染色质免疫共沉淀PPT
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《免疫共沉淀》课件
明确实验目的和预期结果，设计合理 的实验方案。
检查所需的仪器设备是否齐全和正常 工作，如离心机、摇床、离心管等。
实验操作流程
抗体与蛋白质样品的结合
将抗体与蛋白质样品混合，确保抗体与目标 蛋白质充分结合。
共沉淀物的分离
通过离心或过滤等方法将共沉淀物与溶液分 离。
清洗非特异性结合
通过洗涤去除未结合的蛋白质和其他杂质。
结果分析方法
统计学分析
采用t检验或方差分析等统计学方法，对实验数据进行处理和分析，以确定共沉淀物之间的相互作用 是否具有统计学显著性。
生物信息学分析
利用在线生物信息学工具对共沉淀物进行功能注释、基因本体论（GO）分类和蛋白质相互作用网络 分析，以深入了解共沉淀物的生物学功能和相互作用关系。
结果解读与讨论
值的实验数据和结论。
未来可以对这些蛋白质复合物的 功能进行深入研究，探讨其在生 物学和医学中的意义和作用机制
。
同时，随着技术的不断进步和应 用领域的拓展，免疫共沉淀技术 还有望在更多领域发挥重要作用
。
未来研究方向与建议
1
进一步优化免疫共沉淀实验条件和方法，提高实 验的特异性和灵敏度，以分离和鉴定更多蛋白质 复合物。
结果解读
根据实验结果，分析共沉淀物的生物学 意义和功能，探讨它们与目标蛋白的相 互作用机制。
VS
结果讨论
结合已有研究，对实验结果进行深入讨论 ，提出可能的生物学模型或假设，为后续 研究提供思路和方向。同时，对实验的局 限性进行说明，并提出改进方向。
05
结论与展望
结论总结
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，在生物学和医学 研究中具有广泛应用。
பைடு நூலகம்
检查所需的仪器设备是否齐全和正常 工作，如离心机、摇床、离心管等。
实验操作流程
抗体与蛋白质样品的结合
将抗体与蛋白质样品混合，确保抗体与目标 蛋白质充分结合。
共沉淀物的分离
通过离心或过滤等方法将共沉淀物与溶液分 离。
清洗非特异性结合
通过洗涤去除未结合的蛋白质和其他杂质。
结果分析方法
统计学分析
采用t检验或方差分析等统计学方法，对实验数据进行处理和分析，以确定共沉淀物之间的相互作用 是否具有统计学显著性。
生物信息学分析
利用在线生物信息学工具对共沉淀物进行功能注释、基因本体论（GO）分类和蛋白质相互作用网络 分析，以深入了解共沉淀物的生物学功能和相互作用关系。
结果解读与讨论
值的实验数据和结论。
未来可以对这些蛋白质复合物的 功能进行深入研究，探讨其在生 物学和医学中的意义和作用机制
。
同时，随着技术的不断进步和应 用领域的拓展，免疫共沉淀技术 还有望在更多领域发挥重要作用
。
未来研究方向与建议
1
进一步优化免疫共沉淀实验条件和方法，提高实 验的特异性和灵敏度，以分离和鉴定更多蛋白质 复合物。
结果解读
根据实验结果，分析共沉淀物的生物学 意义和功能，探讨它们与目标蛋白的相 互作用机制。
VS
结果讨论
结合已有研究，对实验结果进行深入讨论 ，提出可能的生物学模型或假设，为后续 研究提供思路和方向。同时，对实验的局 限性进行说明，并提出改进方向。
05
结论与展望
结论总结
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，在生物学和医学 研究中具有广泛应用。
பைடு நூலகம்
免疫共沉淀原理及注意事项-PPT精品文档
Leabharlann 10% glycerol（甘油）,
0.2 mM PMSF, 0.2%Tween 20
2.1免疫沉淀中抗体的选择
注意的问题：2.2抗体
使用对照抗体：（阴性和阳性） 阴性：单克隆抗体：同一种属的IgG 兔多克隆抗体：正常兔IgG 阳性：细胞内某种蛋白的抗体（做膜蛋白A， 用膜蛋白B）
未检测到目得蛋白或蛋白很少
注意的问题：1.裂解液
细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞 内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用 非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞
的裂解条件是不一样的，通过经验确定。
。 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解
液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer
