线粒体基因全分析及进化树的构建毕业论文

1、前言（Introduction）英国《自然》杂志网络版2006年5月18日报道，科学家已对含有2.23亿个碱基对，占人类基因组中碱基对总量的8%左右的人类第一号染色体完成测序，宣告持续16年的人类基因组计划全部完成。

作为人类自然科学史上重要的里程碑，“人类基因组”的研究已从“结构基因组”阶段进入“功能基因组”阶段。

在人类基因组计划后相继推出的水稻基因组计划、马铃薯基因组计划、草鱼基因组计划等，和快速增长的微生物基因测序，“海量”的基因信息的积累，催生了“功能基因组”时代的来临。

针对充分利用“海量”基因组信息的生物信息学不仅应运而生，而且为以注释、阐明基因功和利用基因生物学功能的“后基因组时代”的研究发挥了重大作用。

生物信息学是把基因组DNA序列信息分析作为源头,在获得了蛋白质编码区的信息后,进行蛋白质空间结构的预测和模拟,然后依据特定蛋白质的功能进行必要的药物设计。

就是说,生物信息学的主要任务是组织和分析生物学数据,而生物学数据的分析离不开计算机算法的运用。

因此,可以说生物信息学是一门集生命科学、计算机科学、数学、物理学为一身的多学科交叉的前沿学科。

动物mtDNA属母系遗传，是共价闭合的双链DNA分子，核酸序列和组成比较保守，基因的排列顺序比较稳定而且紧密，无重组和单拷贝。

由于其结构和进化上的特点，mtDNA已成为研究动物起源进化以及群体遗传分化的理想对象。

昆虫mtDNA大小约为15．4~16．3kb，其基因组大小的变化受A+T-rich区长度变化的影响十分显著。

A+T-rich 区(A+T丰富区)的长度最短为399 bp，最长达4601 bp，两者相差4202bp，前者见于Tricholepidion gertschi，后者见于黑尾果蝇Drosophila melanogaster。

昆虫线粒体基因组由2个rRNA基因(1rRNA和srRNA)、22个tRNA基因、13个蛋白编码基因[Cytb基因(细胞色素b基因，cytochrome oxidase b)，ATPase6和ATPase8(ATP酶亚基基因6和8，ATP synthase subunits 6 and 8)，COⅠ、COⅡ和COⅢ(细胞色素氧化酶亚基基因Ⅰ-Ⅲ，cytochrome oxidasesubunit Ⅰ-Ⅲ)，NDl-6和ND4L(NADH降解酶基因1~6和4L，NADH dehydrogenase subunit 1-6 and 4L)]，共37个基因和1个包含复制启动子的非编码区(A+T-rich区)组成。

Aloni 和Attardi将mtDNA两条链中密度较小者命名为轻链(L链)，另一条命名为重链(H链)。

考虑到昆虫mtDNA没有明显的L链与H链之分，Simon等根据昆虫mtDNA中多数基因都是从一条链上转录的特点，将这一条链定义为J链，另一条链定义为N链[1-3]。

自Wolstenholme和Clary第一个报道了果蝇Drosophila yakuba mtDNA全序列以来，GenBank已收录了80余种昆虫mtDNA全序列，其中双翅目昆虫有15个种。

在双翅目实蝇科昆虫中，地中海实蝇Ceratis capitata和油橄榄果实蝇Bactrocera oleae的线粒体基因组全序列已有报道[4]。

梨小食心虫，学名Grapholitha molesta (Busck)，简称“梨小”，别名有梨小蛀果蛾、东方果蠹蛾、梨姬食心虫、桃折梢虫、小食心虫、桃折心虫。

属于鳞翅目(Lepidoptera)，小卷叶蛾科(Olethreutidae )。

梨小在各地果园均有发生，是梨树的重要害虫，在梨、桃树混栽的果园为害尤为严重。

梨小除为害梨、桃树外，也为害李、杏、苹果、山楂等，严重影响果品质量及梨果产量，尤其是长江、黄河流域最严重[5]。

因此，我的论文是通过NCBI 下载的梨小食心虫的全线粒体基因，并对其结构和功能进行分析。

2、材料和方法（Marerials and Methods ）2.1、研究思路2.2、搜索基因2.2.1、在NCBI 中搜索梨小食心虫线粒体全基因序列方法：首先进入NCBI 的官网，在Search 中选择All Databases,在查询框中输入Grapholita molesta mitochondrion ，点击Search,然后选择Geneome,总共出现一条记录，即选择NC 014806, Display 选择为Genbank,选择Download 中的Genbank 格式，即可下载得到梨小食心虫的线粒体全基因序列。

2.2.2、用DNAMAN 分析其基因结构对于获取的海量数据，我们要先进行一些基本的分析，确定基因的分子量、碱基的组成等信息。

方法：选取梨小食心虫的线粒体基因，选取显示的方式为包含cds,点击确认，即可。

2.2.3、碱基同源性分析的方法方法：进入网址：，在序列中提交NC 014806，其他选项默认设置。

通过在线的BLAST的比对，可以找到与梨小食心虫线粒体同源性最高的物种，从而可通过研究其同源性高的物种，间接研究该物种，为该物种的进一步研究提供一定的理论依据。

2.2.4、开放性阅读框（ORF）分析的方法方法：利用NCBI的ORF Finder程序对NC 014806做开放性阅读框分析。

网址如下：参数选择：Genetic Codes：1 Standard开放阅读框[open reading frame,0RF] 是结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的阅读框可编码完整的多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子。

