二代测序NGS实验方案和应用

这里为您介绍二代测序的相关流程与应用。

随着人类基因组工程的完成,对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。这些新的测序平台允许进行高通量测序,具有广泛的应用:

•全基因组从头测序或者重测序

•目标序列重测序

•转录组分析

•微生物组研究

•基因调控研究

NGS 序列

二代测序仪器有很多种组合,在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格与技术方面存在存在差异。

从规格与初始成本的角度而言,二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围,也就就是所谓的“台式测序仪”与高通量仪器。

台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR一样,自己进行测序。这些仪器可以与一些靶标序列富集技术相结合,用在一些临床的应用中,其中:选定的靶标基因用于深度分析,以检测稀有的突变,或者检测多样样本中(比如癌症样本)中的突变。目前,这些仪器的通量在10 Mb到7、5 Gb之间,但就是随着硬件,软件与试剂的持续改善,通量也在稳步增加。

高通量测序仪非常适合于大量的,基因组范围的研究,每次测序能测定600 Gb的序列。一些这样的高通量与高精度的平台,能测定的片段长度相对较短,这对于高重复性的序列与未知基因组的从头测序就可能成为问题。与此相反,也有一些仪器能测序的片段较长(达到2500 bp),但就是其精度与测序能力(90 Mb)要低很多。还有一些测序能力位于两者之间的仪器(~800 bp,700 Mb)。

因此,应用决定了哪一种仪器就是最合适的。

有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。这种技术中,根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变,可以确定通过这个孔道的碱基。这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体,而不需要生成新的DNA链。

DNA测序

二代DNA测序的工作流程如下:

•DNA样本制备

•文库构建与验证

•文库分子大规模平行克隆扩增

•测序

二代测序DNA样本的质量控制

首先,评价基因组DNA的质量就是非常必要的(完整性与纯度)。

凝胶电泳法

基因组DNA的完整性与大小,可以用常规或者脉冲场琼脂糖凝胶电泳(PFGE)来检测。常规的凝胶电泳的精确度不高,这就是因为大的DNA 分子在凝胶中移动的时候,本质上就是用一种与尺寸无关的方式一起移动的。但就是,它仍然能够提供完整性(大小范围)与纯度(RNA污染物在凝胶底部形成脱尾条带)方面的有效信息。因此,它仍然就是评价基因组DNA质量的有效方法之一。

注:RNA污染会导致DNA浓度高估,并且抑制一些下游步骤。如果能肯定有RNA污染,则可使用去DNase的RNase I处理样本。

分光光度测定法

分光光度仪在260 nm与280 nm处读数的比例(A260/A280)可以用来估计DNA相对于一些吸收紫外光的杂质(比如蛋白)的纯度。纯净的DNA的A260/A280比例大约为1、7–1、9。

注:想要获得精确的A260/A280值,需要在弱碱性的缓冲溶液中测定吸光度(比如, 10 mM Tris•Cl, p H 7、5)。

第二个步骤就是测定基因组DNA的浓度。

分光光度法

DNA的浓度可以通过使用分光光度仪测定其在260 nm波长的吸光度来确定。Nanodrop目前被广泛使用,因为它需要的样本量少(1 µl),并且使用方便(不需要比色皿)。为了确保结果的可靠性,读数应该在0、1到1、0之间。

注:吸光度测定不能区别DNA与RNA。RNA污染物会导致DNA浓度高估。但就是,纯净RNA的A260/A280比值在2、0左右,而纯净的DNA 大约为1、8。因此,如果这个值为1、95,那么说明样本里面有RNA杂质。

注:苯酚在270–275 nm的波长范围内有最大的吸光度,非常接近于DNA。因此苯酚能提高样本在260 nm附近的吸光度,从而导致高估DNA 的产量与纯度。

荧光法

荧光法使用荧光染料测定DNA的浓度,具有特异性与灵敏性。Hoechst 33258结合到DNA上后,能增大458 nm波长附近的发光强度,除此之外,也可以使用一些更加灵敏的荧光染料,比如PicoGreen染料。基于PicoGreen染料的实验,比紫外吸光光度法灵敏10,000倍,而比使用Hoechst 33258染料的方法至少灵敏400倍。与紫外吸光光度法不同,PicoGreen实验对双链DNA的选择性要远高于RNA与单链DNA。