可能原因 上操作并防止冻融 2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓 度 3.抗抗体亲合力太低： 选用适合于IP和/或IB的相应抗体 4.IP抗体未与agarose珠子结合： 选用适合于IP的相应珠子，正确保 存防止变质或干燥 5.Tag未暴露在融合蛋白构象的表面：改变tag融合表达部位 6.裂解液严谨度太高： 改用低严谨度裂解液 处理方法 1.样品被蛋白酶降解： 添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4℃以下冰
proteinA/G-琼脂糖珠复合物
Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异
性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。 目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上。
ProteinA/G的作用及具体原理
“捕获”抗体，形成复合物，
抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads ProteinA/G-garose beads 非共价健结合 共价结合
0.2 mM PMSF, 0.2%Tween 20
2.1免疫沉淀中抗体的选择
注意的问题：2.2抗体
使用对照抗体：（阴性和阳性） 阴性：单克隆抗体：同一种属的IgG 兔多克隆抗体：正常兔IgG 阳性：细胞内某种蛋白的抗体（做膜蛋白A， 用膜蛋白B）
未检测到目得蛋白或蛋白很少
注意的问题：1.裂解液
细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞 内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用 非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞
的裂解条件是不一样的，通过经验确定。
。 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解
液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer
可能原因 上操作并防止冻融 2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓 度 3.抗抗体亲合力太低： 选用适合于IP和/或IB的相应抗体 4.IP抗体未与agarose珠子结合： 选用适合于IP的相应珠子，正确保 存防止变质或干燥 5.Tag未暴露在融合蛋白构象的表面：改变tag融合表达部位 6.裂解液严谨度太高： 改用低严谨度裂解液 处理方法 1.样品被蛋白酶降解： 添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4℃以下冰
proteinA/G-琼脂糖珠复合物
Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异
性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。 目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上。
ProteinA/G的作用及具体原理
“捕获”抗体，形成复合物，
抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads ProteinA/G-garose beads 非共价健结合 共价结合
双荧光素酶染色质免疫共沉淀PPT课件
确保实验环境清洁，避免 交叉污染。
使用高质量的抗体和试剂， 确保实验结果的可靠性。
对实验结果进行统计分析， 避免主观偏见和误差。
严格控制实验条件，包括 温度、pH值、时间等， 确保实验的一致性和可重 复性。
实验优化建议
优化抗体与染色质的比例，提高特异性 结合的效率。
对实验结果进行多重验证，包括重复实 验和对照实验，以确保结果的可靠性。
技术发展历程
01
初始阶段
荧光素酶报告基因技术的出现和应用，为研究基因转录提供了有力工具。
02
发展阶段
染色质免疫共沉淀技术的不断完善和应用，为研究基因转录调控提供了
更准确的方法。
03
结合阶段
将荧光素酶报告基因技术与染色质免疫共沉淀技术相结合，形成双荧光
素酶染色质免疫共沉淀技术，为研究基因转录调控提供了更高效、准确
荧光素酶活性检测
荧光素酶活性检测方法
可以使用荧光素酶活性检测试剂盒或PCR仪等方法，对荧光素酶标记的DNA片 段进行检测。
