膜片钳技术
膜片钳实验与技术
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单击输入目录标题 膜片钳实验原理 膜片钳实验操作流程 膜片钳实验数据分析 膜片钳实验的应用实例
膜片钳实验的未来发展与挑战
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膜片钳实验原理
膜片钳技术的基本原理
膜片钳实验原理：通过玻璃微电极接触细胞膜，记录单一离子通道活动的 电位变化，从而研究细胞膜离子通道的特性。
膜片钳实验操作步骤
准备实验器材：包括膜片钳 放大器、微操纵器、微电极、
细胞夹持器等
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细胞贴片稳定：等待细胞贴 片稳定后，进行下一步操作
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开启膜片钳放大器：开启放 大器，调节放大器参数，确 保记录到有效的膜电流信号
数据记录：记录膜电流信号， 进行分析和处理
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新型膜片钳技术的研发，提高实验效率和准确性 应用人工智能技术，实现自动化数据分析与处理 结合其他技术手段，拓展膜片钳技术的应用领域 持续优化膜片钳设备，降低实验成本，提高普及率
膜片钳实验在多学科交叉中的应用前景
神经科学领域：研究神经元电活动与行为之间的联系 生理学领域：研究生物体的生理功能和机制 药理学领域：研究药物对细胞膜通道的影响和作用机制 生物医学工程领域：开发新型膜片钳技术，提高实验的灵敏度和特异性
膜片钳技术的特点：高灵敏度、高分辨率和高时间分辨率，能够记录单个 离子通道的活动。
膜片钳技术的应用范围：研究细胞膜离子通道的生理功能、药理作用和药 物作用机制等。
膜片钳实验的影响因素：电极内液的成分、温度、细胞内外的离子浓度和 pH值等。
膜片钳实验的应用范围
神经科学：研究神经细胞的电生理特性 药理学：药物对膜通道的影响 生理学：研究生物膜的离子通道功能 病理学：研究疾病状态下膜通道的异常变化
膜片钳技术参数
膜片钳技术参数一、膜片钳放大器系统（1）膜片钳放大器*1. 双电极膜片钳放大器用于细胞内和细胞外记录、膜片钳记录(全细胞、巨膜片、游离膜片)、电流测定法/伏安法、离子选择电极的测量、人工脂双层记录2. 电压钳模式下提供4种反馈电阻（50 MΩ、500 MΩ、5 GΩ、50 GΩ），可以测定0.2 pA～200 nA范围的电流。
电流钳模式下提供3种反馈电阻（50 MΩ、500 MΩ、5 GΩ），可以测定2 nA～200 nA 范围的电流。
3. 膜片钳放大器具有两个相同且独立的探头，为计算机控制，多数功能可通过点击鼠标而自动完成。
4. 全细胞膜电容补偿范围：Rf=500M时，Cm 1-100pF/Rs 400k-1000M串联电阻补偿范围：带宽：0.32-16kHz;校正值：0.4-1000M(500M时)5. 输出增益范围：主输出：1,2,5,10,20,50,100,200, 500, 1000, 2000；主输出滤波频率范围：4－极Bessel低通滤波(Hz)：2Hz-30kHz （2）数模转换器1转换器为即插即用型设备，能被Windows系统自动识别。
*2 为一台单独的仪器，不跟膜片钳放大器组合为一台仪器。
具有丰富数量的模拟/数字输入/输出端口，方便在软件中进行额外的附加控制。
3 16位高分辨率、低噪声转换器。
模拟信号输入通道数：8；模拟信号输出通道数：8；数字输出通道数：8。
4 采样速率：1 Hz - 500 kHz。
5 输入电阻: 1 MΩ；输入型号；TTL兼容制系统,方便外接其他刺激器，隔离器等。
输出电阻：< 0.5Ω6 输出电流：±4mA；数字化噪音< 1 mV7 系统自带消除噪音功能。
最大输入信号±10 V；消除最大噪音幅度20 V；噪音消除：线频率50Hz和谐波至10 kHz；取消相应时间< 1 s（3）记录和分析软件*1. 分析程序可对数据脱机处理，不需要使用密码锁2. 既包含采样程序又包含分析程序3. 膜测试功能在记录每条扫描线时可计算串联电阻Ra和膜电容4. 如果施加了漏减功能，则可同时自动记录下漏减前后的电流5. 在对每条扫描线进行记录时，可采用两个不同的采样频率进行6. 可以设置灵活的基础刺激和条件刺激方式用来不间断记录长时程增强效应和长时程抑制效应（LTP/LTD）。
膜片钳
㈢分析
1.事件检测方法——50％阈值检测法： 将阈值水平设在开放水平与关闭水平中间
2.单通道电流幅度和电导的分析 ➢目的：揭示通道的通透性机制；帮助区分通道的类 型、通道不同的亚单位组成以及突变等 ➢单通道电流的分析—— 幅度直方图 ➢单通道电导的计算 ⑴斜率电导：步阶电压（voltage step）；斜坡电压 （voltage ramp） ⑵拟合电流幅度直方图：高斯拟合
Rs的影响：使膜电位对命令电压的反应时间延迟；产生 电压降，影响钳制电位的数值；与膜电容形成一个单极 RC滤波器，限制了摄取电流信号的频带宽。
膜电阻（Rm）：指电流通过细胞膜时所遇到的阻力。 在静息状态下，Rm主要来自脂质双分子层的电阻。
3. 膜漏电流去除：
➢电容器（capacitor）：
被绝缘体隔开的两个导体 的组合，其储存电荷的能 力用电容（capacitance） 表示。
㈡ Ag/AgCl电极
Ag + Cl-
电子从Ag/AgCl 电极流向浴液
