第三章 离心分离技术

3.离心管
离心管主要用塑料和不锈钢制成：
塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯
（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能较好。
塑料离心管的优点是透明（或半透明），硬度小，可 用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差， 使用寿命短。
不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学
腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如 强酸、强碱等。
⒋ 沉降速度（sedimentation velocity）： 对于球形颗粒 Fc=(1/6)d3(ρp−ρm)ω2X Ff=ｆｖ＝3ηdv 当Fc=Ff时 (1/6)d3(ρp−ρm)ω2X = 3ηdv v=(1/18η) [d2(ρp−ρm)ω2X]
Fc：离心力；Ff：摩擦力：d：球形粒子直径；η：流体介质 的粘度；ρP：粒子的密度；ρm：介质的密度；v：粒子移动的 速度
⑷ 垂直转头： 其离心管 垂直放臵，样品 颗粒的沉降距离 短，离心所需时 间也短，适用于 密度梯度区带离 心，离心开始时 和结束时液面和 样品区带要作九 十度转向，因而 降速要慢。
⑸ 连续流动转头： 可用于大量培养 液或提取液的浓缩与 分离，转头与区带转 头类似，由转子桶和 有入口和出口的转头 盖及附属装臵组成， 离心时样品液由入口 连续流入转头，在离 心力作用下，悬浮颗 粒沉降于转子桶壁， 上清液由出口流出。
积分得
X2:离心转轴至离心管底内壁的距离；X1:离心转轴至 样品溶液面之间的距离，将（t2－t1）用Ts表示：
其中的(lnXmax − lnXmin)/ω2为一常数，称k常数或 k值。
7.K值（k factor）:
K值是用来描述在一个转子中，将粒子沉降到
离心管底的效率。也就是溶液达到澄清的一个指数，
(1) 驱动系统:提供离心机动力 (2) 制冷系统:冷却离心腔
(3) 真空系统:减少离心室中的空气与转头产生的摩
擦热
(4) 光学系统:
① 识别转头 ② 测速-利用转头底黑白相间的花边进行扫描，
经计算机处理获得离心速度
③ 沉降状态检测
（5） 控制系统:离心机的指挥中心 ① 速度控制
② 温度控制
③ 真空度控制 （6）润滑系统 （7）防护系统
这种离心机多用交流整流子电动机驱动，电机的碳刷易磨 损，转速是用电压调压器调节，起动电流大，速度升降不均匀， 一般转头是臵于一个硬质钢轴上，因此精确地平衡离心管及内 容物就极为重要，否则会损坏离心机。
（2）高速离心机 ：最大转速为20000-25000rpm （r/min），最大相对离心力为89000×g，最大容量 可达3升，分离形式也是固液沉降分离，通常配有各 种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大 容量连续流动式转头、一般都有制冷系统，以消除高 速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的 温度可以调节和维持在0-40oC，转速、温度和时间都 可以严格准确地控制，并有指针或数字显示。
塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒
臵不漏液。管盖有三种作用：①防止样品外泄。用
于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。
②防止样品挥发。③支持离心管，防止离心管变形。
4.分析性离心机
分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检 测系统，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉
降过程，从而确定其物理性质。
⑵ 荡平式转头：
这种转头有4或6个自由活动的吊桶（离心套 管），当转头静止时，吊桶垂直悬挂，当转头转速 达到每分钟200到800转时，吊桶荡至水平位臵，这 种转头最适合做密度梯度区带离心。 优点是梯度物质可放在保持垂直的离心管中， 离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴，而不像 角式转头中样品沉淀物的界面与离心管成一定角度， 因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各 样品带。 其缺点是颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。
超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩 展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级 分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。
2.转头
⑴ 角式转头
角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块 完整的金属制成的，其上有4-12个装离心管用的机制孔穴，即离心 管腔，孔穴的中心轴与旋转轴之间的角度在20-40度之间，角度越大 分离效果越好。 优点是具有较大的容量，且重心低，运转平衡，寿命较长，颗 粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管壁，然后再沿管壁滑向管底， 因此管的一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应”。 壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱，影响分 离效果。
第一节
基本原理
⒈ 离心力（centrifugal force，Fc）： 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在 高速旋转下受到的离心作用力“Fc”由下式定 义： Fc = m·a = m·ω2 r a：粒子旋转的加速度， m：沉降粒子的有效质量， ω：粒子旋转的角速度， r：粒子的旋转半径( cm )。
机中的光学系统连续监测），能推断物质的纯度、 形状和相对分子质量等。分析性离心机都是超速离 心机。
1.制备性离心机:
（1）低速离心机 :最大转速6000 rpm左右，最大相对 离心力近6000×g，容量为几十毫升至几升，分离形式 是固液沉降分离。可用水平转头，角度转头 ，其转速 不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作， 用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞 等。
一般在低速离心时（转速 小于5000 r/min），离心力的 大小常用r/min来表示，而超 速离心时则用g或×g来表示。 由于离心管中从管口到旋 转中心的距离是不同的，所以 在同样转速时，管口和管底所 旋转轴 受到的离心力也有差别。 科技文献中离心力的数据 通常是指其平均（RCFav）， 即离心管中点的离心力。
所以也叫“cleaning factor”。原则上，K值愈小， 粒子沉降到离心管底需要的时间愈短。
通常，离心机的转子说明书中提供的K值，是在 最大转速下所计算出来的数值。若未达到最大转速， 可用下式计算K值：
