测量。
海洋浮游植物生态学研究
海洋浮游植物生态学研究海洋浮游植物是海洋生态系统中重要的基础生物群体，对碳循环、氧气供应和生物多样性维持都起着至关重要的作用。
因此，对海洋浮游植物生态学的研究具有重要的科学和实际意义。
一、引言海洋浮游植物是指生活在海洋中的微小植物，主要包括浮游藻类和细菌。
它们通过光合作用吸收二氧化碳，释放氧气，是海洋生态系统的重要生产者。
本文将从浮游植物的分类、分布和生态功能三个方面对海洋浮游植物生态学进行研究。
二、浮游植物的分类浮游植物有很多种类，按照其形态和结构可分为原核类浮游植物和真核类浮游植物。
原核类浮游植物主要包括蓝细菌和叶绿细菌，它们通常呈现出圆形或椭圆形的形态。
真核类浮游植物则包括硅藻、绿藻、甲藻等多种类型，其形态和结构更加复杂多样。
三、浮游植物的分布浮游植物分布广泛，可以在全球各个海区找到它们的身影。
它们的分布受到许多因素的影响，包括海水温度、盐度、透明度等。
一般来说，浮游植物在富营养的海洋中更为丰富，而在营养贫乏的海洋中相对较少。
四、浮游植物的生态功能浮游植物具有重要的生态功能。
首先，它们通过光合作用吸收二氧化碳，释放氧气，对全球碳循环和氧气供应具有重要影响。
其次，浮游植物是海洋食物链的底层，为其他生物提供了丰富的营养物质。
同时，浮游植物也能吸附和沉淀底栖生物的有害物质，发挥着净化海洋环境的作用。
五、浮游植物与人类活动的关系浮游植物与人类活动密切相关。
首先，它们是渔业资源的重要组成部分，对于渔业的发展具有重要意义。
其次，浮游植物的过度生长会引起赤潮等有害现象，对渔业、旅游等产业造成不良影响。
因此，合理控制和管理浮游植物的数量和分布对于保护海洋生态环境具有重要意义。
六、结论海洋浮游植物生态学是一个重要领域的研究，它关乎海洋生态系统的平衡和稳定。
通过对浮游植物的分类、分布和生态功能的研究，可以更好地了解海洋生态系统的复杂性和多样性。
希望本文能为海洋浮游植物生态学的研究提供一定的参考和启示。
参考文献：1. Smayda, T. J. (1998). Patterns of variability characterizing marine phytoplankton, with examples for some coastal species. ICES Journal of Marine Science, 55(4), 562-573.2. Falkowski, P. G., & Oliver, M. J. (2007). Mix and match: how climate selects phytoplankton. Nature Reviews Microbiology, 5(10), 813-819.3. Edwards, M., Head, E. J. H., Bednaršek, N., Currie, K. I., Ellis, R. P., López-López, L., ... & Urban, E. R. (2016). A century of research on marine phytoplankton in the Western English Channel. Advances in marine biology, 75, 1-70.。
《海洋浮游生物》概述
《海洋浮游生物》概述绪论1．浮游生物：是指在水流运动的作用下被动地漂浮于水层中的生物群。
2．浮游生物的特点：多数个体很小；缺乏发达的运动器官，运动能力；多数分布于水体的上层或表层。
3．海洋浮游生物学：是一门研究海洋浮游生物的生命现象和活动规律的科学。
4．海洋浮游生物学与生物科学、海洋科学及水产养殖、海洋地质等学科都有密切的关系。
5．浮游生物的生态类群（按营养方式）：浮游植物：包括单细胞藻类（也包括细菌）。
其特点是：营养方式为自养方式，其中，藻类具有叶绿素或其它色素，能进行光合作用制造有机物，是水域生态系统中的生产者，细菌是生态系统的还原者（也可以是生产者）。
浮游植物一般分布于海洋的真光层。
浮游动物：包括原生动物、水母、轮虫、甲壳类、毛颚类、翼足类、异足类、被囊动物、浮游幼虫、仔鱼、稚鱼等。
其特点是：营养方式为异养方式，不能制造有机物，必须依赖已有的有机物为营养来源，多为滤食性。
浮游动物是海洋生态系统中的消费者，可分布于真光层，也可分布于较深的水层。
6浮游生物的生态类群（按个体大小分）：海洋浮游生物浮游动物7．海洋浮游生物的经济意义：有利方面：浮游生物是海洋经济动物的饵料基础；浮游生物是鱼类洄游路线和渔场的标志；浮游生物是海水养殖的重要饵料；一些海洋浮游动物是人类的食物；浮游生物可作为海流的指示种；浮游生物有助于勘探海底石油；浮游生物有助于研究海洋古地质和古环境；浮游生物有助于研究、防治海洋环境污染；不利方面：浮游生物可造成赤潮，危害海洋捕捞业和海水养殖业；浮游生物可破坏鱼网，捕食幼鱼；浮游生物会暴露军舰的夜间航行路线；浮游生物可聚集而形成声散射层－－假海底；硅藻1．海洋浮游植物的经济意义:浮游植物是海洋中的初级生产者，是海洋动物直接或间接的饵料，在海洋渔业方面有着重要的意义。
浮游植物是海流和水团的指示生物,在生物海洋学研究中意义重大。
浮游植物能富集污染物质，在海洋环境保护研究中有重要意义。
2．海洋浮游植物的主要类别原核细胞型生物：细菌;蓝藻门;真核细胞型生物：硅藻门：是最重要的浮游植物，将重点介绍。
海洋细菌浮游生物的多样性及种群组成
MICROBIOLOGY OF AQUA TIC SYSTEMSMarine Bacterioplankton Diversity and Community Composition in an Antarctic Coastal Environment Angelina Lo Giudice&Consolazione Caruso&Santina Mangano&Vivia Bruni&Maria De Domenico&Luigi MichaudReceived:5November2010/Accepted:18June2011#Springer Science+Business Media,LLC2011Abstract The bacterial community inhabiting the water column at T erra Nova Bay(Ross Sea,Antarctica)was examined by the fluorescent in situ hybridization(FISH) technique and the genotypic and phenotypic characterization of606bacterial isolates.Overall,the FISH analysis revealed a bacterioplankton composition that was typical of Antarctic marine environments with the Cytophaga/Flavobacter(CF) group of Bacteroidetes that was equally dominant with the Actinobacteria and Gammaproteobacteria.As sampling was performed during the decay of sea-ice,it is plausible to assume the origin of Bacteroidetes from the sea-ice compartment where they probably thrive in high concentra-tion of DOM which is efficiently remineralized to inorganic nutrients.This finding was supported by the isolation of Gelidibacter,Polaribacter,and Psychroflexus members (generally well represented in Antarctic sea-ice)which showed the ability to hydrolyze macromolecules,probably through the production of extracellular enzymes.A consis-tently pronounced abundance of the Gammaproteobacteria (67.8%)was also detected within the cultivable fraction. Altogether,the genera Psychromonas and Pseudoalteromo-nas accounted for65.4%of total isolates and were ubiquitous,thus suggesting that they may play a key role within the analyzed bacterioplankton community.In partic-ular,Pseudoalteromonas isolates possessed nitrate reductase and were able to hydrolyze substrates for protease,esterase, andβ-galactosidase,thus indicating their involvement in the carbon and nitrogen cycling.Finally,the obtained results highlight the ability of the Actinobacteria to survive and proliferate in the T erra Nova Bay seawater as they generally showed a wide range of salt tolerance and appeared to be particularly competitive with strictly marine bacteria by better utilizing supplied carbon sources.IntroductionMarine bacterioplankton communities play a key role in the energy flow,in the interactions between oceans and atmo-sphere,and in the oceanic food webs.In particular,dissolved organic matter(DOM)sequestration by means of bacterial production within the microbial loop strongly influences the marine ecosystem functioning[17].Nevertheless,several processes within which microbes are involved are yet unknown or little understood.An important preliminary step towards understanding the bacterial roles in the oceans is determining the numbers and relative abundances of different phylogenetic groups.In fact,dominant groups may be proportionally more influential in carbon cycling and other biogeochemical processes[14].Modern culture-independent approaches could be essential in giving a general overview on marine microbial biodiversity.Among these,the detection of rRNA,whose content is related to the metabolic state of microbial cells,makes the fluorescence in situ hybridization (FISH)technique a useful tool to describe the composition of the more active and ecological relevant part of the microbial community without PCR[15].On the other hand,even if only a small fraction(0.01–0.1%of the total assemblage)of marine bacteria can be generally analyzed by cultivation approaches on standard culture media[23],culturing methods have several advantages as they allow to preserve strains for subsequent detailed analyses.Therefore,from a practical standpoint,isolating and characterizingmarine A.Lo Giudice(*):C.Caruso:S.Mangano:V.Bruni:M.De Domenico:L.MichaudDipartimento