AgCl +e电子从浴液流向Ag/AgCl电极
➢长时间导通电流，AgCl会消耗掉，要定期镀AgCl： 含Cl-的溶液，长度为1～1.5cm
➢玻璃微电极尾端烧灼，防止AgCl被刮掉
电极电阻
二、封接
测试脉冲（20mV） 产生的电极电流
原因：离子通道的开放导致膜电阻迅速降低，电流 和电压的关系偏离了欧姆定律。
分外向整流和内向整流
外向整流：指随膜电位的去极化，I-V曲线靠近y轴
内向整流：指随膜电位的去极化，I-V曲线靠近x轴
（2）离子通道的激活（activation） （3）离子通道的失活（inactivation） 衰减（decay）：通道在激活因素持续存在条件下的 失活。用衰减的时间常数来表示 稳态失活（steady-state inactivaion）：反映通道 失活数目的电压依赖性，可用失活曲线表示 （4）通道失活后的恢复 通道失活后，必须将激活因素去除并维持一定时间， 才能使通道脱离失活状态，再次给予激活因素时通道 才能恢复开放。维持时间即通道失活后的恢复时间。 （5）离子通道的去激活（deactivation） 指在激活因素结束时通道的关闭过程，所记录到的电 流称尾电流。有些离子通道的尾电流也具有电压依赖 性，关闭过程呈指数分布。
膜片钳技术概述
2）屏蔽罩：用铜丝网制成，防止周围环境 的杂散点场对膜片钳放大器的探头电路的干扰。 有的膜片钳实验所测试的细胞或某种物质是光 敏感的，或者膜片钳实验是与光学测量联合进 行测需要采取光屏蔽，则屏蔽罩的外壁用黑色 布遮盖或在暗室里操作以减少强光的干扰。
2、光学部分
倒置显微镜 优点： 具有较好的视觉效果 便于将玻璃微电极与细胞的顶部接处。 具有较好的机械稳定性。
荧光染料Fu ra-2 可被紫外光激发发射出 荧光, 它可选择性地结合钙离子, 而与钙离子 结合的Fu ra-2 越多, 以相同紫外光激发出的 荧光就越弱, 因此可根据荧光强度的变化计算 出单位体积中钙离子浓度的变化。具体过程为: 在做全细胞记录之前, 以孵育或经电极扩散的 方法使荧光染料Fu ra-2 进入细胞, 然后对该 细胞内荧光强度、细胞膜离子通道电流及细胞 膜电容等多种指标变化情况进行观测,并分析 这些变化间的相互关系。
电极电容Cp极小，只有几各pF，相应的 电路时间常数甚小，因而对于Cp瞬态补偿称为 快电容补偿，细胞膜电容的值约为1µF／cm2， 由于此时的充电电流需要流经串联电阻Rs（Rs 的值约为几个兆欧），时间常数较大，故Cm 的补偿称为慢电容补偿。此外，串联电阻Rs因 跨接在Cp和Cm之间，当有电流经过时，将产 生可观的压降，如当Rs＝5MΩ ，I＝2mA时， 可导致钳制电位误差达10mV；消除这种误差的
3、电子部件：包括膜片钳放大器、刺激器、示
波器及记录系统。 膜片钳放大器：
是膜片钳实验中一个核心仪器，通过它 把生物电信号放大。从原理来说，膜片钳放大 器的探头电路即I-V变换器有两种基本结构形 式，即电阻反馈式和电容反馈式，前者是一种 典型的结构，但是相比较而言，后者降低了噪 声，所以特别适用超低噪声的单通道记录。
膜片钳技术及其应用
膜片钳技术可以用于研究细胞信号转导过程中离子通道和受体的变 化，了解信号转导的机制。
细胞功能调控的研究
膜片钳技术可以用于研究细胞功能调控的机制，例如细胞兴奋性的 调节和细胞内离子浓度的变化。
04 膜片钳技术的优势与局限 性
膜片钳技术的优势
高灵敏度
细胞无损
膜片钳技术具有高灵敏度，能够检测单 个离子通道的活动，从而提供关于细胞 膜电位和离子通道功能的重要信息。
膜片钳技术可以在保持细胞完整性的 情况下进行实验，不会对细胞造成严 重损伤或干扰细胞的正常功能。
实时监测
膜片钳技术可以对细胞膜电位进行实时 监测，从而了解离子通道的动态变化， 有助于深入理解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术的局限性
1 2 3
实验条件要求高
膜片钳技术需要高精度的实验设备和条件，包括 低温、低噪声和低阻抗等，这增加了实验的难度 和成本。
03
04
05
膜片钳放大器
微操纵器
细胞培养皿或显 微镜载玻片
电极溶液
细胞内和细胞外 灌流液
用于放大细胞膜电信号， 提高信号的检测灵敏度。
用于精确控制电极的移动 ，以便在细胞膜上定位和 进行膜片钳实验。
用于培养和固定细胞，以 便进行膜片钳实验。
用于填充电极，以保持电 极的湿润和导电性。
用于维持细胞内外环境的 稳定，并排除干扰实验的 物质。
03
在单细胞水平上研究细胞信号转导和离子通道功能，深入了 解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术与其他技术的联合应用
结合光学成像技术，利用膜片钳技术对神经元电生理特性进行同时监测和成像，实现多参数的同时测 量。
与基因编辑技术结合，利用膜片钳技术对特定基因表达的离子通道进行功能研究，深入了解基因与离子 通道的关系。
膜片钳技术原理
膜片钳技术原理膜片钳技术是一种常见的实验技术，广泛应用于生物学、药理学、细胞生物学等领域。
它是利用一种特殊的仪器，通过对细胞膜的控制和操作，实现对细胞内外环境的调控和研究。
膜片钳技术的原理主要涉及到膜片形成、膜片钳的构造和工作原理等方面，下面将对这些内容进行详细介绍。
首先，膜片的形成是膜片钳技术的基础。
膜片是由玻璃或石英毛细管制成的，其内外涂有一层导电性金属。
在形成膜片的过程中，需要将毛细管和细胞膜接触，利用毛细管的吸附作用将细胞膜抽附到毛细管上，形成一个微小的膜片。
