细胞生物学实验手册：细胞中的微丝染色及微丝与细胞形态的实验观察

实验四细胞中的微丝染色及微丝与细胞形态的实验观察

【实验目的】

掌握微丝的染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜下微丝的基本形态结构。【实验用品】

一、材料和标本盖片培养的成纤维细胞三片。

二、器材和仪器光学显微镜一台、镊子一把、小平皿六个、载片三个、吸水纸、37℃恒温箱。

三、试剂 PBS(pH7.2)、2％Triton X—100液、M—缓冲液、3％戊二醛固定液、0.2％考马斯亮兰染液、100μg／ml的细胞松驰素B、DMEM培养液。

【实验内容】

一、成纤维细胞微丝的染色及其对细胞松驰素B的反应

(一)原理

微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。细胞松驰素B 可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。

(二)细胞松驰素B处理成纤维细胞与染色观察

1．在平皿中有三张成纤维细胞贴壁生长的盖片，在超净工作台内将一张盖片移入另一皿中继续培养，用作对照。

2．在有两片的平皿内加100μg／ml的细胞松弛素B 4滴继续培养半小时。

3. 将用细胞松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理，另一张用培养液洗五次（在平皿内换五次培养液，每次都要摇动），继续培养、观察。两小时后细胞形状恢复，接近正常。

4．对恢复的盖片与第一张没用药的盖片一同做染色处理。

5．染色处理

①将需染色的盖片放入盛有PBS的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片，换液三次，每次3分钟，洗去培养液。

②将盖片移入2％Triton X一100液，置37℃恒温箱内处理20～30分钟，以提取骨架以外的蛋白质，使骨架图像清晰。

③立刻将盖片移入M一缓冲液，换洗三次，每次3分钟。M一缓冲液有稳定细胞骨架的作用。