di Biologia Animale ed Ecologia Marina(DBAEM),Universitàdi Messina,Viale Ferdinando Stagno d’Alcontres31,98166Messina,Italye-mail:alogiudice@unime.itMicrob EcolDOI10.1007/s00248-011-9904-xmicroorganisms represent a fundamental approach in order to achieve a better comprehension of their physiology and ecology,thus providing information about communities that cannot be obtained directly from sequencing efforts alone.So, both culture-dependent and culture-independent approaches to the study of natural microbial communities should be employed synergistically because their findings are complementary[1,21,27,28,40,53].Antarctic marine ecosystems are among the less-explored environments on earth and offer to researchers a unique opportunity for studying bacterial diversity and evolution[41, 55].However,to date,studies that describe the structure and composition of the bacterioplankton communities in Antarc-tic waters are quite rare[37],and they mainly focus on the open Southern Ocean.Conversely,bacterial communities thriving at coastal Antarctic and subantarctic areas are poorly characterized[42].With regard to the Ross Sea,Gentile et al.[24]determined the composition of bacterioplankton assemblages in coastal surface waters(T erra Nova Bay)by sequencing clone libraries derived from16S rRNA and16S rDNA.More recently,Celussi et al.[10–12]analyzed,in terms of both activity and structure(applying the DGGE technique),the bacterial communities along the water column, in the under-ice seawater and within the water masses.Over the last decade,culture-independent techniques have been frequently adopted for the analysis of the bacterioplankton in Antarctic marine environments different from the Ross Sea[e.g.,13,34,44,52].On the contrary, few documented reports have addressed the molecular description of cultivable bacterial communities[31,36,57].In this context,the present study was aimed at studying the bacterioplankton assemblages at T erra Nova Bay(Ross Sea) by applying(1)the FISH analysis on native seawater samples to achieve a general overview on the bacterial community composition and(2)a combination of phenotypic and genotypic approaches to the cultivable bacteria in order to obtain further information on such under-investigated fraction of the Antarctic bacterioplankton community that may have high interest in future research such as biodiscovery and taxonomic characterization.MethodsSample CollectionA total of102seawater samples were collected in2005 from January17th to February10th along the water column of the following coastal stations at T erra Nova Bay(Ross Sea):Faraglioni(F AR,0–100m;coordinates74°42′52″S–164°08′06.5″E),Mergellina(MER,0–50m;coordinates 74°41′29.4″S–164°07′03.1″E),Portofino(PTF,0–200m; coordinates74°42′37″S–164°09.2′E),Santa Maria Novella (SMN,0–500m;coordinates74°43′S–164°16′E),T ethys Bay(THS,0–100m;coordinates74°41.698′S–164°04′214″E),and Tiburtina(TIB,0–250m;coordinates74°42′0.50″S–164°10′01″E)(Fig.1).Due to adverse meteorological conditions and logistic difficulties,all but one station(i.e., THS)were sampled three times.Sampling was performed by using10l Niskin bottles,pre-treated with a HCl10N solution and mounted on a rosette system equipped with a multiparametric probe to measure temperature and salinity. During the sampling period,in the T erra Nova Bay, seawater temperature ranged between−2.03and+3.20°C, while salinity was from33.60PSU to34.60PSU(Fig.2).Enumeration of T otal BacteriaSamples for total bacterioplankton enumerations were fixed with formaldehyde(final concentration,2%),filtered on black polycarbonate membranes(pore size,0.22μm; diameter25mm),and kept frozen until processing.DAPI (4′,6-diamidino-2-phenilindole)-stained cells were counted by a Zeiss AXIOPLAN2Imaging epifluorescence micro-scope as previously described[29,43].More than300cells per sample were counted in randomly selectedfields. Figure1Sampling station location in the T erra Nova BayA.Lo Giudice et al.Fluorescence In Situ HybridizationThe in situ abundance of different phylogenetic groups was determined by FISH as described by Glöckner et al.[25].Cells were concentrated from water samples (5–10ml)on white polycarbonate filters (diameter,25mm;pore size,0.22μm)and subsequently fixed for 30min at room temperature by overlaying filters with a freshly prepared paraformaldehyde (final concentration 4%)phosphate-buffered saline (PBS;130mM NaCl,10mM NaHPO 4,and 10mM NaH 2PO 4,pH 7.4)solution (3ml).The fixative was removed by applying vacuum,and filters were washed twice with 3ml of PBS and,finally,with distilled water.Filters were labeled,air dried,and stored in a sterile Petri dish at −20°C until processing.Filter sections were hybridized with the CY3-labeled oligonucleotide probes listed in T able 1(MWG-Biotech,Germany)and mainly targeting phylogenetic groups of the domain bacteria.A negative control probe,nonEUB (5′-ACTCCT ACGGGAGGCAGC-3′),was also used for nonspecific probe binding.Results with this negative control probe,which accounts for autofluorescence of cells and nonspecific probe binding,were subtracted from the percen-tages detected with probes for the bacterial groups.Filters were mounted on glass slides with Citifluor AF1(Citifluor Ltd.,Canterbury ,United Kingdom)and enumeratedbyFigure 2T emperature and salinity profiles at T erra Nova Bay during samplingT able 1Oligonucleotide probes used in this study Probe aT arget groupProbe sequence (5′–3′)F A (%)bT arget sit 16S or 23S rRNA position (nucleotide)ReferenceEUB338I Most but not all Bacteria GCTGCCTCCCGT AGGAGT 016S (338–355)[18]EUB338II Planctomycetes GCAGCCACCCGT AGGTGT 016S (338–355)[18]EUB338III V errucomicrobiales GCTGCCACCCGT AGGTGT 016S (338–355)[18]ALF1b Alphaproteobacteria CGTTCGYTCTGAGCCAG 2016S (968–985)[33]BET42a Betaproteobacteria GCCTTCCCACTTCGTTT 3523S (1027–1043)[33]GAM42a GammaproteobacteriaGCCTTCCCACA TCGTTT 3523S (1027–1043)[33]CF319a Cytophaga –Flavobacterium group of the BacteroidetesTGGTCCGTGTCTCAGT AC 3516S(319–336)[33]HGC69a Actinobacteria (high G +Ccontent —Gram-positive bacteria)T A T AGTTT ACCACCGCCGT 2523S (1901–1918)[46]LGC354a Firmicutes (low G +Ccontent —Gram-positive bacteria)TGGAAGA TTCCCT ACTGC 3516S (354–371)[35]LGC354b Firmicutes (low G +Ccontent —Gram-positive bacteria)CGGAAGA TTCCCT ACTGC 3516S (354–371)[35]LGC354c Firmicutes (low G +Ccontent —Gram-positive bacteria)CCGAAGA TTCCCT ACTGC 3516S (354–371)[35]ARCH915ArchaeaGTGCTCCCCCGCCAA TTCCT2016S (915–934)[51]aProbes EUB338I,EUB338II,and EUB338III were equimolarly mixed together to obtain the EUB-mix;the probes LGC354a,LGC354b,and LGC354c were equimolarly mixed together to obtain the LGC-mix bV alues represent percent of formamide in the hybridization bufferBacterioplankton Community at T erra Nova Bay (Antarctica)epifluorescence microscope(Axioplan,Zeiss)equipped with specific filter sets for CY3.For each sample and probe, minimum20fields and200cells were enumerated.Enumeration and Isolation of Cultivable Heterotrophic BacteriaSamples for cultivable heterotrophic bacteria were pro-cessed within approximately4h after sampling.Serial dilutions were prepared(1:10and1:100,using filter-sterilized seawater)and100μl of each dilution was spread plated on two replicates on Marine Agar2216(MA,Difco). Colony forming units(CFUs per milliliter)were counted after incubation for1month at4°C.Colonies were randomly selected from agar plates used for CFU counts, picked,and subcultured almost three times under the same conditions.16S rDNA PCR Amplification of Bacterial IsolatesPCR amplification of16S rDNA from bacterial isolates was carried out under the conditions described earlier[36]. Briefly,a single colony of each strain was lysed by heating at95°C for10min.Amplification of16S rDNA was performed with an ABI9600thermocycler(PE,Applied Biosystems)using the domain bacteria-specific primers 27F(5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′)(spanning positions from8to27in E.coli rRNA coordinates)and 1492R(5′-CT ACGGCT ACCTTGTT ACGA-3′)(spanning positions from1492to1513in E.coli).The reaction mixtures were assembled at0°C and contained1–10ng DNA,10×buffer,1.5mM MgCl2,150ng of each forward and reverse primer(MWG,Germany),250μM dNTP (Polymed,Italy),0.5U of PolyT aq polymerase(Polymed, Italy),and sterile distilled water to a final volume of20μl. Negative controls for DNA extraction and PCR setup (reaction mixture without a DNA template)were also used in every PCR run.The PCR program was as follows:3min at95°C,followed by30cycles of1min at94°C,1min at 50°C,2min at72°C,and a final extension step of10min at 72°C.The expected size of the PCR product was approximately1.4kb.The results of the amplification reactions were analyzed by agarose gel electrophoresis(1%,w/v)in T AE buffer (0.04M Tris–acetate,0.02M acetic acid,0.001M EDT A), containing1μg/ml of ethidium bromide.Amplified rDNA Restriction AnalysisPCR mixture(5μl of each),containing approximately 1.5μg of amplified16S rDNA,were digested with3U of the restriction enzyme Alu I(Fermentas)in a total volume of 20μl at37°C for3h.The enzyme was inactivated by heating at65°C for15min,and the reaction products were analyzed by agarose(2.5%,w/v)gel electrophoresis(at 90mV for90min)in T AE buffer containing1μg/ml of ethidium bromide[36].A GeneRuler™100bp DNA Ladder(Fermentas)was applied to each gel as a band reference.Amplified rDNA restriction analysis(ARDRA)carried out with Alu I as restriction enzyme can generate species-specific patterns.This enzyme,generating the largest number of different restriction patterns,is particularly suitable for studying the diversity of polar marine planktonic bacteria as shown by Zeng et al.[57].Thus,representative strains of each ARDRA pattern can be chosen for16S rDNA sequencing to obtain information about the exact type of microorganisms present in a sample[57].As only the presence/absence of each band was considered,a matrix was generated by the mere visual comparison of the restriction patterns obtained by ARDRA. Antarctic isolates were grouped into operational taxonomic units(OTUs),assuming that a single OTU was made up of strains belonging to the same species which showed the identical Alu I restriction pattern.As a control,colony morphology of strains that showed identical ARDRA patterns were compared in order to check for eventual errors.Sequencing and Analysis of16S rDNAOne to three representative strains(where possible), showing identical ARDRA pattern,were randomly selected for sequencing by using the primer27F[36].All singletons (strains from OTUs made of a single member)were sequenced.Next relatives of the bacterial isolates were determined by comparison to16S rRNA gene sequences in the NCBI GenBank and the EMBL databases using BLAST [2],and the“Seqmatch”and“Classifier”programs of the Ribosomal Database Project II(/).Representative strains were named with the suffix COL followed by the OTU number.Therefore,from this point onwards,names of OTUs and representative isolates will coincide.Isolates are part of the Italian Collection of Antarctic Bacteria(CIBAN)of the National Antarctic Museum(MNA,http://www.mna.it)“Felice Ippolito”kept in our laboratory at the University of Messina.They are currently maintained on MA slopes at4°C and routinely streaked on agar plates from tubes every6months to control purity and viability.Antarctic strains are also preserved by freezing cell suspensions at−80°C in Marine Broth(MB,Difco)to which20%(v/v)glycerol is added.The nucleotide sequences of the representative isolates sequenced in this study have been deposited in the GenBank database under the accession numbers HQ534312–HQ534357.A.Lo Giudice et al.Phenotypic CharacterizationIsolates representing each OTU were phenotypically charac-terized according to previously reported methods[8,30]. Gram reaction,oxidase,catalase,motility,and endospore presence were determined as described by Smibert and Krieg [49].Colony morphology and pigmentation were recorded from growth on MA at4°C.Flagellar arrangement was determined by using the Bacto Flagella Stain(Difco).The growth of isolated bacteria at different temperatures was tested in MB incubated at4°C,10°C,15°C,20°C,25°C,30°C,and 37°C for up to4weeks.The pH range for growth was determined in MB with pH values of separate batches of medium adjusted to4–9by the addition of HCl and NaOH (0.01,0.1,and1M solutions).Salt tolerance tests were performed on Nutrient Agar(NA)with NaCl concen-trations ranging from0to15%(w/v).Isolates were tested for the ability to grow on various solid media such as Trypticase Soy Agar(TSA;Oxoid),TSA+3%(w/v)NaCl, and TCBS agar(Difco).Chitin hydrolysis was assayed by adding colloidal chitin to MA plates(0.1%,w/v). Agarolytic activity was tested on the medium of V era et al.