这一步骤的关键是要保持膜片的完整性和稳定性，以确保后续实验的准确性和可靠性。
其次，膜片钳的构造是实现膜片钳技术的重要工具。
膜片钳通常由微操作系统、压力控制系统、电压控制系统等组成。
微操作系统用于控制膜片的形成和定位，压力控制系统用于控制膜片与细胞膜的接触压力，电压控制系统用于记录和调节膜片与细胞膜之间的电压变化。
这些系统的协同工作，使得膜片钳能够对细胞膜进行高度精准的操作和控制。
最后，膜片钳技术的工作原理是通过对膜片与细胞膜之间的接触和电学特性的测量，实现对细胞内外环境的调控和研究。
在实验中，可以通过改变膜片与细胞膜的接触压力和电压，观察细胞膜的电学特性和通透性的变化，从而研究细胞的离子通道、受体通道等功能。
同时，也可以利用膜片钳技术对细胞内外环境的离子浓度、pH值等进行精准调控，以研究细胞的生理和病理过程。
总之，膜片钳技术是一种重要的细胞生物学实验技术，其原理涉及膜片的形成、膜片钳的构造和工作原理等方面。
通过对这些原理的深入理解和掌握，可以更好地应用膜片钳技术进行细胞内外环境的调控和研究，为生物学、药理学等领域的研究工作提供重要的技术支持。
膜片钳技术
测试题：
1. 膜片钳的主要记录方式有哪几种，各
有何优缺点? 2. 什么叫整流，产生整流的原因是什么？
膜的被动反应
离子通道开放 膜的主动反应
外向整流
随膜电位的去极化，I-V曲线明显向Y轴（电流轴）靠 近。如IK电流。
内向整流
随膜电位的去极化，I-V曲线明显向X轴（电压轴）靠 近。如烟碱电流。
去极化方向
去极化方向
IK电流的外向整流
烟碱电流的内向整流
尾电流（Tail current）
指通道在激活因素结束时的关闭过程中，所记录
6. 基本概念及参数设置
输入漏电流（Input leakage current）
理论上讲，不施加外部命令时，通过放大 器探头的电流应该为0，如果由于放大器本 身的原因产生了电流，这就是漏电流。由于 放大器控制电流漂移的质量很高，一般漏电 流都很小。
封接电流（Seal current）
由于封接质量不高（没有形成良好的高 阻封接），从封接处产生的电流。成为噪 声。
第三部分
全细胞记录结果举例
+80mV
+40mV
0mV
-40mV
-80mV 200ms
Iso Hypo
Current Density (pA/pF)
-40
60
30
0 -80 0 -30 40 80
Voltage (mV)
-60
Iso 4 Iso 2 Hypo Hypo
Current (nA)
0
倒 置 相 差 显 微 镜
EPC-7膜片钳放大器(德国)
4. 膜片钳的记录方式及基本操作
细胞吸附式（Cell-attached
膜片钳技术及应用
制备玻璃微电极
拉制微电极 材料：硼硅酸盐毛细玻璃管。 要求：玻璃毛胚外径1.3~1.7㎜，内径1.0~1.2
㎜，壁的厚度在0.2㎜以上。管壁越厚，拉 制出的电极尖端管壁也越厚，电极的跨壁 电容就越小，噪声也就越低。
玻璃微电极及膜片的几何形状
电极拉制仪
拉制方法：两步拉制法。
第一步：使玻璃软化，并拉开一个距离，形 成一个细管，即拉制电极的颈部；
高阻封接形成的电流图
膜片钳技术四种基本记录模式
细胞吸附膜片(cell-attached patch) 将两次拉制后经加热抛光的微管电极置于
清洁的细胞膜表面上，形成高阻封接，在细 胞膜表面隔离出一小片膜，既而通过微管电 极对膜片进行电压钳制，高分辨测量膜电流， 称为细胞贴附膜片。由于不破坏细胞的完整 性，
膜片钳技术
向细胞内注射恒定或变化的电流刺激， 纪录由此引起的膜电位的变化，这叫做电流 钳技术。在具体实验中，可通过给予细胞一 系列电流脉冲刺激，诱发细胞产生动作电位。
电压钳技术是通过向细胞内注射一定的
电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流， 从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注 射电流的大小与离子流的大小相等、方向相 反。因此它可以反映离子流的大小和方向。
电极液的充灌
对于尖端较细的玻璃微电极，膜片钳实 验中常用的方法是：在微电极尾部施加负压 使尖端充灌电极内液，然后用注射器在微电 极尾部充灌电极内液，最后轻弹微电极杆步 使其内的气泡排出。
充灌长度为电极的1/3。
制备细胞标本
从理论上来讲，膜片钳实验用的细胞标 本可来自体内各种组织细胞，只要细胞表面 光滑，能与微电极尖端形成高阻封接即可。 但在标本制备上，不同组织细胞间联接牢固 程度不同，采用的分离方法也不完全相同。 大体上包括冲洗、酶解消化或机械分离以及 清洗等步骤。
膜片钳记录法
膜片钳记录法（Patch Clamp Recording）是一种生理学实验技术，用于测量细胞膜离子通道或受体的电生理特性和活动。
该技术的基本原理是使用微型玻璃电极将一个非常小的玻璃管（称为膜片）贴附到单个细胞的表面上，从而形成一个微小的、高阻抗的突触点。
然后在膜片和细胞膜之间形成一个密封，并使用微电极或电极芯片记录跨越这个突触点的电位变化。
这种技术可以测量非常小的电流变化（尤其是亚毫安级别），因此非常适合研究离子通道和受体的活动。
通过控制细胞环境的情况，例如改变温度、pH值或添加化学物质，可以进一步调节离子通道和受体的电生理属性及其响应模式。
这种方法还可以用于研究各种细胞类型的电生理特性，包括神经元和心肌细胞等。
膜片钳记录法是一种十分精密的技术，在操作过程中需要非常小心谨慎，以避免损坏细胞或膜片。
同时，该技术需要一定的专业知识和设备支持，因此通常由有经验的生理学家和技术人员来执行。