结果分析
根据荧光素酶活性检测结果，可以得出目的基因的表达情况，并进行相关的数 据分析。
03
双荧光素酶染色质免疫共沉淀 实验结果分析
荧光素酶活性检测结果解读
荧光素酶活性检测是双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验的重要环节，通过检测荧光 素酶的活性，可以评估实验中荧光素酶的表达情况。
详细描述
miRNA是一类非编码RNA，通过与靶基因mRNA结合，在转录后水平调控基因表达。 在案例二中，研究人员利用双荧光素酶染色质免疫共沉淀技术，发现miRNA与靶基 因在转录水平上的相互作用，进一步揭示了miRNA对靶基因的调控机制。
案例三：表观遗传学研究中的应用
总结词
使用高质量的抗体和试剂， 确保实验结果的可靠性。
对实验结果进行统计分析， 避免主观偏见和误差。
严格控制实验条件，包括 温度、pH值、时间等， 确保实验的一致性和可重 复性。
实验优化建议
优化抗体与染色质的比例，提高特异性 结合的效率。
对实验结果进行多重验证，包括重复实 验和对照实验，以确保结果的可靠性。
技术发展历程
01
初始阶段
荧光素酶报告基因技术的出现和应用，为研究基因转录提供了有力工具。
02
发展阶段
染色质免疫共沉淀技术的不断完善和应用，为研究基因转录调控提供了
更准确的方法。
03
结合阶段
将荧光素酶报告基因技术与染色质免疫共沉淀技术相结合，形成双荧光
素酶染色质免疫共沉淀技术，为研究基因转录调控提供了更高效、准确
荧光素酶活性检测
荧光素酶活性检测方法
可以使用荧光素酶活性检测试剂盒或PCR仪等方法，对荧光素酶标记的DNA片 段进行检测。
结果分析
根据荧光素酶活性检测结果，可以得出目的基因的表达情况，并进行相关的数 据分析。
03
双荧光素酶染色质免疫共沉淀 实验结果分析
荧光素酶活性检测结果解读
荧光素酶活性检测是双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验的重要环节，通过检测荧光 素酶的活性，可以评估实验中荧光素酶的表达情况。
详细描述
miRNA是一类非编码RNA，通过与靶基因mRNA结合，在转录后水平调控基因表达。 在案例二中，研究人员利用双荧光素酶染色质免疫共沉淀技术，发现miRNA与靶基 因在转录水平上的相互作用，进一步揭示了miRNA对靶基因的调控机制。
案例三：表观遗传学研究中的应用
总结词
双荧光素酶染色质免疫共沉淀PPT课件
染色质免疫共沉淀技术的应用领域
01
02
03
基因转录调控研究
通过染色质免疫共沉淀技 术可以研究转录因子与 DNA的相互作用，揭示基 因转录调控的机制。
表观遗传学研究
染色质免疫共沉淀技术可 以用于研究DNA甲基化、 组蛋白修饰等表观遗传学 标记与基因表达的关系。
疾病机制研究
染色质免疫共沉淀技术可 以用于研究与疾病相关的 基因表达调控，为疾病诊 断和治疗提供新的思路。
染色质免疫共沉淀技术的定义
染色质免疫共沉淀技术是一种用于研究DNA与蛋白质相互作用的实验技术，通过 将特定的蛋白质与DNA结合，再利用抗体的特异性结合将DNA与蛋白质复合物 沉淀下来，从而实现对DNA与蛋白质相互作用的研究。
该技术利用抗原-抗体反应的高度特异性，能够特异性的富集目的DNA-蛋白质复 合物，为深入研究基因转录调控、表观遗传学等领域提供了有力工具。
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验原理
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验是 一种将荧光素酶标记技术与染色质免 疫共沉淀技术相结合的实验方法，通 过同时对两种不同的蛋白质进行荧光 素酶标记和染色质免疫共沉淀，实现 对两种蛋白质与DNA相互作用的检 测。
VS
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验原 理具有高灵敏度、高特异性和高分辨 率等优点，可以用于研究基因表达调 控、表观遗传学和肿瘤发生发展等领 域。
数据分析与解读
数据标准化
生物信息学分析
将实验数据与对照组数据进行标准化 处理，消除实验误差，使数据具有可 比性。
结合生物信息学方法，对实验数据进 行深入挖掘，发现潜在的生物学意义 和功能。
差异分析
比较不同条件下的荧光素酶活性，分 析荧光素酶表达的差异，从而推断出 目标蛋白对基因转录的调控作用。
免疫共沉淀原理和注意事项培训ppt课件
免疫共沉淀原理和注意事项
8
三 实验流程
提取细胞总蛋白
↓
↓
离心，上清电泳(抗原抗体)
准备PA珠子， PBS洗3遍
↓
PA珠子加入蛋白裂解液 (去除非特异性蛋白背景)
