Gn1a - Cytokinin Oxidase Regulates Rice Grain Production(细胞色素氧化酶对水稻产量的调控)

细胞色素氧化酶对水稻产量的调控

调控绝大部分重要农艺性状的基因都是数量性状基因，这些基因一般起源于等位基因的自然变异。本文介绍的一个水稻增产QTL Gn1a是能产生细胞色素氧化/脱氢酶（OsCKX2）的基因，后则能使细胞分裂素降解。OsCKX2表达量的减少导致细胞分裂素在花序分生组织中积累，进而导致生殖器官的增加，最终使产量增加。聚合了控制粒数和株高位点的具有相同遗传背景的株系都表现出了有利性状。

食物短缺是本世纪最严重的全球问题之一。联合国粮农组织（FAO）估计2000-2002年有8.52亿人营养不良。64亿全球人口仍在快速增长，预计到2050年将达到89亿。无论直接食用还是饲养动物，谷物都是人类主要的能量来源。人类消耗的50%的热量来自于3种谷物：水稻（23%）、麦（17%）、玉米（10%）。为了满足人口快速增长对食物的需求，谷物产量在2025年必须增加50%。

包括产量在内的大多数主要的农艺性状都表现为连续的变异。这些复杂的性状大多受到起源于自然变异的QTLs的控制。QTL分析已经成为发掘有益农艺性状基因的有效途径。

水稻是一种主要的粮食作物。由于水稻基因组在主要的几种谷物中是最小的（390Mb），且其基因组与其他谷物的基因组有同源性，还容易转化，所以水稻成了单子叶植物的模式植物。因此，人们发掘了许多水稻突变体和分子标记，并对水稻进行了测序和作图。这些成果有利于进行水稻QTL分析。粒数和株高是直接影响产量的重要农艺性状。水稻和小麦矮化育种是导致60年代绿色革命的经典育种方法。这些矮化作物能获得高产是由于这些作物在暴风雨中能抗倒伏。近十年里有许多产量和株高QTLs方面的研究，然而这些QTL中的基因还没有被鉴定出来，它们在染色体上的位置也还不可知。我们的目标就是鉴定出这些控制粒数和株高的数量性状基因，阐明其分子机理，并将其应用于育种实践。

QTL analysis：选择表型差异大的双亲进行QTL分析是必要的，因为QTL的检测就是基于双亲自然等位基因的差异。我们选择了籼稻Habataki和粳稻Koshihikari作为研究材料，因为两者之间的农艺性状有巨大差异，还有许多可用的分子标记。Habataki的平均株高要比Koshihikari矮，但主穗谷粒数较多(Fig.1,A to D)。

我们构建了96个Habataki和Koshihikari的回交自交系(BILs)作为初级作图群体。作图群体的粒数和株高近似呈正态分布，表明这两个性状都受QTl控制(fig.S1)。QTL分析检测到了5个增加粒数(Gn)的QTLs和4个控制株高(Ph)的QTLs(Table1and Fig.1E)。效应最大的株高QTL Ph1定位于编码赤霉素20氧化酶的矮秆基因sd1的附近。比较Habataki和Koshihikari 的SD1基因发现Habataki在赤霉素20氧化酶的编码区有383bp的缺失，这个功能缺失基因导致Habataki株高降低。Habataki在赤霉素20氧化酶编码区的缺失跟曾经引导了绿色革命的IR8中发现的变异是一样的。

效应最大的增加穗粒数的QTL Gn1位于第一号染色体上，它被进一步研究。Habataki的Gn1等位基因比Koshihikari的等位基因每穗多产生约92颗谷粒，Gn1能解释两者在主穗谷粒数上44%的差异(Table1)。迄今为止，已经有许多水稻产量相关的QTL被报道。其中一些QTLs位于1号染色体短臂上的Gn1附近，这表明它们可能是同一个QTL。虽然这些QTLs还