总之，膜片钳记录法是一种重要的电生理技术，已经成为研究离子通道和受体的电生理学特性的关键工具之一，对于揭示神经、心血管等多种疾病的发病机制和治疗方法也具有重要意义。
膜片钳实验与技术
汇报人：
通过施加电压或 药物刺激可以观 察到离子通道的 开放或关闭状态 从而了解离子通 道的电学特性和 药理学特性。
膜片钳实验原理的 应用广泛可用于研 究药物对特定离子 通道的作用机制和 效果以及研究细胞 生理和病理过程中 的离子通道变化。
准备实验器材：包括膜片钳放大器、微电极、细胞、溶液等
制作细胞膜片：使用微操纵器将微电极置于细胞膜表面形成封 接
膜片钳技术的未 来发展方向
神经科学：研究神经元电活动与行为之间的关系 药理学：筛选和验证药物作用靶点及效果 生理学：研究细胞生理功能及信号转导机制 病理学：探究疾病发生发展过程中细胞电生理变化
PRT THREE
膜片钳技术是通 过玻璃微电极记 录细胞膜单一离 子通道活动的技 术。
膜片钳实验原理 基于膜片钳夹持 技术能够将细胞 膜的某一离子通 道单独夹持在玻 璃微电极之间。
膜片钳技术将进一 步应用于研究神经 元功能和药物作用 机制
膜片钳技术有望在 基因治疗和细胞疗 法等领域发挥重要 作用
膜片钳技术将与新 型技术相结合提高 实验效率和精确度
膜片钳技术将为研 究生物电信号和离 子通道提供更深入 的见解
挑战：高精度的测量和控制技术 挑战：细胞类型特异性标记和分离技术 展望：结合新技术实现更高效和准确的膜片钳实验 展望：拓展膜片钳技术在生物医学领域的应用范围
膜片钳技术用于筛 选潜在药物候选物
膜片钳技术用于研 究药物对神经元信 号转导的影响
膜片钳技术用于研 究药物对心血管系动化与智能化：提高实验效率和准确度 新型材料的应用：提高膜片钳技术的稳定性和可靠性 跨学科融合：与其他领域的技术相结合拓展应用范围 标准化与规范化：推动膜片钳技术的普及和推广
PRT FIVE
膜片钳技术
膜片钳技术膜片钳技术是一种用于夹持和夹持薄膜材料的高精度工具。
它被广泛应用于各种领域，包括医疗、电子、航空航天、光学等。
本文将介绍膜片钳技术的原理、应用、优势和未来发展方向。
膜片钳技术的原理是利用薄膜的柔性和弹性特性，将其夹持在两个夹持片之间，通过施加适当的压力来固定和控制膜片。
它的结构简单，通常由两个平行的金属夹持片组成，夹持片之间有一层薄膜，可以是金属、塑料或橡胶材料。
膜片钳技术在医疗领域中广泛应用于微创手术。
它可以用于夹持和处理各种组织样本，如血管、肾脏、肺部等。
膜片钳可以通过精确控制夹持力来保护脆弱的组织，减少手术风险和创伤。
此外，膜片钳还可以用于制作微小的缝线和缝合器，用于手术缝合和内脏重建。
在电子领域，膜片钳技术用于处理和夹持微小的电子元件。
由于膜片钳的夹持力可调节且均匀，它可以用于精确地定位和安装电子组件，确保元件之间的准确对齐和联系。
此外，膜片钳还可以用于处理柔性电路板和柔性显示屏等薄膜电子产品，保证其完整性和性能。
在航空航天领域，膜片钳技术用于夹持和固定航天器表面的绝热膜。
夹持膜片的合适压力可以确保膜片与表面的紧密贴合，提供良好的隔热性能，减少航天器受到的热能损失。
此外，膜片钳还可以用于夹持航天器的其他部件和设备，确保它们在运行过程中的稳定性和可靠性。
在光学领域，膜片钳技术用于夹持和夹持光学元件，如透镜、棱镜和滤光片。
膜片钳的夹持力和表面平整度可以确保光学元件的精确定位和对准度，从而提供高质量的光学性能和成像效果。
此外，膜片钳还可以用于夹持光学材料的样本，如光学薄膜和光学纤维，用于实验和测试。
膜片钳技术具有许多优势。
首先，它具有高精度和可调节的夹持力，可以适应不同材料和应用的要求。
其次，膜片钳结构简单，易于制造和操作。
此外，膜片钳具有快速响应和高灵敏度的特性，可以快速调整和控制夹持力。
最重要的是，膜片钳技术可以保护薄膜材料的完整性，减少损伤和污染的风险。
未来，膜片钳技术有许多发展方向。
膜片钳技术及其在神经科学研究中的应用
膜片钳技术及其在神经科学研究中的应用膜片钳技术是一种在神经科学研究中广泛应用的技术，它可以用来记录和操纵神经元的电活动，为研究神经系统的功能和疾病提供重要的工具。
本文将介绍膜片钳技术的原理和应用，并探讨其在神经科学研究中的重要性。
膜片钳技术是一种通过在神经元的细胞膜上形成一个微小的孔洞，并利用微电极记录神经元内外的电位差的方法。
这种技术可以精确地记录神经元的动作电位，从而了解神经元的兴奋性和抑制性。
膜片钳技术的原理基于电生理学的基本原理，即神经元的电活动是由离子通道的开关控制的。
通过在神经元膜上形成一个微小的孔洞，可以通过微电极记录到神经元内外的电位差，从而了解离子通道的开关状态和神经元的电活动。
膜片钳技术在神经科学研究中有广泛的应用。
首先，它可以用来研究神经元的膜电位和动作电位。
研究人员可以通过在神经元膜上形成一个微小的孔洞，并利用膜片钳记录到神经元内外的电位差，从而了解神经元的电活动。
这对于研究神经元的兴奋性和抑制性非常重要，有助于理解神经元的工作原理和信息传递过程。
膜片钳技术还可以用来研究离子通道的功能。
离子通道是神经元膜上的蛋白质通道，它们控制着离子在神经元膜上的通透性，从而调节神经元的电活动。
通过利用膜片钳技术，研究人员可以记录到离子通道的电流，并分析离子通道的开关状态和功能特性。
这对于研究离子通道的结构和功能非常重要，有助于揭示离子通道与神经系统功能和疾病之间的关系。
膜片钳技术还可以用来研究突触传递和突触可塑性。
突触是神经元之间的连接点，通过突触传递神经信号。
膜片钳技术可以用来记录到突触传递的电位变化，并研究突触的功能特性和可塑性。