↓
离心去PA珠子，取上清
↓
测蛋白浓度 (BCA法)
↓
加一抗反应(4℃过夜)
↓
加PA珠子捕捉复合物 (室温1h或4℃过夜)
↓
离心，收集沉淀，预冷RIPA Buffer洗3遍
2. RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用 Bradford法但可用BCA法或改良Lowry法测定蛋白浓度
免疫共沉淀原理和注意事项
16
裂解液成分
国内博士：
细胞裂解液： 50mM Tris-HC (lpH7.5)，
150 mM NaCl, 0.5%NP-40,
1mM EDTA 使用前加入PMSF至终浓度1mM、 proteinase inhibitor cocktail (混合物)。
ECL 试剂 +
一抗
一抗
二 抗 ( 辣 根 酶 标 记 的 羊 抗 兔 IgG)
一抗(兔抗Actin)
曝光后的蛋白条带
含有转印蛋白的PVDF膜
转印膜上蛋白检测示意图
免疫共沉淀原理和注意事项
X光片曝光显影
ECL
12
CO-IP与质谱分析流程
免疫共沉淀原理和注意事项
13
三 实验的关键
v 1. 实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。 v 2. 为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制
剂，低温下进行实验。
v 3. 考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不 能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多 则抗原被稀释。
【实用】免疫共沉淀PPT文档
液，沸水煮5分钟；
（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱 仪分析。
一、 样品处理：
二、 抗体-agarose beadsads复合物洗涤：
四、 鉴定 构的蛋白质一蛋白质相互作用。
量细胞裂解缓冲液（含蛋白 免疫共沉淀酶 适，与Western blotting或者ELISA相比容易出 用于免疫共沉淀的抗体不总是与操作相合 乙醇沉淀dna和异丙醇沉淀dna的区别 （6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱 质进行N端氨基酸序列分析，推断出相应的 但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。 （2）取少量裂解液以备Western blot分析， 但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。 二、 抗体-agarose beads孵育 疫复合物，然后分离该蛋白质，对该蛋白 用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该
缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在 DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的 乙醇漂洗DNA沉淀数次。
实验流程
（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适
量细胞裂解缓冲液（含蛋白 免疫共沉淀酶
抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于
量量细细胞 胞4裂裂°解解C缓缓冲冲，液液（（最含含蛋蛋大白白转免免速疫疫共共离沉沉淀淀心酶酶30 min后取上清； 将 包含活性物（质的2组）织取或细少量裂解液以备Western blot分析， 量选乙细未醇胞 知 ：剩液裂蛋沉余，解白淀缓会D裂4N冲遇A°液到乙解（障醇C液含碍是缓蛋。首加白慢选的1免摇有μ疫机g晃共溶相沉孵剂淀应，酶育对的盐过类抗夜沉体淀；少加，D入NA到沉淀细中所胞含裂的衡解量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。
《免疫共沉淀》课件
机制。
研究疾病机制： 免疫共沉淀技术 可以用于研究疾 病机制，了解疾 病相关的蛋白质 相互作用和调控
机制。
实验流程及操作
实验材料：抗体、抗原、缓冲液、 离心管等
实验环境：无菌操作台、超净工作 台等
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
实验设备：离心机、显微镜、电泳 仪等
实验人员：具备相关实验技能和操 作经验的人员