[54].Starch hydrolysis was screened as described by Smibert and Krieg[49].Susceptibility to antibiotics was assayed by using the antibiotic-impregnated disks(Oxoid), which were laid on MA plates previously surface inoculated with the test strains.The following antibiotics were tested:penicillin G(10μg),polimixine B(30μg), nalidixic acid(30μg),tobramycin(10μg),tetracycline (30μg),chloramphenicol(30μg),and vibriostatic agent O/129(10μg).Any sign of growth inhibition was scored as sensitivity to that antimicrobial compound.Resistance to an antimicrobial drug was indicated if did not show any inhibition zone.Additional biochemical and enzymatic tests were performed using API tests(BioMerieux), including API20E and API20NE galleries,according to the manufacturer's instructions.For tests carried out on solid and liquid,media cultures were incubated at4°C for 21days.All analyses were performed at least twice to confirm results.Statistical AnalysisData were analyzed by analysis of variance(ANOV A),and the relative importance of each treatment group was investigated by a Pairwise Multiple Comparison procedure (Dunn's method).Prior to analysis,the homogeneity of variance and,if necessary,data were sqrt(×+1)trans-formed.Calculations were carried out using SigmaStat software for Windows,version3•1(Copyright1992–1995, Jandel Corporation).Bray Curtis similarity,cluster,and SIMPER analyses were computed on FISH results by using Primer6software,version6βR6(Copyright2004, PRIMER-E Ltd).Finally,phenotypic data were analyzed by n-MDS based on the Bray Curtis similarities.ResultsBacterial Enumeration and CultivabilityResults on both viable and total counts and percentage of cultivability for each station are reported in T able2. Overall,viable counts on MA ranged from0.2×102to 8.9×104CFU ml−1,with a mean value of 3.85±1.0×103CFU ml−1(n=102).The lowest and highest mean values were found at stations FAR(0.7±0.6×103CFU ml−1;n=18)and THS(1.5±1.0×104CFU ml−1; n=12),respectively.No statistically significant differences were computed between stations(P>0.05).T otal bacterial counts,as determined by the nonselective DAPI staining, ranged from0.1to15.7×105cells ml−1with a mean value of3.3±3.0×105(n=102).Slight differences in mean cell concentrations were determined among the samplingT able2Descriptive statistics of viable and total counts determined in native samplesStation Sample size(n)Sampling depths(m)Range(min to max)Mean±st.dev.Cultivabilityrange(%)Viable counts (CFU ml−1×102)T otal counts(cells ml−1×105)Viable counts(CFU ml−1×102)T otal counts(cells ml−1×105)F AR150,10,30,50,1000.5–29.50.3–8.9 6.7±8.4 2.8±2.50.1–0.6 MER150,5,15,25,50 1.8–117.4 1.2–12.740.5±45.4 4.2±3.80.1–1.5 PTF180,20,30,50,100,2000.5–221.0 1.1–15.737.3±66.4 3.9±3.60.1–2.8 SMN210,10,30,50,100,200,5000.8–79.50.5–9.513.7±25.0 2.8±2.40.1–1.3 THS120,15,30,50,75,1000.3–890.00.1–9.7153.8±264.6 3.2±3.80.6–11.0 TIB210,10,25,50,100,200,2500.2–84.00.8–11.015.2±23.9 3.1±2.30.1–1.6F AR Faraglioni,MER Mergellina,PTF Portofino,SMN Santa Maria Novella,THS T ethys Bay,TIB TiburtinaMin minimum value,max max value,st.dev.standard deviationBacterioplankton Community at T erra Nova Bay(Antarctica)stations investigated in the T erra Nova Bay waters.The lowest mean value was found at both stations F AR(2.8±2.5×105cells ml−1)and SMN(2.8±2.4×105cells ml−1), whereas the highest value was recorded at station THS (4.2±3.8×105cells ml−1).T otal counts determined at station THS were statistically significant different from the stations SMN,F AR,and TIB(P<0.05).A statistically significant difference was also computed between the stations MER and SMN(P<0.05).Culturable bacteria represented0.1–11.0%of total bacterioplankton(mean value of0.9±1.7%)with highest percentages of cultivability determined at0–15m depths at station THS during both samplings(not shown).In Situ Abundance of the Major Phylogenetic Groupsby FISH AnalysisOverall,between55.8%and95.5%of DAPI-stained bacteria were visualized by FISH(Eubacteria plus Archaea),with a mean percentage of79.5±8.8%.The fraction of cells detected with the eubacterial probe EUB338varied from32.5%to80.6%of DAPI-stained cells,with a mean value of67.8±22.8%.The percentage of bacteria detected with a negative control probe varied from0%to2%of the DAPI-stained bacteria.The relative amounts of Gram-negative and Gram-positive bacteria were in the range22.9–59.4%and 5.6–34.5%,respectively.On average,among Eubacteria detected by DAPI staining,14.8±5.0%of cells were affiliated with the Cytophaga–Flavobacter group of the Bacteroidetes(range 4.9%to28.3%),11.8±4.3%were affiliated with the HGC group(1.5–25.0%)and11.3±3.2% with the Gammaproteobacteria(3.1–21.0%)(Fig.3a).The Alphaproteobacteria,the LGC group,and the Betaproteo-bacteria were slightly less abundant(9.4±3.3%,9.1±3.5%, and 6.8±3.2%,respectively).ARCH915-hybridized cells represented0.1–11.2%of DAPI-stained cells,with a mean value of3.7±2.5%.As shown in the Fig.3b,differences were observed among the analyzed stations.The percentage of DAPI-stained cells detected with the eubacterial probe was quite high,being greater than70%at all stations.The cluster analysis computed on Bray Curtis similarities revealed that the stations grouped into three distinct clusters,with SMN as the less similar to the others(91.56±0.89%)(Fig.3c). Genetic Fingerprinting and Phylogenetic Affiliationof Antarctic