这对于理解神经系统的信息传递和学习记忆等高级功能非常重要。
在神经科学研究中，膜片钳技术的应用还包括单细胞蛋白质表达、药物筛选和基因编辑等方面。
通过将膜片钳技术与其他技术结合，研究人员可以进一步探索神经系统的功能和疾病机制，为神经科学研究提供更加全面和深入的理解。
膜片钳
在神经肌肉接头兴奋传递中应用膜片钳的原因
神经传递是神经元通过化学信号传递信息的过程，在与靶细胞的突触接触中， 反应时间快。 因此，突触传递需要广泛蛋白质的协调活动。 这些蛋白质调节突 触功能的许多方面，包括：突触形成，神经元和肌肉兴奋性，钙信号，突触小 泡循环（胞吐作用和内吞作用）受体组装，定位和功能。 可以使用各种电生理 技术测量在突触处发生的电位变化，量化潜在的突触活动，通过将该技术与鉴 定突触蛋白的分子和遗传机制的工具相结合，我们可以了解该过程精确和精确 度的分子机理。
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接头处兴奋传素的影响 • 神经肌肉接头处兴奋传递与在神经纤维上的兴奋传导不 同，后者是在一个细胞上的电传导，前者则是在两种细 胞间信号的传递。这个过程为“电-化学-电”的传递，即 神经末梢的动作电位引起化学物质乙酞胆碱的释放，进 而触发骨骼肌的动作电位。
膜片钳技术应用于神经肌肉接头兴奋的传递研究
膜片钳技术
Patch clamp technology
neuromuscular junction of C. elegans
线虫神经肌肉接头兴 奋传递研究中的应用
李 蓉
目录
膜片钳技术原理 膜片钳记录形式 神经肌肉接头 举例说明实验结果 技术的优缺点
膜片钳技术
膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积 为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与 细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他 部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸 管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强 度，就代表单一离子通道电流。 膜片钳技术的基本原理是通过负反馈使得膜电位与指令电压 相等，在电压钳制的条件下记录膜电流。
膜片钳技术及应用
膜片钳技术及应用膜片钳技术及应用是一种常见的力学装置，由薄膜片、夹持手柄和支撑结构组成。
膜片钳可用于夹持和固定物体，并且在广泛的领域中有着重要的应用。
下面将对膜片钳的技术原理和应用领域进行详细介绍。
膜片钳的技术原理主要基于材料的力学性质。
一般情况下，膜片钳采用弹性薄膜片作为夹持物体的夹持部分。
当施加外力使薄膜片发生形变时，薄膜片会产生力与形变量成正比的特性，这种力被称为弹性力。
通过调整薄膜片的形变程度和位置，可以达到对不同物体的夹持和固定的目的。
膜片钳的应用领域非常广泛。
以下是一些常见的应用领域：1. 医疗行业：膜片钳被广泛用于医疗器械的设计和制造。
例如，在手术中，膜片钳可以用于夹持和固定组织、血管和器官，以便医生进行手术操作。
膜片钳的特点是夹持力均匀，不会损伤组织和血管。
2. 实验室研究：膜片钳在实验室研究中也有广泛的应用。
例如，在细胞学研究中，膜片钳可以用于夹持、拉伸和操纵细胞，以研究细胞的力学特性和细胞间的相互作用。
此外，膜片钳还可以用于微流体实验中的液滴操纵和胶体粒子的固定。
3. 微机电系统（MEMS）：膜片钳是制作微机电系统中常用的工具。
在MEMS 器件制造过程中，需要对微米级物体进行精确操纵和固定。
膜片钳结构简单，加工工艺成熟，可以实现对微米级物体的夹持和固定。
4. 机械制造：膜片钳在机械制造过程中也有重要的应用。
例如，在精密加工中，膜片钳可以用于夹持和固定零件，以确保加工精度。
另外，膜片钳还可以用于装配过程中的夹持和定位。
总的来说，膜片钳技术及其应用在医疗、实验室研究、微机电系统和机械制造等领域起到了重要的作用。
膜片钳具有结构简单、操作方便、夹持力均匀等特点，使其成为一种广泛使用的力学装置。
随着科技的不断发展，膜片钳的应用领域还将不断扩大，为各个领域的科研和应用带来更多的便利和可能性。
膜片钳技术原理及相关基本知识
膜片钳技术可以用于研究内分泌系统的电生理特性，了解激素分泌的 调节机制。
其他领域的应用
肿瘤学研究
膜片钳技术可以用于研究肿瘤细胞的 电生理特性，了解肿瘤的发生和发展 机制。
免疫学研究
膜片钳技术可以用于研究免疫细胞的 电生理特性，了解免疫反应的调节机 制。
THANKS
感谢观看
膜片钳技术可以用于药物筛选， 快速筛选出具有潜在治疗作用的 药物。
膜片钳技术可以用于研究药物对 离子通道的影响，了解药物的副 作用和不良反应。
生理学领域的应用
心血管系统研究
膜片钳技术可以用于研究心血管系统的电生理特性，了解心脏和血 管的电活动和功能。
呼吸系统研究
膜片钳技术可以用于研究呼吸系统的电生理特性，了解呼吸肌的电 活动和功能。
膜片钳技术的应用领域
生理学研究
研究细胞膜离子通道的电生理 特征和功能，揭示生理状态下
细胞膜电活动的规律。
药理学研究
研究药物对离子通道的作用机 制和效果，为新药研发提供实 验依据。
神经科学研究
研究神经元和神经网络的电活 动和信息传递机制，揭示神经 系统的工作原理。
疾病机制研究
研究疾病状态下细胞膜离子通 道的异常变化，为疾病诊断和