关键因素：抗体浓 度、孵育时间、洗 涤次数、复溶缓冲 液
注意事项：避免非 特异性结合、防止 蛋白降解、确保实 验重复性
洗涤步骤：使用洗涤缓冲液洗涤，去除未结合的蛋白 洗涤次数：一般需要洗涤3-5次 检测方法：使用Western Blotting或ELISA等方法进行检测 检测结果：根据检测结果判断免疫共沉淀是否成功
有害气体
穿戴防护服、 手套、口罩等 个人防护用品
实验过程中， 避免直接接触 实验材料，使 用一次性手套
和镊子
实验结束后， 及时清理实验 台面，避免污
染环境
实验过程中， 如出现异常情 况，立即停止 实验，并报告 实验室负责人
实验结束后， 对实验材料进 行妥善处理， 避免污染环境
实验优化与拓展
抗体选择：针对目 标蛋白选择特异性 抗体
免疫共沉淀实验成功分离出目标蛋白 目标蛋白与相互作用蛋白结合，验证了实验假设 实验结果支持了目标蛋白在细胞信号传导中的作用 实验结果提供了对目标蛋白功能的新认识
实验注意事项及常 见问题
确保实验操作在无菌环境下进行，以避免污染。 注意使用新鲜的抗体，避免影响实验结果。 注意控制孵育时间和温度，以保证实验结果的准确性。 在洗涤过程中要彻底洗去未结合的蛋白质，以免干扰实验结果。
洗脱条件：优化洗 脱条件以减少非特 异性结合
研究疾病机制： 免疫共沉淀技术 可以用于研究疾 病机制，了解疾 病相关的蛋白质 相互作用和调控
机制。
实验流程及操作
实验材料：抗体、抗原、缓冲液、 离心管等
实验环境：无菌操作台、超净工作 台等
添加标题
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添加标题
添加标题
实验设备：离心机、显微镜、电泳 仪等
实验人员：具备相关实验技能和操 作经验的人员
关键因素：抗体浓 度、孵育时间、洗 涤次数、复溶缓冲 液
注意事项：避免非 特异性结合、防止 蛋白降解、确保实 验重复性
洗涤步骤：使用洗涤缓冲液洗涤，去除未结合的蛋白 洗涤次数：一般需要洗涤3-5次 检测方法：使用Western Blotting或ELISA等方法进行检测 检测结果：根据检测结果判断免疫共沉淀是否成功
有害气体
穿戴防护服、 手套、口罩等 个人防护用品
实验过程中， 避免直接接触 实验材料，使 用一次性手套
和镊子
实验结束后， 及时清理实验 台面，避免污
染环境
实验过程中， 如出现异常情 况，立即停止 实验，并报告 实验室负责人
实验结束后， 对实验材料进 行妥善处理， 避免污染环境
实验优化与拓展
抗体选择：针对目 标蛋白选择特异性 抗体
免疫共沉淀实验成功分离出目标蛋白 目标蛋白与相互作用蛋白结合，验证了实验假设 实验结果支持了目标蛋白在细胞信号传导中的作用 实验结果提供了对目标蛋白功能的新认识
实验注意事项及常 见问题
确保实验操作在无菌环境下进行，以避免污染。 注意使用新鲜的抗体，避免影响实验结果。 注意控制孵育时间和温度，以保证实验结果的准确性。 在洗涤过程中要彻底洗去未结合的蛋白质，以免干扰实验结果。
洗脱条件：优化洗 脱条件以减少非特 异性结合
染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀（CHIP）实验原理染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。
它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
染色质免疫沉淀实验原理示意图ChIP的一般流程：甲醛处理细胞→收集细胞，超声破碎→加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合→加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀→对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合→洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物→解交联，纯化富集的DNA-片断→PCR分析。
第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎1、取一平皿长满的细胞（10 cm平皿），加入终浓度为1%的甲醛溶液（在9 ml培养液中加入243 μl 37%甲醛）。
2、37℃培养10 min。
3、终止交联加甘氨酸至终浓度为0.125 M。
450 μl 2.5 M甘氨酸溶液于平皿中。
混匀后，在室温下放置5 min即可。
4、吸尽培养基，用预冷的PBS溶液清洗细胞2次。