IsolatesOverall,606strains were isolated:173from TIB,109from SMN,102from PTF,99from F AR,77from THS and, finally,46from MER.Overall,46different Alu I ARDRA patterns(OTUs)were distinguished.Most of them(31OTUs) were represented by one to three isolates.The phylogenetic affiliation of isolates was obtained by sequencing and analysis of16S rRNA genes(T able3).Overall,the cultivable bacteria were placed within five different taxa,with the predomi-nance of Gammaproteobacteria(67.8%),followed by Actinobacteria(16.7%),Alphaproteobacteria(9.4%),Bacter-oidetes(5.3%),and Firmicutes(0.8%).The majority of OTUs were shared between different stations(especially when considering the first50m of the water column;not shown).In particular,only two OTUs (COL-1and COL-35)were present at all stations.Of these, Psychromonas-related COL-1could account for up to70.6% (station PTF)of the analyzed sequences.Isolates clustering into such OTU,as well as in the COL-69(unidentified actinobacterium),were obtained from the surface to450m.The411Gammaproteobacteria,grouping into seven different ARDRA patterns,were predominantly represented by the genera Psychromonas(269isolates)and Pseudoalter-omonas(127isolates),followed by Psychrobacter(ten isolates),Glaciecola(three isolates),Colwellia(one isolate), and Shewanella(one isolate).The next abundant group,the Actinobacteria(101isolates),included among others Agro-coccus jenensis closely related strains(28isolates)and Arthrobacter spp.(22isolates)as the dominant representa-tives.Moreover,21Actinobacteria isolates(COL-69)were strongly related to an unknown Antarctic bacterium R-8287 (16S rDNA similarity99%),probably assignable to the genus Frigoribacterium.Among the Alphaproteobacteria (57isolates),the genera Roseobacter and Sphingomonas were frequently isolated(28and13isolates,respectively). Bacteroidetes(32isolates)included representatives of the genera Gillisia,Bizionia,Gelidibacter,Polaribacter,and Psychroflexus.Finally,the only five isolates affiliated to the Firmicutes belonged to the genera Bacillus and Planococcus.The relative abundances of the different phylogenetic groups varied between the stations investigated(T able4). Except for the station MER(where the Actinobacteria were the most abundant;41.3%),members of the Gammaproteo-bacteria strongly predominated everywhere,ranging from 57.2%(station TIB)to80.7%(station SMN).The next two abundant phylogenetic groups were generally those of the Actinobacteria and the Alphaproteobacteria(in the range 9.1–21.4%and1.8–16.2%,respectively).Members of the Bacteroidetes(range3.7–11.7%)were not retrieved from F AR samples,while the Firmicutes(range0.6–2.2%)were not isolated from the stations F AR and PTF.Phenotypic Characterization of Antarctic Isolates Bacterial isolates were mainly Gram-negative rods which were motile by means of polar flagella(not shown). Pigmented bacteria(63.9%of total isolates)were predom-inantly members of the Bacteroidetes and Actinobacteria(19.4%and30.6%,respectively).Most isolates wereA.Lo Giudice et al.psychrotrophs being able to grow between 4°C and 30°C,but not at 37°C (Fig.4a ).Only four strains (Psychromonas sp.COL-1,Psychromonas sp.COL-9,Bacillus sp.COL-31,and the actinobacterium sp.COL-22)showed a narrower temperature range (4–15°C).Any members of the Gammaproteobacteria and Actinobacteria grew at 37°C.Regarding the pH,the majority of isolates (mainly belonging to the Actinobacteria grew well within a pH range from 6to 9.None of them were able to growth at pH 4.The majority of isolates grew in a wide salinity range and tolerated up to 9%(w /v )NaCl.None of them were able to grow at the highest tested NaCl concentration (15%).Results for enzyme presence and macromolecule hydroly-sis are shown in Fig.4b .The majority of isolates possessed catalase (69.4%)and β-galactosidase (52.8%).Only members of the Actinobacteria lacked oxidase which was observed in the 27.8%of isolates.Urease and tryptophane deaminase were present only in three (Loktanella sp.COL-43,CFa)b)c)Figure 3Relative amount of DAPI-stained bacteria detected by FISH with probes for the Alphaproteobacteria (α),Beta-proteobacteria (β),Gammapro-teobacteria (γ),Cytophaga –Flavobacter group of Bacteroi-detes (CF),High GC Gram-positive bacteria (Actinobacte-ria,HGC),Low GC Gram-positive bacteria (Firmicutes,LGC),and Archaea.Data are averages across stations and depths.The percentage ofDAPI-stained bacteria detected with the probe for Eubacteria (EUB338)corresponds to the maximum bar height.Other EUB indicates cells detected with probe EUB338but not with any group-specific probe (other Eubacteria).a Results from all samples.b Results for individual stations.c Cluster analysisBacterioplankton Community at T erra Nova Bay (Antarctica)T able316S rRNA gene sequence affiliation to their closest phylogenetic neighbours of Antarctic isolatesOTU Accessionnumber Next relative by GenBank alignment(AN,organism)Origin of closestisolate/cloneHom(%)No.of isolatesMER SMN F AR TIB THS PTFAlphaproteobacteria(8.4%of total isolates)43HQ534317A Y771745,Loktanella salsilacus clone SE10Microbial mats inAntarctic lake991128A HQ534316A Y745834,Paracoccus sp.NPO-JL-65Seawater99125HQ534312A Y167261,Roseobacter sp.ANT9274Pack ice10012033 67HQ534319A Y576690,Roseobacter sp.14III/A01/004Marinebacterioneuston98111HQ534313AB099634,Sphingomonas xenophaga P1?10012352 20HQ534315SSP542658,Sulfitobacter sp.4318-8/2Seawater99111117HQ534314AF468357,Arctic sea-ice bacterium ARK10031Arctic sea-ice991 50HQ534318AF468373,Arctic sea-ice bacterium ARK10207Arctic sea-ice991 68HQ534354DQ906759,Antarctic bact.clone AntCL3C11Antarctic sea-ice99311A HQ534357DQ395932,.clone ctg_CGOF221?992Gammaproteobacteria(67.8%of total isolates)81HQ534326EU365494,Colwellia sp.BSs20010Arctic marinesediments98163HQ534324U85853,Glaciecola punicea ACAM611T Antarctic sea-ice99335HQ534322GQ149233,Pseudoalteromonas sp.ArcN81.11Arctic991040373154 62HQ534323A Y198113,Psychrobacter sp.HLA?99271 1HQ534320A Y167263,Psychromonas sp.ANT9282b Pack ice9984240604672 9HQ534321A