未被鉴定，Gn1位点能使一些水稻品种增产是可能的。Gn1的重要增产能力表明它是一个很好的克隆候选基因。

QTL cloning。在QTL克隆中构建支行有目标QTL的近等基因系（NILs）能消除其他QTLs 的影响。NILs中目标QTL的效应可以被看做是单个孟德尔遗传因子。我们构建了携带了Habataki Gn1位点的Koshihikari NIL-Gn1来对Gn1进行作图。

我们用来自NIL-Gn1的杂合植株(Gn1/gn1)的96个F2对Gn1进行了初步定位，发现Gn1由QTL-Gn1a和QTL-Gn1b两个位点构成。QTL-Gn1a被定位于R3192和C12072S之间2cM的区间内，QTL-Gn1b则被定位于QTL-Gn1a的上游（Fig.1,F and G）。由于Habataki的Gn1a 和Gn1b的效应相当，且Gn1a的在两个引物之间的位置很明确，所以选择Gn1a作为克隆对象。Habataki的Gn1a为半显性，杂合子（(Gn1a/gn1a)的谷粒数介于gn1a/gn1a和Gn1a/Gn1a 之间(Fig.1J)。

约用了13000个来自NIL-Gn1a杂合株（Gn1a/gn1a）的F2进行Gn1a的高通量作图。Gn1a 的候选区域被缩小到分子标记3A28和3A20之间的6.3kb的区域内(Fig.1H)。该区域在水稻基因组信息自动注释系统内预测到一个与细胞分裂素氧化脱氢酶基因(CKX)OsCKX2高度同源的ORF（Fig.1H）。Koshihikari和Habataki的OsCKX2基因包含4个外显子和3个内含子，分别编码565或563个氨基酸的蛋白。两者的DNA序列比较表明Habataki在5’端非编码区有16bp的缺失，在第一外显子有6bp的缺失，在第1和第4外显子上由于3个核苷酸的差异导致了氨基酸序列的差异（Fig.1I）。

我们还分析了中国3个高产水稻5030、5150以及90B2的OsCKX2等位基因的核苷酸序列。5150主穗谷粒数多大400颗(Fig.1,C and D)，我们在它的编码区发现了一个11bp的缺失。5030和90B2的序列则与Habataki一致。OsCKX2基因的缺失和谷粒数增加表明OsCKX2基因功能缺失或表达量下调将导致增产。

为了确认OsCKX2基因育Gn1a是对应的，我们构建了OsCKX2表达水平不同的转基因植株，并对其进行测产。由于Koshihikari和Habataki的愈伤组织无法产生绿芽，我们选择了含有KoshihikariOsCKX2等位基因且易于组培的Taichung65(TC65)。携带了2个OsCKX2有义链重复的转基因植株相比于TC65谷粒数减少，相反，携带了OsCKX2反义链的转基因植株的谷粒数比TC65多（(Fig.1K and fig.S2）。因此我们认为能使谷粒数增加的Gn1a就是OsCKX2。

Molecular analysis of OsCKX2。细胞分裂素（CK）最初被当做促进植物细胞分裂的植物激素而发现。现在发现CK影响着植物生长发育的许多方面，包括种子萌发、顶端优势、叶片伸展、生殖发育已经延缓衰老。自然的CKs如反式玉米素（tZ）和iP都是含有类异戊二烯链的腺嘌呤N6取代衍。CKX是降解CK的N6-类异戊二烯侧链的专一性酶。这种异化酶是植物组织中CK水平的最主要的调控因子。

为了搞清楚OsCKX2位点是否影响CKs的代谢，我们分析了Koshihikari、Habataki、NIL-Gn1a 以及5150花序分生组织中CKs的含量。tZ的含量没有差异，但Habataki、NIL-Gn1a以及5150的CK核苷酸（i.e.,tZRMP and iPRMP）含量比Koshihikari的更丰富（Fig.2A）。由于CK代谢过程中对腺嘌呤的修饰与腺嘌呤代谢途径部分重叠，CKs的腺嘌呤部分被转化为对应的核苷酸和核苷。本文中但Habataki、NIL-Gn1a以及5150核苷酸的积累可解释为CKX活性的降