5、收集细胞于15ml离心管中（如果细胞贴壁，可以使用细胞刮刀，PBS溶液体积依次为5ml，3ml和3ml）。
预冷后2000 rpm 5 min收集细胞。
免疫共沉淀技术推选PPT资料
1.抗P53抗体与HEN1和HEN2细胞总蛋白进行免疫共沉淀。 分离免疫沉淀复合物 3.切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱分析
，得到相应肽列标签 4.搜索数据库分析目的蛋白相关数据进行后续研究
染色质免疫沉淀 (Cபைடு நூலகம்IP)
➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与 基因表达的关系。
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
照 设
阳性对照：如组蛋白抗体
置 阴性对照：阴性引物
功能基因组学基因表达调控
➢基因表达:反式因子和顺式作用元件之间 相互作用。
➢真核生物的基因组DNA以染色质的形式存 在。
➢研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互 作用是阐明真核基因表达机制的基本途 径。
谢谢！
CHIP原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合 物
将其随机切断为一定长度范围内的染色 质小片段
通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性 地富集目的蛋白结合的DNA片段
对目的片断的纯化与检测
操作步骤
一、固定 在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质－DNA复
合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手 段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。
最后通过免疫印迹或质谱检测目的蛋白。 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为影响。
原 理 流 程 示 意 图
操作流程
免疫共沉淀实验流程
(1)蛋白样品准备 （如果为细胞样品需先裂解）
(2)抗原抗体结合反应
(3)Protein A/G 与抗原抗体复合物结合
(4)免疫复合物与protein A/G 解离 （2%SDS煮沸处理）
，得到相应肽列标签 4.搜索数据库分析目的蛋白相关数据进行后续研究
染色质免疫沉淀 (Cபைடு நூலகம்IP)
➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与 基因表达的关系。
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
照 设
阳性对照：如组蛋白抗体
置 阴性对照：阴性引物
功能基因组学基因表达调控
➢基因表达:反式因子和顺式作用元件之间 相互作用。
➢真核生物的基因组DNA以染色质的形式存 在。
➢研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互 作用是阐明真核基因表达机制的基本途 径。
谢谢！
CHIP原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合 物
将其随机切断为一定长度范围内的染色 质小片段
通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性 地富集目的蛋白结合的DNA片段
对目的片断的纯化与检测
操作步骤
一、固定 在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质－DNA复
合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手 段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。
最后通过免疫印迹或质谱检测目的蛋白。 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为影响。
原 理 流 程 示 意 图
操作流程
免疫共沉淀实验流程
(1)蛋白样品准备 （如果为细胞样品需先裂解）
(2)抗原抗体结合反应
(3)Protein A/G 与抗原抗体复合物结合
(4)免疫复合物与protein A/G 解离 （2%SDS煮沸处理）
免疫共沉淀 研究生实验课32页PPT