Y167312,Psychromonas sp.ANT9282a Pack ice99172HQ534325SGU85907,Shewanella gelidimarina ACAM456Antarctic sea-ice991 Bacteroidetes(5.3%of total isolates)13HQ534328A Y694003,Bizionia algoritergicola AP A-1Maritime Antarctica97114 60A HQ534336A Y163576,Croceibacter atlanticus HTCC2559T Sargasso Sea96115HQ534329AB015262,Uncultured Cytophaga sp.JTB244Deep sea sediments9911 42HQ534334AF001367,Gelidibacter algens Antarctic sea-ice98140HQ534333A Y576655,Gillisia mitskevichiae strain KMM6034Seawater99333 16HQ534330A Y771712,Polaribacter irgensii?99160HQ534335A Y167320,Psychroflexus torquis ANT9268Sea ice99112HQ534327UBA440991,Antarctic bacterium R-8282Microbial mats inAntarctic lake96113 21HQ534331AF468277,Uncultured bact.clone ARKIA-137Pack ice991225HQ534332A Y285941,Flavobacteriaceae bact.G1712M2Southern Ocean991123HQ534355A Y165588,Arctic bact.clone ARKXV/1-145Arctic sea-ice961 Actinobacteria(16.7%of total isolates)44HQ534345AB245394,Aeromicrobium sp.Gsoil098Soil99127HQ534341X92492,Agrococcus jenensis?97661321 28HQ534342DQ366002,Arthrobacter sp.20/4Antarctic soil9951322 65HQ534347AJ717366,Citrococcus sp.AC7Alkaline environment99466HQ534348DQ448696,Dietzia J898Marine sediments99114HQ534339AJ438585,Leifsonia rubra clone SE44Arctic9911 33HQ534343A Y785738,Microbacterium oxydans OUCZ46PCB-contaminated site99146HQ534346DQ177472,Nocardioides sp.Tibet-IIR12Permafrost97234HQ534344A Y771765,Rhodococcus fascians clone SE59Arctic99148HQ534338DQ667082,Rhodococcus sp.E57Antarctic seawater991311 4HQ534337AF468438,Arctic sea-ice bacterium ARK10062Arctic sea-ice98169HQ534349AJ440992,Antarctic bacterium R-8287Microbial mats inAntarctic lake 9971193A.Lo Giudice et al.。
宁波北仑港冬季浮游细菌多样性研究
第28卷 第2期台湾海峡Vol .28, No .2 2009年5月JOURNAL OF OCE ANOGRAPHY I N T A I W AN STRA I T May,2009收稿日期:2008206202基金项目:国家自然科学基金资助项目(40776075);浙江省重大科技攻关项目(2006C13089)作者简介:刘兵(1983～),男,硕士研究生.通讯作者:李太武(1955～),男,教授,博士生导师;E 2mail:litai w u@nbu .edu .cn宁波北仑港冬季浮游细菌多样性研究刘 兵,李太武,苏秀榕,史西志,李登峰,杜莉利(宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室,浙江宁波315211)摘要:采用分子生物学方法对宁波北仑港冬季水体中的浮游细菌多样性进行了研究.提取水样中细菌基因组总DNA ,以细菌16S r DNA 通用引物进行PCR 扩增,扩增产物经分子克隆、测序与序列分析,对水样中的细菌建立了16S r DNA 克隆文库和系统发生树.结果表明,浮游细菌群落具有较高的多样性,34个克隆子分属2个不同的细菌类群,6个克隆子属于未知类群,优势细菌类群为Pr o 2teobacteria 类群(变形菌类群),占80%;细菌优势类群顺序为β2Pr oteobacteria 类群(32.5%)、γ2Pr oteobacteria 类群(25%)、α2Pr oteobacteria 类群(15%)、ε2p r oteobacteria 类群(7.5%)、Fir m icutes类群(厚壁菌类群)(5%).这一结果与近年来国内外有关港口微生物多样性的报道较为一致.用DNAStar 中Clustal w 程序从测序的40个克隆子中选出17个OT U 进行系统发育分析,同样表明浮游细菌多样性较强.关键词:北仑港;宁波;细菌多样性;16S r DNA中图分类号:Q 938.1文献标识码:A 文章编号:100028160(2009)022*******一个生态系统中的细菌多样性是这个生态系统的基本特征之一,是其适应性、稳定性和可持续性的重要的指示因子,也是环境质量的有效指标之一.然而,在相当长的一段时间内,人类对细菌多样性的认识和理解却往往受到传统的以细菌培养技术为基础的实验手段的缺陷所制约.依靠细菌培养的方法分离得到的细菌种类往往远小于其环境中真实的细菌多样性,据统计,一般水体的微生物只有0.1%～1%是可被培养的[1].而运用不依赖分离培养的分子生物学方法,通过分析环境样品的16S r DNA 克隆文库的序列,提交到Genk 2Bank 中,采用B last 程序与已知序列进行比对,对“可培养、不可培养的”微生物均能提供信息[2].限制性片段长度多态性(Restricti on Frag ment Length Poly mor phis m ,RF LP )[3]、末端限制性片段长度多态性(Ter m inal 2Re 2stricti on Frag ment Length Poly mor phis m ,T 2RF LP )[4]、变性梯度凝胶电泳(Denaturalizati on Gradient Gel Electr o 2phoresis,DGGE )[5]、温度梯度凝胶电泳(Te mperature Gradient Gel Electr ophoresis,TGGE )[6]等方法也常用来分析16S r DNA 克隆文库,但仍需与序列测定相结合.因此,随着DNA 测序费用的降低,直接建立16S r DNA 克隆文库进行序列测定和分析已经成为更有效的表征细菌多样性的手段.北仑港作为浙江省重要的港口,对促进经济发展起着至关重要的作用.近年来,由于船舶排放的废油、废渣、压舱水、以及港区排放的未经充分净化处理的生产废水和生活废水等对港口水域的生态环境与生态平衡造成了一定程度的影响.本文采用建立16S r DNA 克隆文库的方法,通过测序并与已知序列比较确定细菌种类,为研究北仑港环境污染,探索污染与细菌群落动态变化的关系等奠定基础.1 材料与方法1.1 材料2007年11月21日在宁波北仑港二期码头采集表层水样,使用有机玻璃采水器,灌入无菌的采样瓶中,于4℃保存不超过12h .PCR 扩增试剂、pMD182T 载体购自Takara 公司;PCR 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;台湾海峡28卷DNA 快速纯化试剂盒购自捷瑞生物工程上海有限公司.1.2 方法1.2.1 DNA 提取 取约2d m 3的海水,先以11μm 的核孔膜过滤海水,再以直径47mm 的0.22μm 的微孔滤膜富集微生物,并抽提基因组DNA [7].1.2.2 PCR 扩增及克隆 根据细菌16S r DNA 的保守序列,设计通用引物:16SF (5′2AG AGTTTG AT CCTG 2GCTCAG 23′)和16SR (5′2CCGTCAATT CCTTT RAGTTT 23′).PCR 扩增条件:95℃预变性4m in;94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸1m in,35个循环;72℃延伸10m in .25mm 3扩增反应体系:10×buffer 2.5mm 3,25mmol/d m 3MgCl 22.5mm 3,模板DNA 稀释100倍1mm 3,2.5mmol/d m 3dNTPs 2mm 3,10μmol/dm 3引物各1mm 3,1.0U /反应Taq DNAase,ddH 2O 补足至25mm 3.扩增产物用1.3%的琼脂糖凝胶电泳检测.割胶纯化PCR 产物,再与p MD182T 载体连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,涂板,37℃培养8～12h [8].1.2.3 测序与系统发育分析 随机挑选40个转化克隆子送上海英骏生物技术有限公司进行测序.用DNA Star 、MEG A3等软件对测序结果进行编辑、分析,并把编辑好的序列在Gen Bank 数据库中进行B last 同源性检索,获取同源性较高的相关菌株的16S r DNA 序列.通过DNAStar 中Clustal w 程序,按照最大同源性原则将代表不同OT U 细菌的17个序列进行排序,构建系统发育树.1.2.4 细菌多样性分析 采用Si m p s on 指数(D )计算物种的均度[9],公式如下:D =1-{[∑ni (n i -1)]/[N (N -1)]}其中,N 为样品中所有的克隆子,ni 为第i 个OT U 中的克隆子数.采用coverage (C )计算克隆文库的库容[10],公式如下:C (%)=[1-(n 1/N )]×100其中,N 代表16S r DNA 文库总克隆数,n 1代表在文库中仅出现1次的(operati onal taxonom ic unit,OT U )的数量.2 结果与分析2.1 细菌多样性理论上,当库容为100%时,表明克隆文库包括了该环境样品中的所有微生物种类.事实上,16S r DNA 克隆文库不可能达到这一指标.本研究中Si m p s on 指数为0.953,库容为90%,这表明文库的覆盖程度较高,文库具有较好的代表性,生物多样性信息较丰富.这反映出本文构建的克隆文库能比较真实代表北仑港冬季水层细菌的多样性.2.2 16S r DNA 克隆文库分析在构建的北仑港细菌16S r DNA 克隆文库中,从上千个转化子中随机挑选40个获得正确长度外源片段的克隆子进行测序,PCR 扩增得到900bp 左右的克隆DNA 片段,该片段包含16S r DNA 基因中C 1和C 2保守区以及D 1和D 2高变区.40个克隆转化子的16S r DNA 序列的B last 结果见表1.B last 比对结果表明,40个克隆子共有17种不同的序列,将序列相同的克隆子定义为一个操作分类单元(OT U ),即有17种OT U,每种序列代表的克隆子如表1第一列所示.这些克隆子与Gen Bank 数据库中已知细菌的16S r DNA 序列相似性最高为99%,最低为85%.其中3个克隆子(占7.5%)与已知序列相似性低于90%;将近一半的细菌(19个克隆子,占47.5%)与已知序列同源性低于97%.表明北仑港冬季浮游细菌具有较高的多样性,有待于进一步研究.水样中细菌主要属于红杆菌科(Rhodobacteraceae )、从单胞菌科(Coma monadaceae )、球衣菌属(Sphaeroti 2lus )、海单胞菌属(M arino m onas )、气单胞菌属(A ero m onas )、弓形杆菌属(A rcobacter )、破伤风杆菌属(C lostridi 2um )以及4种未获培养的细菌.其中,有7类OT U 与其最相似同源菌的相似度≥97%.2.3 系统发育分析基于所得序列及与它们最相近的已知序列的比较,构建了进化树,分属于6组不同的类群:α2Pr oteobac 2・812・ 2期刘 兵等:宁波北仑港冬季浮游细菌多样性研究teria 、β2Pr oteobacteria γ2Pr oteobacteria 、ε2p r oteobacteria 、Fir m icutes 、unknown Phylum (图1).在测定的40个克隆子中,32个克隆子属于Pr oteobacteria 类群(变形菌类群)(其中α2Pr oteobacteria 占15%,β2Pr oteobacteria 占32.5%,γ2Pr oteobacteria 占25%,ε2p r oteobacteria 占7.5%)、2个克隆子属于Fir m i 2cutes 类群(厚壁菌类群)占5%,6个克隆子与已知类群相似性较低,在GenBank 数据库中未找到与其相似的已知序列,属于未知类群,它们分别属于不同的OT U,与未获培养细菌uncultured bacterium (EF516433)、un 2cultured bacterium (DQ814953)、uncultured bacterium (EF379837)、uncultured bacteriu m (EF509843)的同源性分别为85%、94%、93%和92%.40个克隆子分别属于Pr oteobacteria 类群、Fir m icutes 类群,与已知细菌聚类在一起.