ORF的识别是证明一个新的DNA序列为特定的蛋白质编码基因的部分或全部的先决条件[6]。

通过ORF的分析，我们可以确定全基因中哪段基因片段可以翻译为蛋白质，从而为特定蛋白质的功能的确定提供依据。

2.3、基因编码蛋白质的理化性质分析利用ExPaSy中的Protparam和Protscale进行蛋白质的氨基酸组成、分子质量、等电点以及疏水性分析[7]。

2.3.1、氨基酸组成、分子质量、等电点分析方法利用ExPaSy软件包中的Protparam工具进行氨基酸组成、分子质量、等电点分析网址如下：通过氨基酸组成、分子质量、等电点分析，我们可以确定编码蛋白的最基本性质，为进一步研究蛋白质的二级结构、三级结构提供依据。

2.3.2、亲疏水性分析方法利用瑞士生物信息学研究所（Swiss Institute of Bioinformatics，SIB）的ExPASy服务器上的ProtScale程序对ORF 翻译后的氨基酸序列SEQUENCE进行亲疏水性分析网址如下：参数选择：Hphob. / Kyte & Doolittle正值表明疏水，负值表明亲水。

通过疏水性分析，可以让我们了解蛋白质是否属于亲水蛋白。

2.4、基因编码蛋白质的结构分析2.4.1、蛋白质的二级结构分析方法：利用Expasy服务器下的SWISS-MODEL中的Psipred进行蛋白序列的二级结构分析网址：/workspace/index.php?func=tools_targetidentification1蛋白质二级结构:指蛋白质肽链本身的折叠和盘绕的方式。

二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角。

常见的二级结构有α-螺旋和β-折叠。

二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的，氢键是稳定二级结构的主要作用力。

蛋白质二级结构预测，是通过氨基酸序列，预测蛋白质二级结构的过程。

氨基酸序列具有不同的长度，不同的氨基酸排列顺序。

实验分析表明这种差异能够形成不同的蛋白质结构。

研究蛋白质的结构意义重大，不但有助于了解蛋白质的作用，了解蛋白质如何行使其生物功能，认识蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而且对生物学、医学和药学都有非常重要的作用[8]。

2.4.2、蛋白质的三级结构分析方法：将分析的结果向蛋白质立体结构数据库PDB ( Protein Data Bank)提交该蛋白质序列，利用RasMol软件显示该蛋白的三维分子结构蛋白质三级结构（protein tertiary structure）: 蛋白质分子处于它的天然折叠状态的三维构象。

三级结构是在二级结构的基础上进一步盘绕，折叠形成的。

三级结构主要是靠氨基酸侧链之间的疏水相互作用，氢键，和盐键（离子键）维持的。

此外共价二硫键在稳定某些蛋白质的构象方面也起着重要作用。

通过研究蛋白质的三级结构，可以让我们更直观的通过其结构了解其功能性，从而为蛋白质功能的确定提供有力的依据[9]。

2.5、基因编码蛋白质的功能分析2.5.1、信号肽预测的方法方法：利用丹麦科技大学（DTU）的CBS服务器蛋白质序列的信号肽（signal peptide）预测，进入Prediction Serves 页面。

网址如下：参数选择：Eukaryotes；Both；GIF (inline)；Standard信号肽，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N端）。

信号肽位于的N端。

一般由15~30个氨基酸组成。

包括三个区：一个带正电的N 末端，称为碱性氨基末端：一个中间疏水序列．以中性氨基酸为主，能够形成一段d螺旋结构，它是信号肽的主要；一个较长的带的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点．也称加工区。

信号肽的作用，可使正在翻译的核糖体附着到RER膜上，还可以在信号肽指引下蛋白质在细胞内[10]。

通过信号肽的预测，可以让我们知道蛋白质是如何跨膜转移的。

2.5.2、磷酸化位点分析的方法方法：磷酸化和去磷酸化是细胞内信号传导的重要方式，利用丹麦科技大学（DTU）的CBS服务器上的NetPhos2.0 Server程序做磷酸化位点分析。

NetPhos2.0 Server程序是基于神经网络算法，对蛋白序列中的Ser、Thr和Tys三种氨基酸残基可能成为的磷酸化位点作出预测。

网址如下：蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,它参与和调控生物体内的许多生命活动.通过蛋白质的磷酸化与去磷酸化,调控信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程.随着蛋白质组学技术的发展和应用,蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视[11]。

2.5.3、亚细胞定位的方法方法：通过WoLF PSORT工具基于其氨基酸序列预测蛋白质亚细胞定位点网址如下：参数选择：Fungi；From Text Area亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位。

例如在核内、胞质内或者细胞膜上存在。

GFP是绿色荧光蛋白，在扫描共聚集显微镜的激光照射下回发出绿色荧光，从而可以精确地定位蛋白质的位置[12-14]。

2.5.4、二硫键分析的方法运用scratch protein Predictor 对蛋白质的二硫键做出分析。