数据采集
使用膜片钳系统记录细胞膜 电位变化，通过放大器和记 录器获取数据。
数据筛选
排除异常或噪声数据，确保 数据质量。
数据转换
将原始数据转换为适合分析 的格式，如电压值或电流值 。
数据分析方法
统计分析
对数据进行统计分析，如平均值、标准差、相 关性等。
频谱分析
对数据进行频谱分析，以了解信号的频率成分。
膜片钳技术适用于多种细胞 类型，包括神经元、肌肉细 胞、上皮细胞等，具有广泛 的应用范围。
细胞电生理学与膜片钳技术ppt课件
CCD Camera
Vibration Isolation Table
Micro-Manipulators Remote Controller
Electrophysiology-Apparatus
DAD-VC system
MicroManipulators
CCD Camera
Electrophysiology-Apparatus
钠通道 钙通道 钾通道
神经类钠通道 骨骼肌类钠通道 心肌类钠通道(持久、瞬时)
L-型（心肌窦房结、房室结）；T-型（心脏传 导组织）；N-型（中枢神经系统神经元和突 触部位）；P-型（大脑）；Q-型（小脑、海 马、脊髓）；R-型（神经细胞）
瞬时外向钾通道 (Ito) 延迟整流钾通f)
失活 状态
Inactive
state
复活
recovery 静息 状态
resting state
二、门控特性(Gating)：
失活状态不仅是通道处于关闭状态， 而且只有在经过一个额外刺激使通道从 失活关闭状态进入静息关闭状态后，通 道才能再度接受外界刺激而激活开放。
失活
inactivation
开放 状态
心血管系统主要有: 1.乙酰胆碱激活钾通道(KACh)：参与迷走调控。 2. ATP敏感钾通道(KATP)：心肌缺血、缺氧开放。 3.钙激活钾通道(KCa)：参与血管张力调控。
配体门控离子通道
KACh
KCa
ACh作用于M受体 去极化、[Ca2+]i↑
KATP
细胞内 ATP/ADP↓
增加舒张电位 复极化或超极化 缩短动作电位时程
细胞上，当钙通道尚未激活时，钠通道已经失活。 ➢ 对离子的选择性较低：在细胞外Ca2+浓度（[Ca2+]o）下降
膜片钳重点技术原理与基本操作
膜片钳技术原理与基本操作1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道旳离子电流来反映细胞膜上单一旳或多数旳离子通道分子活动旳技术。
1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验措施和电子线路进行了改善，形成了当今广泛应用旳膜片钳实验技术。
该技术可应用于许多细胞系旳研究，也是目前唯一可记录一种蛋白分子电活动旳措施，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大旳迈进动力，这一伟大旳奉献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。
一、膜片钳技术旳基本原理用一种尖端直径在1.5~3.0μm 旳玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上旳阻抗封接，此时电极尖端下旳细胞膜社区域（膜片，patch）与其周边在电学上分隔，在此基本上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上旳离子通道旳离子电流进行监测及记录。
基本旳仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。
膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录旳核心设备，具有高敏捷度、高增益、低噪音及高输入阻抗。
膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制旳同步记录离子流经通道所产生旳电流。
膜片钳放大器旳核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成旳电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定旳水平上。
二、操作环节1.膜片钳微电极制作(1) 玻璃毛细管旳选择：有二种玻璃类型，一是软质旳苏打玻璃，另一是硬质旳硼硅酸盐玻璃。
软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可减少电极旳串联电阻，对膜片钳旳全细胞记录模式很有利；硬质玻璃旳噪声低，在单通道记录时多选用。
玻璃毛细管旳直径应符合电极支架旳规格，一般外部直径在1.1~1.2mm。
膜片钳技术及应用
膜片钳技术的应用领域
神经科学
研究神经元离子通道与动作电 位的产生和传播，以及药物对
神经元功能影响。
心血管
研究心脏离子通道与心律失常 的关系，以及抗心律失常药物 的作用机制。
药理学
研究药物对离子通道的作用机 制和效果，以及新药的开发和 筛选。
其他领域
膜片钳技术还可应用于内分泌 、免疫等领域，研究相关细胞
利用膜片钳技术，可以研究神经元在长期和短期内的电生理变化，了 解学习、记忆等认知过程的神经机制。
药物筛选与开发中的应用
药物作用机制的研究
膜片钳技术可以用于研究药物对离子通道或受体电流的影响，从 而揭示药物的作用机制。
药物筛选
通过膜片钳技术，可以在细胞或组织水平上快速筛选出具有特定 药理作用的药物候选物。