其中的未知克隆子LB12聚类在Fir m icutes 与ε2p r oteobacteria 类群之间,与Fir m icutes 类群相对较近.未知克隆子LB3、LB9和LB16聚类在一起,与α2Pr oteobacteria 类群相对较近.3 讨论3.1 模板DNA 优化由于样品采自自然水域,不可能将浮游细菌与其它的超微型浮游生物(包括小型微藻、细菌、病毒等)分离,故而样品总DNA 中含有大量的其它非细菌类DNA 及少数难以通过常规的酚2氯仿2异戊醇抽提法除去的色素及蛋白,这些因子将极大地影响PCR 的扩增效率.用DNA 离心吸附柱过滤的方法对粗提DNA 进行纯化,以期尽可能除去其中的各类杂质.从测序和比对的结果可以看出,文库中还包括厚壁菌门等微生物类群,而这类细菌细胞壁较厚,通过物理方法一般较难裂解,表明本研究中采用的提取与裂解方法比较有效.3.2 系统类群本研究中获得细菌系统类群的最大特点是:Pr oteobacteria 类群(80%)占绝对的优势.这一结果与近年来国内外有关海港微生物多样性的报道较为一致.Zhang 等(2007)用16S DNA 2DGGE 和克隆文库方法分析了香港维多利亚港及其临近海域、河口的细菌多样性[11].结果表明,维多利亚港三个区域的细菌群落组成较为相似,α2Pr oteobacteria 类群所占比例最高,其次为Bacter oidetes (拟杆菌门),其它的Pr oteobacteria 亚类群次之.Toes 等(2008)对重金属污染的港口沉积物中的细菌多样性进行了研究,结果表明,在泥沙沉积物中,α2Pr oteobacteria 和γ2Pr oteobacteria 类群较为丰富[12].戴欣等(2008)通过构建并分析中国南海南沙海区沉积物中细菌16S r DNA 基因文库,对其遗传多样性进行了研究[13].发现沉积物细菌16S r DNA 基因主要来自Pr o 2teobacteria 的α2,β2,γ2亚群.本研究采自北仑港的表层水样的细菌多样性结果与上述港口沉积物中的细菌群落组成存在一定的差异.样品以及取样季节不同可能是导致细菌群落组成不同的主要原因.目前,16S r D 2NA 已被广泛地应用到海港沉积物的细菌多样性研究[12,14],但对海港水层的细菌多样性研究相对较少,本研究运用16S r DNA 克隆文库法进行了研究,得到了较为理想的结果.这方面的工作有待于进一步开展.开展港口水域细菌群落组成的研究,对港口的生物监测和生物修复,都有重要的理论意义与应用价值.・912・台湾海峡28卷文库中还发现了一些与未培养微生物同缘关系较近的克隆,这是一类目前认识不足的微生物类群,可能与特殊的微环境有关.3.3 系统发育在序列同源性研究中,一般认为细菌16S r DNA 序列同源性低于97%即属于不同的种[15].本研究构建的北仑港浮游细菌16S r DNA 基因文库和系统发育树,表明克隆库中47.5%的细菌(19个克隆子)与Gen 2・022・ 2期刘 兵等:宁波北仑港冬季浮游细菌多样性研究Bank 中已知细菌的16S r DNA 序列同源性低于97%,与发表在GenBank 数据库中的16S r DNA 序列表现出较大的差异(同源性仅为92%～96%),这些细菌在属种水平上完全不同.因此北仑港细菌多样性的研究有待于进一步深入,在未来的研究中还需要结合纯分离培养方法与其它分子生物学手段(如RF LP 、DGGE ),以验证和完善本研究的16S r DNA 克隆文库细菌多样性研究.参考文献:[1] Amann R I,Lud wigW ,Schleifer K H.Phyl ogenetic identificati on and in situ detecti on of individual m icr obial cells without culti 2vati on[J ].M i c r o b i o l R e v,1995,59(1):143～169.[2] Darby A C,B irkle L M ,Turner S L,et al .An aphid 2borne bacteriu m allied t o the secondary sy mbi onts of whitefly[J ].FE M S M i 2c r o b i o l Eco l,2001,36(1):43～50.[3] Ka waharasakiM ,M anome A,Kanaga w T,et al .Fl ow cyt ometric s orting and RF LP analysis of phos phate accu mulating bacteria inan enhanced bi ol ogical phos phorus re moval syste m [J ].W a te r Sc i Techno l,2002,46(122):139～144.[4] Hart m ann M ,W id mer F .Reliability for detecting compositi on and changes of m icr obial communities by T 2RF LP genetic p r ofiling[J ].FE M S M i c r o b i o l Eco l,2008,63(2):249～60.[5] Muyzer G,Teske A,W irsen C O,et al .Phyl ogenetic relati onshi p s of Thi om icr os p ira s pecies and their identificati on in deep 2seahydr other mal vent sa mp les by denaturing 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2li(Key Laborat ory of App lied Marine B i otechnol ogy of M inistry of Educati on,N ingbo University,N ingbo 315211,China )Ab s trac t:The bacteri op lankt on diversity in waters of Beilun harbor in Nove mber,2007,was studied using tech 2niques of molecular bi ol ogy .The cl one library of 16S r DNA and the phyl ogenetic tree were constructed with extrac 2ti on of bacterial DNA,PCR a mp lificati on of bacterial 16S r DNA by universal p ri m ers,molecular cl one,sequencing of 16S r DNA frag ments and sequence analysis .The results indicated that the bacterial diversity was high in that 34be 2l onged t o 2different published phyla and 6bel onged t o unknown phylum.The dom inant bacterial community was Pr oteobacteria,which accounted f or 80%of the t otal .The bacterial community successi on were listed as foll ows,β2Pr oteobacteria (32.5%),γ2Pr oteobacteria (25%),α2Pr oteobacteria (15%),ε2p r oteobacteria (7.5%)and Fir m i 2cutes (5%).The result was much consistent compared with the m icr oorganis m diversity data published home and a 2br oad in recent years .The phyl ogenetic results de monstrated higher bacterial diversity after 17OT U phyl otypes fr om 40sequenced cl ones were selected and analyzed with Clustal w of DNAStar Soft w are .Key wo rd s:Beilun Harbor;N ingbo;bacterial diversity;16S r DNA(责任编辑:霍湘娟)・222・。
海洋中的小世界浮游生物的微观奇观
海洋中的小世界浮游生物的微观奇观海洋中的小世界：浮游生物的微观奇观海洋是地球上最广阔的生态系统之一，其生物多样性之丰富令人称奇。
在这片广袤海域中，隐藏着无数微小却精彩的生命体，它们就是浮游生物。
本文将带您一同探索海洋中浮游生物的微观奇观。
一、浮游生物的定义与分类浮游生物是指生活在水中而无法独立游泳的微小生物。
它们无法对水流进行主动控制，而是被动地随着水流漂浮，因此得名浮游生物。
浮游生物的种类繁多，根据其大小和形态特征可以分为浮游动物和浮游植物。
1. 浮游动物浮游动物是指在海洋中以浮游生活方式为主的动物。
它们通常是单细胞或多细胞的微小生物，包括浮游幼虫、浮游浆虫、浮游甲壳动物等。
浮游动物的体型多样，有些仅有几微米大小，而有些可以达到几厘米，甚至更大。
浮游动物在海洋食物链中扮演着重要的角色，是海洋生态系统的基石。
2. 浮游植物浮游植物主要包括浮游藻类和浮游细菌。
它们通过光合作用吸收二氧化碳并释放氧气，在海洋生态系统中起到了重要的生态功能。
浮游植物的数量和分布对海洋生物的繁衍生息和氧气的供应都有着重要的影响。
二、浮游生物的生态功能浮游生物在海洋生态系统中具有重要的生态功能，对海洋环境和其他生物产生着积极的影响。
1. 食物链的基石浮游生物是海洋食物链的重要组成部分。
它们作为食物被其他海洋生物如鱼类、鲸类等摄取，进而影响整个食物链的运转。
同时，浮游生物也是海鸟、海洋哺乳动物等许多海洋生物的主要食物来源。
2. 氧气的供应通过光合作用，浮游植物可以吸收二氧化碳并产生氧气。
据统计，约有一半的地球上的氧气来自于浮游植物。
它们不仅为海洋生物提供了足够的氧气，也对整个地球的气候产生着重要的影响。
3. 养分循环和生物地球化学循环浮游生物参与了养分循环和生物地球化学循环的过程。
它们可以吸收溶解在海水中的无机和有机物质，将其转化为有机物并释放回海水中。
这一过程对海洋生态系统的平衡起着至关重要的作用。
三、浮游生物的微观世界尽管浮游生物微小，但其世界却充满了奇观和多样性。
海洋浮游病毒最主要的组成部分
海洋浮游病毒最重要的成分是噬菌体。
浮游病毒是指感染细菌的噬菌体，感染原核藻类的噬藻体，以及感染真核藻类的真核藻类病毒。
浮游病毒是指感染细菌的噬菌体，感染原核藻类的噬藻体，以及感染真核藻类的真核藻类病毒。
浮游病毒是指感染细菌的噬菌体，感染原核藻类的噬藻体，以及感染真核藻类的真核藻类病毒。
病毒的繁殖仍然依赖于rna。
首先，病毒应该寻找一个可以成功匹配它的宿主，入侵其他病毒或非病毒生物，用自己的rna 聚合酶或宿主rna 聚合酶转录或反转录rna，依靠宿主蛋白质作为原料，首先繁殖rna，然后合成蛋白质衣壳。
通过这种方式，一种新的病毒个体可以被合成。
然后，新病毒突破宿主细胞并传播，实现“自我复制”。
这种病毒的基因组比一些细胞生物的大，它的基因复杂性使得科学家怀疑它是否应该被归类为“无生命的”或“活的”。
Curtis sutler，海洋微生物学和环境病毒学专家，这项研究的第一篇论文的作者，不列颠哥伦比亚大学的教授，说: “我们通常认为病毒是小的，简单的有机体，只有几个基因。
然而，我们在这种病毒中发现的大量遗传机制，只能在活细胞生物体中找到。
它们需要很多基因来产生dna，rna，蛋白质和糖。
“研究结果发表在本周的美国国家科学院院刊上。
一般来说，病毒不能在活
的宿主细胞外自我复制，它们需要利用宿主提供的蛋白质进行复制。
自我复制是“无生命的”生物和“活的”生物之间的分界线。
然而，新发现的巨型病毒挑战了上述分类标准。
虽然它们仍然需要一个细胞来复制，但它们在自己的基因组中进行编码。
海洋蜉蝣病毒最主要的成分
海洋蜉蝣病毒最主要的成分
噬菌体。
海洋浮游病毒最重要的成分是噬菌体。
海洋病毒是一种具有超显微海洋环境的微生物，只含有一种类型的核酸（DNA或RNA）和寄生在专业活细胞中的非细胞形态。
它们可以通过细菌过滤器，在活细胞外具有一般的化学大分子特征，进入宿主细胞时具有生命特征。
海洋浮游病毒最重要的成分是噬菌体。
海洋病毒种类繁多，有形态多样性和遗传多样性。
海洋病毒在海水中的密度分布是近岸高，远岸低。
大部分在海洋透光带，随着海水深度的增加逐渐减少，在靠近海底的水层中有再次上升的趋势，其密度有时达到106~109个病毒颗粒（VPS）/ml。
比细菌密度高5~10倍。
海洋中的病毒可以感染多种海洋生物。
海洋噬菌体裂解死亡占外来细菌死亡率的60%。