DNA标准品与样本与荧光染料混合,并且使用荧光计检测。将样本的测定结果与标准品的测定结果相比较,以确定DNA的浓度。

Real-time PCR

可以使用real-time PCR 技术来测定DNA样本的数量与质量。多重PCR技术使用引物集在多个位点扩增不同大小的片段,就是检测DNA 损伤与片段化的有效质控手段。此类技术试验专门测定可经PCR扩增,适于二代测序的DNA分子。上述提到的这些常规方法,通常不能测定的样本中扩增得到的DNA的量,或者会高估了DNA的量。与它们相比,real-time PCR更加适用于预测DNA样本就是否适合于二代测序。

文库制备

对于大多数商业化的二代测序平台,使用诸如桥式扩增或者乳液PCR方法,对文库中的DNA片段进行克隆扩增,以产生足够拷贝数量的测序模板非常必要。通过将平台特异性的适配子与感兴趣的DNA源(比如基因组DNA、双链cDNA或者PCR扩增子等所产生的DNA片段)退火,得到片段文库。适配子序列的存在,使得我们可以对文库分子进行选择性的克隆扩增。因此,这种方法不需要像传统的方法那样,在微生物中间体中,对基因组片段进行微生物克隆。另外,适配子序列中,还含有平台特异性的测序引物的结合位点。

通常情况下,一个常规的DNA文库构建方案包含四步:

•片段化DNA

•对DNA片段进行末端修复

•连接适配子序列(不适用于单分子测序)

•对可选的文库进行扩增

目前有四种方法用于产生基因组DNA碎片:酶消化法、超声波法、喷雾法与水动力剪切法。这四种方法都可以用于文库构建,但就是每一种方法都有其优点与局限性。核酸内切酶消化的方法快速并且容易,但就是难以精确的控制片段长度的分布。另外这种方法可能会对基因组DNA的呈递引入偏倚。另外三种技术使用物理的方法将DNA的双链打断,这种断裂就是随机的,因此能在文库中对DNA进行无偏的呈递。可以使用琼脂糖凝胶电泳或者自动化的DNA分析方法,对DNA片段的尺寸分布进行控制。

片段化DNA之后,需要将DNA修复,产生5’磷酸化的平末端DNA,以便能够与测序平台特异性的适配子相连接。文库构建的效率直接依赖于DNA末端修复的效率与准确性。

末端修复混合溶液将5’或者3’的粘性末端转变成5’磷酸化的平末端DNA。在大多数情况下,末端修复通过T4 DNA聚合酶的5’—3’聚合酶活性与3’—5’的核酸外切酶活性完成。而T4多聚核苷酸激酶确保平末端的DNA片段5’端的磷酸化,以便进行后续的适配子连接。

根据所使用的测序平台,平末端DNA片段可以直接与适配子连接,或者需要在其片段的3’端增加一个单独的突出的腺苷酸A,以便与平台特异性适配子上突出的胸苷酸T相互配对。通常情况下,使用Klenow片段(具有最低的3’到5’端的核酸外切酶活性),或者使用其它具有末端转移酶活性的聚合酶催化这一步骤。

T4 DNA连接酶将双链的适配子与文库片段修复过的末端相连,然后使用回收反应或者根据DNA的尺寸,选择性去除文库中未连接的适配子与适配子二聚体。大小筛选方法包括使用琼脂糖凝胶电泳分离,使用磁珠或者使用高等的基于柱的纯化方法。在连接过程中可能出现适配子的二聚体,它们会与与适配子连接的文库片段共同扩增,从而降低测序平台对真正文库片段测序的能力并且降低测序的质量,因此在测序之前,必须将它们从文库中除去。一些测序平台要求文库片段的长度分布在比较窄的范围内,以得到最佳的结果,很多时候,这只能通过去除凝胶电泳上的相应的片段条带实现。这种方法也可以用来去除适配子二聚体。

完成这一步骤之后,应该对DNA片段文库的质量进行检测,并进行定量检测。根据浓度与测序文库的适配子设计,既可以直接稀释溶液并用于测序,也可以对文库进行选择性扩增。在文库扩增阶段,使用高保真的DNA聚合酶,合成完整的适配子序列,通过与PCR引物的重叠,用于后续的克隆扩增与与测序引物结合,或者提高DNA文库的产量。为了得到最佳的文库扩增结果,要求DNA聚合酶具有高保真性与最小的序列偏倚。

文库质量评估方法,参见NGS文库质控。

为了充分利用测序能力,不同样本得到的测序文库可以放在一起,在同一轮实验中一同测序。通过将DNA片段与具有不同特征的适配子相连接,可以实现这一过程,即对于每一个样本使用不同的短核苷酸序列作为适配子。