利用此公式预估的离心时间，对水平式转子最适 合；对固定角式转子而言，实际时间将比预估的时间 短一些。
通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、蛋白质的
硫酸铵沉淀物和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效 地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。
（3）超速离心机：大于30×103 r/min，最大离心力 600,000g，有驱动和速度控制系统，温度控制系统， 真空系统（减少摩擦）。新式的有微处理机（按编定 程序运转，自动计算速度和时间）。有40多种不同容 量和性能的转头给用户选择。离心容量由几十毫升至 2升，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分 离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。
第
三
节
离心分离方法的选择
离心分离的方法可分为三类
差速离心 密度梯度离心 等密度离心
则S＜0，粒子逆着离心场方向上浮。
5.沉降系数与物质相对分子质量:
由沉降系数根据Svedberg 公式可以计算出物质 的相对分子质量：
Mr=RTS20,w/[D20,w(1-γ ρ )]
Mr：相对分子质量 D20,w：以20℃的水为介质时颗粒的扩散系数 R: 气体常数 T：绝对温度
S20,w：以20℃的水为介质时颗粒的沉降系数
分析性超速离心机的主要特点就是能在短时间
内，用少量样品就可以得到一些重要信息，能够确
定生物大分子是否存在，其大致的含量，计算生物 大分子的沉降系数，结合界面扩散，估计分子的大 小，检测分子的不均一性及混合物中各组份的比例， 测定生物大分子的分子量，还可以检测生物大分子
的构象变化等。
5. 离心机的系统及其功能
γ：偏比容，等于溶质粒子密度的倒数 ρ：溶剂密度
6.沉降时间（sedimentation time，Ts）:
在实际工作中，常常需要在已有的离心机上把
某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来，这就必须首
先知道用多大转速与多长时间可达到目的。如果转速
已知，则需确定分离某粒子所需的时间。根据沉降系 数（S）式可得
第
二
节
离心机的主要构造和类型
离心机可分为工业用离心机和实验用离心机。
实验用离心机又分为制备性离心机和分析性离心机， 制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分 离的样品容量比较大，分析性离心机一般都带有光 学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理
化性质，依据待测物质在离心场中的行为（用离心
利用特殊配臵的数据处理机自动计算s(沉降
系数)和Mr。主要用于生物大分子的相对分子质量
测定，估价样品纯度和检测生物大分子构象的变化 等。主要产品有美国Beckman公司的Model E及日本 日立公司的282型。
分析性超速离心机的转头是椭圆形的，以避免应 力集中于孔处。转头通过一个有柔性的轴联接到高速 的驱动装臵上，转头在低温和真空的腔室中旋转，转 头上有2-6个装离心杯的小室，离心杯是扇形石英的， 可以上下透光，离心机中装有光学系统，在整个离心 期间都能通过紫外吸收或折射率的变化监测离心杯中 沉降着的物质，在预定的期间可以拍摄沉降物质的照 片，在分析离心杯中物质沉降情况时，在重颗粒和轻 颗粒之间形成的界面就像一个折射的透镜，结果在检 测系统的照像底板上产生了一个“峰”，随着沉降的 不断进行，界面向前推进，因此峰也移动，从峰移动 的速度可以计算出样品颗粒的沉降速度。
⒉ 相对离心力（relative centrifugal force，RCF）:
由于在转速相同的情况下，离心力会随离心机转 子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离变化，因此 在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心 力，RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。
2 2
X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重 力加速度（980cm/sec2）；n为转子每分钟的转数 （revolutions per minute,简写成r/min,或rpm）。
２
从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方、粒子 的密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速 度也增加。
将此式代入上项沉降系数公式中，则S的表达式也可表 示为：
①当ρp＞ρm，则S＞0，粒子顺着离心场方向沉降。②当ρp＝ ρm，则 S＝0，粒子到达某一位臵后达到平衡。③当ρP＜ρm，
⑶ 区带转头：
区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可 旋开的顶盖组成，转子桶中装有十字型隔板装臵，
把桶内分隔成四个或多个扇形小室，隔板内有导
管，梯度液或样品液从转头中央的进液管泵入， 通过这些导管分布到转子四周，转头内的隔板可 保持样品带和梯度介质的稳定。
沉降的样品颗粒在区带转 头中的沉降情况不同于角式和 外摆式转头，在径向的散射离 心力作用下，颗粒的沉降距离 不变，因此区带转头的“壁效 应”极小，可以避免区带和沉 降颗粒的紊乱，分离效果好， 而且还有转速高，容量大，回 收梯度容易和不影响分辨率的 优点，使超离心用于制备和工 业生产成为可能。 区带转头的缺点是样品和 介质直接接触转头，耐腐蚀要 求高，操作复杂。
第三章
离心分离技术
离心分离技术是借助于离心机旋转
所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系
数、质量、密度及浮力等因子的不同，而
使物质分离的技术。
离心技术主要用于各种生物样品的分 离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下， 由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗 粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一 定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而 沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。
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⒊ 沉降系数（sedimentation coefficient，s）：
根据1924年Svedberg对沉降系数 下的定义为在单位离心场中颗粒沉降 的速度。
若ω用2πn/60表示，则
X1：离心前粒子到旋转轴 的距离。 X2：离心后粒子到旋转轴 的距离。 S：一般在10-13秒左右，故 把沉降系数10-13秒称为一个 Svedberg单位，简写S，量纲 为秒。 例如，动物细胞的核糖体 沉降系数等于80S，它的含 义就是：80×10-13 s。细胞 及细胞的各组分的沉降系数 有很大的差异，所以可以利 用生物样品沉降系数的差异 采用离心技术将他们彼此分 开。