淀粉酶活力的测定方法
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淀粉酶活力的测定方法
淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶,它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶,性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是α -淀粉酶和β-淀粉酶。
α -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α -1,4糖苷键,单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。Ca 2+能使α-淀粉酶活化和稳定,它比较耐热但不耐酸,pH 3.6 以下可使其钝化。
β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键,遇到支链淀粉的α -1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶,不需要Ca 2+ 及Cl —等辅助因子,最适pH偏酸,与α -淀粉酶相反,它不耐热但觉耐酸,60 ℃保温15min 可使其钝化。
通常提取液中α -淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定(α + β)淀粉酶总活力,然后在60 ℃加热15 min ,钝化β-淀粉酶,测出α -淀粉酶活力,用总活力减去α - 淀粉酶活力,就可求出β- 淀粉酶活力。
淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的3,5- 二硝基水杨酸生成棕红色的3- 氨基-5- 硝基水杨酸,生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖(麦芽糖)量表示酶活大小。
1 酶活测定方法
(1)标准曲线的制作(见下表)
①取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。②摇匀,至沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在520 nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。
表1 标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值
试剂 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液(mL)0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 H2O(mL) 2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0 3,5-二硝基水杨酸(mL) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 麦芽糖含量(mg)0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 OD520
(2)粗酶液淀粉酶活力测定
①待测粗酶液的制备:
发酵24 h后发酵液4000 r/ min离心10 min,去除菌体,在上清液中加入65%饱和度的硫酸铵,待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h,然后5000r/min离心20min,得到初步
纯化的淀粉酶。
②按以下顺序操作:
取预先洁净灭菌干燥试管,编号。取粗酶液1 ml 于各只试管中,于60℃水浴中预热5min 柠檬酸淀粉缓冲液同时在60℃水中预热5min ,→取柠檬酸淀粉缓冲液1ml 加入试管中,于60℃水浴中保温30min →加入1.5 ml 3,5-二硝基水杨酸,沸水中5 min,加入氢氧化钠溶液终止反应,加蒸馏水至20 ml 。→摇匀,用分光光度计测定OD520 nm 值。在上述条件下以单位体积样品在30 min 释放1 mg 麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。
在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量按下列公式计算酶活力 酶活力测定公式:
淀粉酶活力=麦芽糖含量(mg )·淀粉酶原液总体积(mL )/所加淀粉质量
每个样品按下表所示步骤操作,在反应过程中,从加入底物开始,向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致:
表2样品酶活力测定步骤 反应顺序 样品(重复3个)
样品空白
标准空白
样品稀释液(ml ) 1 1 0
蒸馏水 0 0 1
60℃预热5min
依次加入淀粉溶液(ml )
1.5 1.5
1.5
混合60℃保温30min
依次加入DNS 试剂
(ml )
1.5
1.5
1.5
混合100℃煮沸5min 加入0.4mol/L NaOH 溶液终止反应
加入蒸馏水至总体积(ml )
20 20
20
反应后的试样在室温下静置10min ,如出现混浊需在离心机上以4,000rpm 离心10min ,上清液以标准空白调零,在分光光度计520nm 波长处测定样品空白(A 0)和样品溶液(A )的吸光值,A -A 0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品淀粉酶的活性。
2 活性计算
酶活力单位定义:在60℃、PH5.6条件下,每小时从2%的可溶性淀粉溶液中释放出1mg 尔麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位(U )
淀粉酶活性U 按下式计算: U = ×F
其中:U ——样品淀粉酶活性,U/ml ; K ——标准曲线斜率;
K ×(A -A 0) S ×(30÷60)×180
F——样品溶液反应前的总量,ml;
S——样品测试量;表1中S=1ml;
60——1小时为60min;
30——反应时间,min。
试剂
(1)2% 淀粉溶液
(2) 0.4mol/L 氢氧化钠
(3) pH5.6 柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g ,溶解后定容至1000mL ,为 A 液。称取柠檬酸钠29.41g ,溶解后定容至1000mL ,为B 液。取A 液13.7mL 与
B 液26.3mL 混匀,即为pH5.6 之缓冲液。
(4) 3,5- 二硝基水杨酸精确称取1g3,5- 二硝基水杨酸溶于20mL 1mol/L 氢氧化钠中,加入50mL 蒸馏水,再加入30g 酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水稀释至100Ml ,盖紧瓶塞,防止CO 2进入。