细胞融合的原理与技术 (2)

细胞融合的原理与技术

摘要：细胞工程是生物工程主要组成之一，出现于20世纪70年代末至80年代初，是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。随着细胞融合技术的不断改进和完善，动物、植物及微生物细胞融合技术无论在基础理论研究还是在实际应用中产生的影响将日益显著。

1.细胞融合原理

细胞融合技术是20世纪60年代迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术。细胞融合(cell fusion)也称细胞杂交( cellhybridization) 、原生质体融合(protoplast fusion)或体细胞杂交(somatic hybridization), 是指细胞通过介导和培养, 在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合( 合并) 成一个核或多核的杂合细胞的过程。体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。

细胞融合大体分三个阶段进行。第一阶段是制出细胞融合体。首先要用氧把细胞分散开，再把细胞壁溶解掉，这时的细胞就成了原生质体。原生质体用聚乙烯乙二醇(PEG)处理后，再把PEG洗掉，形成原生质体的结合。第二阶段是融合子的鉴定。利用利于融合子生存的培养基删选出已经融合的杂种细胞。第三阶段是培养融合细胞阶段。融合细胞在细菌培养基或是不含有细菌的液体培养基中进行培养，结合细胞反复分裂后，形成细胞团，把细胞团移植于含有植物激素的培养基里长出茎、叶，再把它们移植于土壤之中或嫁接于植物体上，继续生长形成新植物。

1.1动物细胞融合

一些致癌病毒虽然能够诱导细胞融合,但由于具有毒性大等潜在的危险性而在应用上受到很大的限制,由此科研人员又试图尝试使用灭活的病毒来作为促融物,并且以异种细胞作为融合对象。1965年,英国Harris等报告灭活病毒可以用来融合不同种动物的细胞,并且指出由此产生的杂交细胞可以存活。当时世界上许多报刊很快就对这一发现在生物学上的重要性做出了评价,认为这是在细胞融

合研究中的又一次突破。他们的贡献在于证明了灭活的病毒可以作为一般方法用来在一定的条件下融合动物细胞,而且差异很大的动物种之间的细胞可以被诱导融合,融合的细胞可以存活。1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中,人的染色体优先丢失,并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。1970年Ladda又进一步发展了去核的小鼠成纤维细胞进行融合实验,开始了各种细胞重组的研究工作。从发现病毒能够诱导细胞融合之后,动物细胞融合的研究工作迅速发展起来。然而,由于HVJ诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们一直试图发现一种替代物作介质诱导细胞融合。

1.2植物细胞融合

植物细胞融合技术的发展可追溯到1937年,Mi-chel用0. 5 mol/L硝酸钠处理原生质体使之凝集、融合。但那时还不能用酶法大量制备原生质体,使实验受到原生质体数量的限制,因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。直到1960年Cocking用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功,才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。1972年美国科学家Carlson等将粉蓝烟草和郎氏烟草两个异种的体细胞融合成功。20世纪70年代,细胞融合的研究范围又扩展到植物间、动物间、动植物间、甚至人体细胞与动植物细胞之间。

1.3微生物细胞融合

1975年原生质体融合技术已扩展运用到微生物中,匈牙利的Ferenczy首先报道PEG促使真菌融合,以后的成功报道涉及酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间,使细胞融合技术继动、植物之后,在微生物中也形成了实验体系。

2.细胞融合技术

细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物

学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。

细胞融合技术大体上可分为化学诱导融合、生物诱导融合和物理诱导融合三类。

2.1化学诱导融合

2.1.1盐类融合法

此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率 ,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。2.1.2高钙和高 pH值融合法

Keller首先发现高 Ca2 +和高 pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内 2个光敏感突变体诱导融合成功并获得 100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。

2.1.3聚乙二醇融合法 ( PEG法)

1974 年发现的高效融合剂聚乙二醇(PEG)使不同科属的植物原生质体之间都可以融合，融合率可达30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。PEG可与水分子借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，从而引起细胞融合。为了发挥PEG 促进细胞融合的效力，必须采用较高的浓度(40%～50%，分子量为6000)，但PEG 在高浓度下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。影响原生质体融合的因素很多。特别是环境中的阳离子存在，融合时的pH 也对原生质体融合有较明显的影响。一般来讲钙、镁离子有助于融合。如有钙离子存在时，可得到较高的融合率。但在缺乏钙离子时，若pH 较低，融合频率也较高。这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，使原生质体带电，彼此易于附着发生凝集所致。PEG诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、活性稳定、使用方便等特点，在细胞融合领域取得了可喜的成绩，大量的研究仍采用此法。虽然PEG作为融合剂有很多成功的报道，但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较底及经验性大等缺陷。

2.2 物理诱导融合

2.2.1 细胞电融合技术

细胞电融合是以脂质膜和脂质一蛋白质膜的电学性质为基础的，以双向电泳