海洋浮游细菌研究

海洋浮游细菌研究

1 引言

海洋细菌是海洋生态系统中的重要组成部分，在海洋物质循环、能量流动以及生态调控等方面具有重要作用.海洋细菌的群落结构与种类组成直接影响整个海洋生态系统的健康发展，同时细菌群落结构又与其栖息的环境密切相关.海洋细菌的分类鉴定及其群落结构的分析方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类(金光，2011)，表型鉴定法包括细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平上的鉴定，分子遗传学鉴定法是在核酸水平上的鉴定，包括核酸杂交、PCR 技术、16S rRNA序列分析、全基因组测序等.

变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技术最早是由Fischer和Lerman于1983年创立的，是根据在不同浓度的变性剂中DNA片段解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的片段分开.近年来PCR-DGGE

技术已经广泛运用于细菌的群落结构分析中.

大亚湾位于南海北部，是广东省重要的养殖基地，也是大亚湾核电站和惠州港所在地.由于近些年该海域污染日趋严重，海洋环境状况发生显著变化，浮游细菌群落结构也会发生明显变化.目前有关大亚湾浮游细菌方面的报道不多，尚未有浮游细菌DNA指纹及分子多样性方面的报道.为了了解大亚湾海域浮游细菌群落结构以及分子多样性，本文采集了大亚湾海域表层水样，利用PCR-DGGE技术对浮游细菌的DNA指纹进行了研究，以揭示DGGE技术等分子手段在浮游细菌群落结构多样性分析上的应用.

2 材料与方法

2.1 样品的采集与处理

在广东省大亚湾海域设置的9个采样点(图 1).S1～S3位于大亚湾澳头海域，该海域毗邻惠州市澳头镇，是重要网箱鱼类养殖基地;S4～S6位于大鹏澳海域，该海域位于深圳市大鹏镇，湾内有鱼类和贝类养殖区，同时也是大亚湾核电站和岭澳核电站所在地;S7～S8位于大亚湾湾口，受到养殖和人类活动的影响较小.分别于2010年12月15日(2010年冬)、2011年6月8日(2011年夏)采集表层水样，每个采样点采集水样9 L，并在现场用中性鲁哥试剂固定.固定的水样先用孔径为10 μm网筛过滤，然后再依次用GF/A滤膜(Whatman)以及 0.2 μm 聚醚砜滤膜(Millipore)过滤，滤膜上的样品置于1.8 mL SET裂解缓冲液(20% 蔗糖，50 mmol · L-1 Tris-HCl pH 7.6，50 mmol · L-1 EDTA)中，储存在-20 ℃待分析.

图1 大亚湾采样点的设置

2.2 水环境因子的测定

水温、盐度、电导率、溶解氧(DO)、pH值等理化因子通过采用美国YSI-561多参数水质分析仪进行现场测定，透明度用萨氏盘测定.

2.3 DNA的提取及16S rRNA基因V3区的PCR扩增

利用美国Omega公司细菌基因组DNA的提取试剂盒提取细菌基因组DNA，方法参照产品说明书.采用原核生物通用引物Eubac341F(5′-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)和Eubac517R(5′- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)对细菌rRNA基因16S V3区的保守序列进行PCR扩增(Muyzer et al., 1993; Celussi et al., 2008)，并在Eubac341F 5′端添加GC2夹子:5′- CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC-3′)，扩增体系为30 μL，扩增体系中各组分含量为别为：10×buffer 3 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各0.3 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 21 μL.PCR扩增反应程序：95 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，65~55 ℃ 30 s，72 ℃25 s每个循环降0.5 ℃，(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s)× 20个循环，72 ℃ 7min，4 ℃∞.扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行检测，用1×的gelgreen工作液进行胶前染色.

2.4 DGGE分析

取PCR产物30 μL，在Bio-Rad公司的DcodeTM通用突变检测系统对PCR产物进行DGGE分析，DGGE条件为：丙烯酰胺质量分数 8%，变性梯度40%～64%(100%的变性剂浓度为7 mol · L-1尿素和质量分数40%去离子甲酰胺)，并在上述两种凝胶液中分别加入100 μL 10%的过硫酸铵(ASP)和10 μL的四甲基乙二胺(TEMED).先用200 V预电泳20 min左右以去除胶空中的杂质，然后加入PCR产物样品，200 V电泳5 h.200 V电压电泳20 min，然后再用 200 V电压电泳5 h，缓冲液为1 × TAE，电泳结束后用超纯水冲洗两次，后置于1×SybrGreen工作液中避光染色30 min，用 Bio-Rad公司凝胶成像系统(GelDoc2000TM)进行拍照，DNA指纹图谱用Quantity one

软件进行分析.

2.5 数据分析与处理

2.5.1 Shannon-Weaver多样性指数(H′)

式中，n为每个泳道的条带数目，Pi=Ni/N，Ni为第i条条带的峰面积，N为该泳道所有条带的峰面积总和.

2.5.2 Pielou均匀度指数(J)

其中，H′为某泳道的Shannon-Weaver多样性指数，S为对应泳道的DNA指纹条带数.

2.5.3 统计分析

利用SPSS 18.0对冬季和夏季浮游细菌DNA指纹条带数、H′和J值进行显著性差异t检验，对DNA指纹条带数与环境因子进行Pearson相关性分析.

3 结果

3.1 水环境因子

表 1列出了两次调查中大亚湾海域各站位的水环境因子，可以看出大亚湾海域水温较高，即使在12月份的冬季，水温仍可以达到20 ℃左右;夏季水温则高达29 ℃左右.各站位间水温差异不大，一般小于1 ℃.两次调查期间盐度相近，在33~34之间.冬季pH值略高于夏季，而DO 值和透明度则明显高于夏季.

表1 2010年冬及2011年夏大亚湾海域水环境因子