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 ห้องสมุดไป่ตู้。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
免疫共沉淀 研究生实验课
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— 陈鹤琴
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 ห้องสมุดไป่ตู้。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
免疫共沉淀 研究生实验课
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— 陈鹤琴
【高质量】免疫共沉淀-研究生实验课PPT文档
合的物质。做 preclear 的IgG 是不针对特异性抗原的。
琼脂糖珠的选择
SEPHAROSE是注册商品名, 本身是agarose做的凝胶。
转移上清液至一新管中，将每管总蛋白定量至500-2000 (250-1000) μ g，用lysis Buffer将体积补齐至600-800 μ l。 加入AKT兔抗人多克隆抗体10 μ l，4℃ 转鼓过夜(10min) ；
将裂解液转移至EP管中，4℃转鼓摇15min ，14000g 4℃离心15min
将tag构建到蛋白的N端还是C端，也是一个潜在的能够影响coIP结果的因素。
； 没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或者检测得到的信号太弱
Myc、HA、Flag-tagged：Myc仍然会有天然的干扰，应用略有局限；
T对A某P 些tag体不外能生用吸化于反取分应析的上钙蛋调清白信原号液料通的到路纯。新化制E备P也管是很中重要，的每辅助管依据加。1μg 对照兔IgG，同时加入Protein
每种细胞的裂解条件不一样，通过经验确定。
做 preclear 的AIgGa是ga不r针o对se特，异性4抗℃原转的。鼓转30min，4℃ 10000g 离心5min；
仔细检查抗体的说明书。
preclear及其作用 一旦细胞被匀浆化，各个departments就不存在了，每个蛋白都会与其他所有蛋白有接触的机会，所以，发生一些unexpected修饰（或
此时，磁珠是最佳的选择。
A然ff而in由ity于Ta其gs中相包含似钙调的蛋成白和分蛋白(如A的无相互关作用IgdoGm)ain,，用天然一会抗结合相钙信应号来相关源蛋白的，I从g而G干与扰或蛋掩白盖靶裂蛋白解与液钙信和号蛋白之间的相
互作用，有一定的应用局限。
琼脂糖珠的选择
SEPHAROSE是注册商品名, 本身是agarose做的凝胶。
转移上清液至一新管中，将每管总蛋白定量至500-2000 (250-1000) μ g，用lysis Buffer将体积补齐至600-800 μ l。 加入AKT兔抗人多克隆抗体10 μ l，4℃ 转鼓过夜(10min) ；
将裂解液转移至EP管中，4℃转鼓摇15min ，14000g 4℃离心15min
将tag构建到蛋白的N端还是C端，也是一个潜在的能够影响coIP结果的因素。
； 没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或者检测得到的信号太弱
Myc、HA、Flag-tagged：Myc仍然会有天然的干扰，应用略有局限；
T对A某P 些tag体不外能生用吸化于反取分应析的上钙蛋调清白信原号液料通的到路纯。新化制E备P也管是很中重要，的每辅助管依据加。1μg 对照兔IgG，同时加入Protein
每种细胞的裂解条件不一样，通过经验确定。
做 preclear 的AIgGa是ga不r针o对se特，异性4抗℃原转的。鼓转30min，4℃ 10000g 离心5min；
仔细检查抗体的说明书。
preclear及其作用 一旦细胞被匀浆化，各个departments就不存在了，每个蛋白都会与其他所有蛋白有接触的机会，所以，发生一些unexpected修饰（或
此时，磁珠是最佳的选择。
A然ff而in由ity于Ta其gs中相包含似钙调的蛋成白和分蛋白(如A的无相互关作用IgdoGm)ain,，用天然一会抗结合相钙信应号来相关源蛋白的，I从g而G干与扰或蛋掩白盖靶裂蛋白解与液钙信和号蛋白之间的相
互作用，有一定的应用局限。
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二、原理