物或其他因素对细胞膜功能的影响。
03 膜片钳技术的应用实例
神经科学研究中的应用
神经元电活动的记录
膜片钳技术可以用来记录单个神经元在静息状态和刺激下的膜电位 变化，从而研究神经元的兴奋性和电生理特性。
突触传递的研究
通过膜片钳技术，可以记录突触后电位，研究神经递质释放、受体 激活和信号转导等过程。
神经可塑性的研究
在医学诊断与治疗中的应用
疾病诊断
膜片钳技术可用于检测细胞膜离子通道的异常变化，从而对某些 疾病进行早期诊断，如癌症、神经退行性疾病等。
药物研发
通过膜片钳技术可以研究药物对离子通道的作用机制，为新药研发 提供有力支持。
个体化治疗
根据患者的离子通道基因变异情况，膜片钳技术可以为个体化治疗 提供精准的用药建议。
高通量与高灵敏度
通过改进膜片钳技术的设计和材料，有望实现高通量和高灵敏度的检测， 从而能够同时记录多个细胞或同一细胞的不同活动，提高实验的效率和 精度。
膜片钳技术
配体门控性离子通道（ligand-gated ion channel）
电压门控性离子通道（voltage-gated ion channel）
离子通道开关要经过三种以上状态转换：
（二）两个重要的方程：
HUST
Ohm’s law：
I=gE or E=IR or I=E/R
Nernst equation：
HUST
Cell-attached configuration
电极仅与细胞膜很小部分形成Giga-seal,不 损害细胞膜的完整性;
用于单通道记录（single-channel recording) 某一特定的离子通道 细胞不同部位的电流
内面向外式：
HUST
Inside-out configuration
Vh=-80mv Vt=-40mv Unitary
current=2.2pA
2. K+通道电流记录：全细胞记录HUST
K+通道电流记录：单通道记录HUST
Cell-attached
1 pA
Inside-out
0
50
100
150 0
50
100
150
Time (ms)
Time (ms)
3. Ca2+通道电流记录：全细胞记录HUST
电压门控（依赖性）离子通道
3. 膜片钳技术 HUST
Patch-clamp techniques
1980年前后，Neher and Sakmann实验室发明 膜片钳技术，引发电生理 技术一次革命性的突破:
封接阻抗: Giga-seal GΩ级 （109 Ω)
记录电流：pA级（10-12A)
Neher and Sakmann 获1991年诺贝尔生理学或医
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膜片钳技术
1、膜片钳技术原理
膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。
膜片钳的基本原理则是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。
膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达10～100 GΩ(此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻)。
由于此阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零，形成高阻密封的力主要有氢健、范德华力、盐键等。
此密封不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是较牢固的。
又由于玻璃微电极尖端管径很小，其下膜面积仅约1 μm2，在这么小的面积上离子通道数量很少，一般只有一个或几个通道，经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少，可以忽略，也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略，那么，只要保持电极内电位不变，则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变，从而实现电位固定。
膜片钳技术的原理图[51]
Rs是与膜片抗阻串联的局部串联电阻（或称入路阻抗），Rseal是封接阻抗。
RS通常为1~5MΩ，如果Rseal高达10GΩ以上是成为Ip/I=Rseal/(Rs+Rseal)-1。
此Ip可作为I~V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻（Rf）的电压下降而被检测出。
实际上这是场效应管运算放大器（A1）的输出中包括着膜电阻成分，这部分将在通过第二级场效应管运算放大器（A2）时被减掉。
本实验采用的是全细胞记录模式。
全细胞记录构型(whole-cell recording)高阻封接形成后，继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂，电极胞内液直接相通，而与浴槽液绝缘，这种形式称为“全细胞”记录。
它既可记录膜电位又可记录膜电流。
全细胞记录模式是向膜片电极施加正压同时使电极尖端接近细胞表面。
此时，将电位固定在0mV，连续给与强度为1mV，间期为10~20ms的去极化或超极化脉冲波，并对此时的电流变化进行监视。
当电极尖端接近细胞表面时，可以看到应答脉冲波的电流减小。
这是将电极内压从正压转变为弱的负压，从而使电流进一步减小，即在电极尖端和细胞膜之间形成了阻抗高的封接。