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海洋浮游细菌研究1 引言海洋细菌是海洋生态系统中的重要组成部分，在海洋物质循环、能量流动以及生态调控等方面具有重要作用.海洋细菌的群落结构与种类组成直接影响整个海洋生态系统的健康发展，同时细菌群落结构又与其栖息的环境密切相关.海洋细菌的分类鉴定及其群落结构的分析方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类(金光，2011)，表型鉴定法包括细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平上的鉴定，分子遗传学鉴定法是在核酸水平上的鉴定，包括核酸杂交、PCR 技术、16S rRNA序列分析、全基因组测序等.变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技术最早是由Fischer和Lerman于1983年创立的，是根据在不同浓度的变性剂中DNA片段解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的片段分开.近年来PCR-DGGE技术已经广泛运用于细菌的群落结构分析中.大亚湾位于南海北部，是广东省重要的养殖基地，也是大亚湾核电站和惠州港所在地.由于近些年该海域污染日趋严重，海洋环境状况发生显著变化，浮游细菌群落结构也会发生明显变化.目前有关大亚湾浮游细菌方面的报道不多，尚未有浮游细菌DNA指纹及分子多样性方面的报道.为了了解大亚湾海域浮游细菌群落结构以及分子多样性，本文采集了大亚湾海域表层水样，利用PCR-DGGE技术对浮游细菌的DNA指纹进行了研究，以揭示DGGE技术等分子手段在浮游细菌群落结构多样性分析上的应用.2 材料与方法2.1 样品的采集与处理在广东省大亚湾海域设置的9个采样点(图 1).S1～S3位于大亚湾澳头海域，该海域毗邻惠州市澳头镇，是重要网箱鱼类养殖基地;S4～S6位于大鹏澳海域，该海域位于深圳市大鹏镇，湾内有鱼类和贝类养殖区，同时也是大亚湾核电站和岭澳核电站所在地;S7～S8位于大亚湾湾口，受到养殖和人类活动的影响较小.分别于2010年12月15日(2010年冬)、2011年6月8日(2011年夏)采集表层水样，每个采样点采集水样9 L，并在现场用中性鲁哥试剂固定.固定的水样先用孔径为10 μm网筛过滤，然后再依次用GF/A滤膜(Whatman)以及 0.2 μm 聚醚砜滤膜(Millipore)过滤，滤膜上的样品置于1.8 mL SET裂解缓冲液(20% 蔗糖，50 mmol · L-1 Tris-HCl pH 7.6，50 mmol · L-1 EDTA)中，储存在-20 ℃待分析.图1 大亚湾采样点的设置2.2 水环境因子的测定水温、盐度、电导率、溶解氧(DO)、pH值等理化因子通过采用美国YSI-561多参数水质分析仪进行现场测定，透明度用萨氏盘测定.2.3 DNA的提取及16S rRNA基因V3区的PCR扩增利用美国Omega公司细菌基因组DNA的提取试剂盒提取细菌基因组DNA，方法参照产品说明书.采用原核生物通用引物Eubac341F(5′-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)和Eubac517R(5′- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)对细菌rRNA基因16S V3区的保守序列进行PCR扩增(Muyzer et al., 1993; Celussi et al., 2008)，并在Eubac341F 5′端添加GC2夹子:5′- CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC-3′)，扩增体系为30 μL，扩增体系中各组分含量为别为：10×buffer 3 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各0.3 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 21 μL.PCR扩增反应程序：95 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，65~55 ℃ 30 s，72 ℃25 s每个循环降0.5 ℃，(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s)× 20个循环，72 ℃ 7min，4 ℃∞.扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行检测，用1×的gelgreen工作液进行胶前染色.2.4 DGGE分析取PCR产物30 μL，在Bio-Rad公司的DcodeTM通用突变检测系统对PCR产物进行DGGE分析，DGGE条件为：丙烯酰胺质量分数 8%，变性梯度40%～64%(100%的变性剂浓度为7 mol · L-1尿素和质量分数40%去离子甲酰胺)，并在上述两种凝胶液中分别加入100 μL 10%的过硫酸铵(ASP)和10 μL的四甲基乙二胺(TEMED).先用200 V预电泳20 min左右以去除胶空中的杂质，然后加入PCR产物样品，200 V电泳5 h.200 V电压电泳20 min，然后再用 200 V电压电泳5 h，缓冲液为1 × TAE，电泳结束后用超纯水冲洗两次，后置于1×SybrGreen工作液中避光染色30 min，用 Bio-Rad公司凝胶成像系统(GelDoc2000TM)进行拍照，DNA指纹图谱用Quantity one软件进行分析.2.5 数据分析与处理2.5.1 Shannon-Weaver多样性指数(H′)式中，n为每个泳道的条带数目，Pi=Ni/N，Ni为第i条条带的峰面积，N为该泳道所有条带的峰面积总和.2.5.2 Pielou均匀度指数(J)其中，H′为某泳道的Shannon-Weaver多样性指数，S为对应泳道的DNA指纹条带数.2.5.3 统计分析利用SPSS 18.0对冬季和夏季浮游细菌DNA指纹条带数、H′和J值进行显著性差异t检验，对DNA指纹条带数与环境因子进行Pearson相关性分析.3 结果3.1 水环境因子表 1列出了两次调查中大亚湾海域各站位的水环境因子，可以看出大亚湾海域水温较高，即使在12月份的冬季，水温仍可以达到20 ℃左右;夏季水温则高达29 ℃左右.各站位间水温差异不大，一般小于1 ℃.两次调查期间盐度相近，在33~34之间.冬季pH值略高于夏季，而DO 值和透明度则明显高于夏季.表1 2010年冬及2011年夏大亚湾海域水环境因子3.2 DGGE指纹图谱分析2010年冬季和2011年夏季大亚湾海域浮游细菌的DNA指纹图谱见图 2.结果显示，条带分离较好，冬季条带亮度较夏季弱，冬季浮游细菌丰度较低.从带型模拟图(图 3)中可以更清楚看到各站位浮游细菌DNA指纹图谱，冬季和夏季样品中分别共得到32条和33条条带.图2 大亚湾海域浮游细菌16S rDNA V3区DNA图谱(a. 2010年冬，b. 2011年夏)图3 大亚湾海域浮游细菌16S rDNA V3区DGGE图谱分析带型图(其中水平轴上的数字(1～9)为站点编号，百分比是与标准泳道的匹配度; 垂直轴上的数字为DNA条带编号(a. 2010年冬，b. 2011年夏))冬季样品共有的优势条带较多，如灰度较大的优势菌群条带1、2、5、8、10、11、12在各个站位均有出现，条带1和条带2为最为常见优势条带，条带11和12在S2以及S5~S8站位较为丰富(图 3a).以S7为标准，其余站位与之匹配度为49.8%~76.7%之间，位于大鹏澳海域的几个站位与S7的匹配度较高，而位于澳头海域的S1~S3与之匹配度较低，说明这两个海域浮游细菌存在一定空间异质性，但整体来说比较均一.夏季样品中共同的优势条带较少(图 3b)，条带2在每个站点均出现，且灰度值比较大，为优势菌群;但有些灰度值较大的条带(优势菌群)只在部分采样点出现，如条带3、10、21、31.以S3为标准，所有泳道与S3的匹配度差别不大，在60.0%~68.6%之间(图 3b)，说明夏季浮游细菌空间分布差异较低.3.3 浮游细菌DNA指纹多样性大亚湾海域浮游细菌DNA指纹条带数见图 4.各站位条带数变化不大，冬季为18~22条，平均为20条;夏季较高，为19~25条，平均为23条.夏季指纹条带数明显高于冬季(p<0.01).图4 大亚湾浮游细菌DNA指纹条带数与DNA指纹条带数不同，冬季DNA指纹的Shannon-Weaver多样性指数(H′)略高于夏季(p>0.05)，冬季和夏季H′值的变化范围分别为2.51~2.88和2.48~2.79;而均匀度(J)则在冬季明显较高(p<0.01)，冬季和夏季分别为0.83~0.93以及0.80~0.88.3.4 浮游细菌DNA指纹与环境因子的关系从浮游细菌与环境因子之间的相关关系可以看出，DNA指纹条带数与环境因子密切相关，其中与温度和盐度明显正相关(p<0.05)，而与pH、DO以及透明度明显负相关(p<0.05或p<0.01)，结果说明高温高盐可促进浮游细菌多样性，而pH、DO、透明度下降等水质恶化现象则可降低浮游细菌的种类丰富程度.H′值仅与J值呈明显正相关;而J则与水温明显负相关，与pH和DO明显正相关.各种环境因子之间几乎均呈现出明显的相关关系，其中水温与pH、DO、透明度均明显负相关(p<0.05或p<0.01)，说明夏季水质较冬季差;而DO又与pH和透明度明显正相关(p<0.01).图5 大亚湾浮游细菌DNA指纹的Shannon-Weaver多样性指数(H′)和PieLou均匀度(J)(a.H′，b. J)表2 浮游细菌DNA指纹及其多样性指数与环境因子的相关关系4 讨论4.1 大亚湾海域浮游细菌多样性浮游细菌种类丰富程度以及DNA指纹条带数与海域环境状况以及富营养化程度密切相关，在富营养化海区细菌丰度较高，但种类数和多样性下降.在本研究中，DNA指纹条带数与pH、DO以及透明度均呈明显的负相关关系，说明水质能影响浮游细菌的种类数.大亚湾海域浮游细菌种类较丰富，每个样品观察到的DNA条带数为18~25条，冬季和夏季分别检测到32和33条带.在同期的可培养浮游细菌调查中，共分离培养了70株菌株，根据16S rDNA序列分析，获得了35个不同序列，细菌种类数与本研究相近.大亚湾海域浮游细菌的DNA指纹条带数明显高于以往的研究报道，如黄海冷水团海域的浮游细菌DNA指纹条带数仅17条左右(刘敏等，2008)，东海长江口赤潮高发区各站位浮游细菌指纹条带数不超过20条，葡萄牙的Ria de Aveiro海域浮游细菌的条带数与本研究相近，为17~24条;而与地中海西北部海域浮游细菌的DNA指纹条带数相近，为26~36条.但是大亚湾海域浮游细菌的Shannon-Weaver多样性指数(H′)较低，平均仅为2.63，低于其他海域浮游细菌多样性指数，并且低于同期调查的本海域可培养浮游细菌的多样性指数.大亚湾海域DNA指纹条带较丰富，说明该海域物种数较丰富，但某些耐受能力较强的物种在数量上占据优势，致使细菌菌落结构多样性下降.从DNA指纹图谱和带型模拟图中也可看出，优势种类亮度较高，优势度明显.大亚湾海域曾被认为是我国近岸海域水质较好的港湾之一，但近年来富营养化程度明显上升，而且营养盐补充及时，初级生产力较高(孙翠慈等，2006).在近年来的浮游植物调查中，也发现大亚湾浮游植物种类丰富，数量较高，浮游植物种类多样性指数较低的现象.虽然夏季浮游细菌的DNA指纹条带数明显高于冬季，但冬季的种类多样性指数和均匀度指数略高于夏季.一般在温带海域浮游细菌季节变化明显，冬季细菌种类多样性和数量均明显低于夏季.大亚湾位于亚热带，全年平均水温在25 ℃以上，冬季水温也较高，即使在12月份水温也达到20 ℃左右.因此，浮游细菌的生长不会受到冬季低温的影响，但浮游细菌DNA指纹条带数仍与水温呈明显的正相关关系，而H′则与水温负相关，结果说明高温能促进细菌种类数，但种类多样性下降.大亚湾海域浮游植物群落结构与浮游细菌相近，同样是夏秋季节浮游植物种类丰富，数量较高，但是多样性指数较低;冬季虽然种类数下降，数量也同时下降，各物种分布更加均匀，种类多样性上升.而浮游细菌群落结构变化主要由水体中营养物质引起以及有机质有关，大亚湾属于一个封闭性养殖内湾，有机物质含量丰富，而冬季浮游植物高峰也为浮游细菌提供了丰富的有机质.4.2 DGGE技术在细菌群落结构研究中的应用DGGE技术能在一定程度上较全面反映浮游细菌群落结构，不能培养的细菌特别是未能培养的优势菌群能在DGGE图谱中得到反映.如与本研究同时采集的大亚湾水样，用培养法一个样品最多能培养出12个菌株(江晓亮等，2013)，而DGGE技术则能显示出18~25个条带.但是利用PCR-DGGE技术对细菌群落结构进行分析尚存在一些不足，在PCR-DGGE过程中，优势种对非优势种具有屏蔽作用，DNA样品中低于1%的种类无法在DGGE图谱中显现出来(Muyzer et al., 1993);而不同细菌之间基因的拷贝数以及基因组大小的差异性也会对细菌DNA指纹数及亮度产生影响，从而导致该技术对浮游细菌群落结构的评价产生偏差.此外PCR-DGGE技术不能对细菌进行准确的分类鉴定，仅能相对反映细菌的种类多样性.如果需要对细菌进行进一步分类鉴定，需要切胶测序.而且PCR-DGGE技术不能准确对细菌进行定量分析，DGGE条带的强弱程度只能表示不同种类的细菌之间的相对丰度.虽然本研究未对DGGE条带进行切胶测序，但在同期调查中对可培养细菌进行了16s rDNA 序列测定(江晓亮等，2013)，分析鉴定了35种可培养细菌，其中以α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和放线菌纲(Actinobacteria)为分离最多的两大类，此外还包括β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、盖球菌属(Kytococcus)以及间胞囊菌属(Intrasporangium)的菌株.由此可见，虽然PCR-DGGE技术在研究群落动态和多样性方面存在优势，但该技术无法给出细菌的代谢活性、数量和基因表达水平方面的信息，必须与其他技术相结合以弥补其本身的不足，如酶学分析均可以提供群落代谢活性特征，荧光原位杂交技术可以提供细菌的相对数量，而通过与荧光定量PCR结合，可以对群落的细菌数量进行定量分析.因此，PCR-DGGE技术与其他分类以及分子生物学技术结合后，可更好地反映海洋细菌群落结构与功能.具体参见污水宝商城资料或更多相关技术文档。