在活细胞状态下固定 蛋白质—DNA复合物， 并将其随机切断为一 定长度范围内的染色 质小片段，然后通过 免疫学方法沉淀此复 合物，特异性地富集 目的蛋白结合的DNA 片段，通过对目的片 段的纯化与检测，从 而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。
三、技术流程
具 体 操 作 流 程
DNA分析
四、应用
组蛋白修饰研究 转录调控分析 药物开发研究 有丝分裂研究 DNA损伤与凋亡分析
五、优缺点
优点：充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用 的真实情况，可以找出生理条件下某个DNA结合 蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因 表达调控的真实情况。 缺点：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难以获得； 为了获得高等丰度的结合片段，必须实验演示胞 内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的 基因获取可能需要限制在组织来源。
3.免疫沉淀蛋白和DNA复合物
ChIP稀释液稀 释10倍
加入20μl蛋白 A/G琼脂糖珠
？ 超声染色质液体
？ 2ml超声稀释液
4℃摇床摇动一小时
1000rmp离心2min（4℃） 取50μl上清 液作为对照
1-4μl免疫沉淀 抗体
转移上清液至新离心管
4、收获免疫复合物（抗体-蛋白质-DNA）
样品
等量酚/氯仿/ 异戊醇 （25:24:1）
1/10体积 3mol/l乙酸钠 2倍体积冰冻 无水乙醇
Байду номын сангаас√ √
-80℃冰 箱 1h.1200 0rmp离 心20min， 弃上清
8、染色质免疫共沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA 上结合位点的鉴定
(1)如果目的蛋白靶序列已知，或怀疑某一序列 是目的蛋白靶序列，则可选用定量或者半定 量PCR方法。 (2)如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋 白基因组分布情况，找出转录因子结合位点， 则可采用ChIP克隆测序，ChIP-chip，和ChIPseq方法。
40μlProtein A/G Agarose Beads
1×PBS洗3次离心 1000rpm,1min.弃上清， 用4μl 1×PBS悬浮
摇动1-2h，4℃
1000rpm,离心5min,4℃ a 低盐洗脱溶液1ml洗一次 b 高盐洗脱溶液1ml洗一次 c氯化锂洗脱溶液1ml洗一次 d TE溶液(pH8.0)1ml洗两次
染色质免疫共沉淀(ChIP)
目录
一、简介
电泳迁移率变动分析
生物信息学方法
ChIP
酵母单杂交系统
DNA与 蛋白质 相互作 用研究
DNase Ⅰ足纹法
一、简介
ChIP 是目前唯一研 究体内DNA与 蛋白质相互作 用的方法。不 仅可以检测体 内反式因子与 DNA的动态作 用，还可以用 来研究组蛋白 的各种共价修 饰与基因表达 关系。
1、甲醛交联细胞
弃上清
具 体 步 骤
10 ml1×PBS
4000rpm 离心5min 1ml预冷 1×PBS 4000rpm 悬浮 离心5min
新离心管
1ml1.25mol/L 甘氨酸
室温10-20min 预冷1×PBS 洗涤两次
弃上清
4-5ml预冷1 × PBS
转移
2、染色质超声断裂
1.加SDS裂解溶液重悬浮沉淀，冰上10min. 每1min颠倒摇动一次离心管。 2.把DNA粉碎为长度200-1000bp，置于冰上。 不同样本都进行超声条件优化实验。 3.14000rpm离心10min（4℃），转移上清于 1.5ml离心管。
弃上清 每次洗时，在摇床 上摇10min,4℃， 4000rpm离心 5min
5、洗脱免疫复合物
Beads 摇床上摇动10min 12000rpm离心1min
200μlChIP洗脱 溶液洗脱
Beads
200μl,ChIP洗脱溶液 (3次)
取上清
取上清
600μl洗脱液
6、去除甲醛交联
①加5mlNaCl使用NaCl终浓度为 0.2mol/l ②阴性对照+350μlChIP洗脱溶液 +16μl 5mol/l NaCl。 ③65℃,过夜,去交联。
7、DNA纯化 ①酚/氯仿抽提
实验样本 50μl阴性 (600μl) ②硅胶柱纯化 对照
10μlRNase
50μl蛋白酶K
√
√ √ 上清液
√
√ √ 上清液 √ √
12000rmp 离心5min 加入70% 乙醇，悬 浮沉淀， 12000rpm 离心 10min， 去上清， DNA干燥 后， 40μlTE 溶解