如将固定电位像负电压侧移动，则可以促进封接的形成。
当将固定电位调到细胞的静息膜电位近傍时，如果流动的电流大致上成为零时，脉冲波波幅增大，把电流测定增益提高就可测定封接电阻。
密闭封接形成之后，封接电阻可达10GΩ以上，这时观测到的电流是单一离子通道电流，他是判断电极阻塞或者已形成很好的密闭封接的良好指标。
与脉冲波向上或向下浮动时，可测定出一过性电流[52]。
2、全细胞记录的程序
（1）玻璃微电极的拉制
拉制微电极用的玻璃毛胚外径在1.5mm，内径在0.86mm，用PB-7电极拉制器分两步进行拉制而成。
第一步热力为13.5时可使玻璃软化，并拉开一个距离，形成一个细管，第二步用热力为9.4拉断电极细管部，成为两个基本相同的玻璃微电极，此步控制电极的尖部。
由于玻璃电极尖端易于粘附灰尘，因此要求现用现拉制。
（2）玻璃微电极的充灌
充灌前，电极内液必须用微孔滤膜（0.2um）进行过滤，目的是除去妨碍巨阻抗封接形成的灰尘。
用1ml注射器在玻璃微电极尾部充灌电极内液，
最后轻弹微电极杆部将其内的气泡排出。
电极内液不可充灌过多，能使Ag/AgCl电极丝达到能与电极内液相接触的长度即可。
过多的电极内液可能会溢出污染电极夹持器，从而增大记录噪声，也可能会增大导电半径（与Ag/AgCl电极丝相比），从而使电极电容增加，同样会增大记录噪声。
将充灌好电极内液的玻璃微电极连接在I-V转换器的电极支架上，确保电极支架的测量电极浸泡在电极内液中。
（3）灌流系统
将消化下来的细胞种在22mm的圆形玻片上，待细胞贴壁之后（约30min），用非熔性油脂（RS Components,Northlands，UK）将圆形玻片贴附在特制的灌流槽中，再将灌流槽安装在倒置显微镜下观察。
灌流槽的容积是0.5ml，各种灌流液安装在倒置显微镜旁边的铁架台上，与有精确刻度、可以调速的静脉输液器相连接，这部分作为灌流系统中的流入系统；流出系统是通过真空抽气泵完成的，通过真空抽气泵的抽吸，将灌流槽中的液体抽吸出来。
（4）高阻抗封接的形成
在实验准备工作就绪之后，就可以进行实验操作了。
首先将膜片钳放大器的记录调到SEARCH档，用2mV电压脉冲，在示波器上观察电极电流。
由于浴池内的浴液表面是相当的肮脏，故使电极内有液体从电极尖端流出，直至电极与细胞接触，为了避免此情况，可以用注射器对电极轻轻加以小正压，而且电极进入液面后，在没有形成封接之前，不要移出液面。
在微电极入水之前，示波器上的电流呈现一条直线微电极入水之后，与参考电极形成了一个回路，示波器上显示的电流将增至150-200pA。
此时电极与液体接触产生了所谓的“接触电位”，消除的方法是边按RESET档边调节Vp-OFFSET旋钮，使电极电压（Vp）补偿到零。
在倒置显微镜下，调节三维微操纵器引导电极靠近细胞，当电极接触到细胞时电流突然减少，此时应将关闭三维微操作器，改用注射器轻轻抽吸，对电极施加负压，此时电流噪声减少，表明封接电阻增大，在示波器上可以看到电流近似于一条直线，用20mV电压脉冲，使电极与细胞膜形成高阻封接（电阻可达10GΩ），此时便可以得到细胞贴附式膜片钳模式。
（5）全细胞实验数据记录
当高阻抗封接形成之后，可另加负压以吸破细胞的膜片。
在记录实验结果之前，要进行参数补偿，以期获得符合实际的结果。
在全细胞记录模式下，电极与细胞形成一个等效电路，细胞膜在其中相当于一个电容器（Cm）与一个电阻（Rm）并联。
在电极腔下膜片被打破的同时，20mV脉冲波上下浮动产生大的一次过电流，这是来自细胞膜的电容性电流。
对这个细胞膜的电容性电流分析，可以求出细胞膜电容Cm和膜阻抗Rm。
通过调节G-SERIES和C-SLOW旋钮可以补偿电容性电流，使其尽可能变少。
记录到的电流通过膜片钳放大器和1401数模转换器发送至示波器和计算机进行显示、记录和分析。
计算机内的各种刺激通过数模转换器转换成电压脉冲，由放大器送至电极，这样就可以检测电极电阻以及变化的电流。
指令电压由放大器Vp/Vcomm输出，再经1401转换器送至示波器和计算机。
1401转换器再将放大器中的电压和电流信号数字化时，它的取样频率是1KHz。
全细胞模式建立之后，细胞开始钳制在氯平衡电位（0mV）。
指令电压按照0，±40，±80mV的顺序进行去极化，每一个电位持续200ms，两电位之间间隔4s。
此实验按照这样的顺序持续记录。
3、容积激活性氯电流实验程序
（1）全细胞记录形成，测定电容之后，继续用等渗灌流液灌流3min；（2）灌流47%低渗液，低渗液可将氯电流激活；
（3）当低渗液激活的氯电流到达峰值并平稳之后，在换回高渗液将电流抑制下来；
（4）标准化的全细胞电流计算如下：
标准化电流（pA/pF）＝所测电流值（pA）÷细胞电容（pF）
4、氯通道阻断剂抑制氯电流实验程序
（1）全细胞记录形成，测定电容之后，继续用等渗液灌流3min；
（2）灌流47%低渗液，低渗液可将氯电流激活，待其达到峰值并平稳；（3）灌流含有氯离子阻断剂的47%低渗液，待其到最小值水平并平稳3min；
（4）换47%的高渗液灌流（约5min），观察电流是否还能被抑制；
（5）换47%低渗液，观察电流是否还能够恢复；
氯通道阻断剂抑制容积激活性氯电流的抑制率计算如下：
抑制率（%）≡[(C ctr l—C Iso)—(C blocker s—C Iso)]／(C ctrl—C Iso)×100%
C ctr l:47%低渗灌流时对照标准化电流；
C Iso：等渗液灌流时标准化电流；
C blocker s：加入氯离子阻断剂后标准化电流；。