猪链球菌2型毒力因子研究进展

猪链球菌2型毒力因子研究进展

摘要：猪链球菌是重要的人兽共患病，尤以猪链球菌2型最为流行。通过对猪链球菌2型毒力因子的研究，已确定几种主要毒力因子，研究中又发现几种新型的毒力因子，期望从这些毒力因子当中发现它们的功能及其相互关系，揭开猪链球菌感染的神秘面纱，进而控制猪链球菌病的发生。

关键词：猪链球菌2型；主要毒力因子；新型毒力因子

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是世界范围内引起猪链球菌病最主要的病原，也是重要的人畜共患病病原体，根据菌体荚膜多糖抗原性的不同，分为35个血清型（1—34型，1/2型）[1,2]。可以引起猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎、肺炎、流产、多浆膜炎及人的急性脑膜炎、永久性耳聋、感染性中毒性休克综合症等疾病，严重的可导致死亡[1,3,4]。主要致病血清型为SSl、SS2、SSl／2、SS7、SS9和SSl4，其中以SS2流行最广、致病性最强[5]。我国发生的猪链球菌病主要由C群和D群引起。由猪链球菌2型引起的猪链球菌病，过去在欧洲、南亚、北美一些国家流行比较多，但近些年在我国也时常发生。国内1991年在广东省首次分离鉴定到SS2；1998年我国江苏发生的猪链球菌2型引起的链球菌病造成几十人感染，十余人死亡；2005年在四川发生的猪链球菌2型引起的链球菌病导致206人感染，38人死亡；2006年9月，广西某猪场发生由猪链球菌2型引起的链球菌病，导致多头猪只死亡，所幸无人感染。由于猪链球菌2型引起的链球菌病属人兽共患病，死亡率较高，不仅可造成巨大的经济损失，而且给公共卫生带来严重威胁。从2007年至2010年，每年暑假我都去猪场实习，发现我所到的几个猪场都将链球菌病列入免疫程序当中，可见人们对链球菌的恐惧并未消除。

SS2存在着强致病力、弱致病力和无致病力菌株。强致病株引起猪严重的临床症状，并能从中枢神经系统分离出病菌。弱致病力菌株仅引起温和的临床症状，偶尔能从中枢神经系统分离出该菌。无致病菌力株不引起临床症状。其致病力的差异与各菌株的毒力因子直接相关，猪链球菌的毒力因子较为复杂，已知猪链球菌的主要毒力因子有溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外蛋白因子(EPF)、溶血素(SLY)、荚膜多糖(CPS)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(FPBS)、毒力相关序列ORF2、谷氨酸脱氢酶(GDH)等，不同地区分离的猪链球菌菌株，其毒力因子出现的概率也不一样，尚缺乏统一的评价标准[6-9]。引起脑膜炎、败血症和关节炎综合症的猪链球菌大约只有一半能用目前发现的毒力因子作为检测指标。因此，探索新的毒力因子已成为该领域的研究热点和重点[3]。

1 主要毒力因子

MRP和EPF在致病性菌株检出率很高，在非致病性菌株中检出率极少，常作为判断致病性的指标之一；SLY分不具有很强的地域性，且在猪链球菌粘附和裂解Hep-2细胞的过程中发挥了重要的作用，纯化的SLY能导致人脑微血管内皮单层细胞产生病变；FPBS在细菌定植靶器官的过程中起到一定的作用；毒力相关序列ORF2在强弱毒株之间的序列存在差异，这种差异可能导致菌株致病性不同；GDH和CPS与猪链球菌的血清型分型有关，同时又都是毒力因子。

2 新型毒力因子

2.1 反应调节因子RevS基因

反应调节因子RevS基因是在2002年发现的SS2的第一个反应调节因子，并被证明是一个

孤立的反应调节因子。通过动物竞争试验证明反应调节因子RevS基因与SS2在机体器官内的定居有关，其在细菌的发病机制中可能起着重要的作用。

鞠爱萍用我国四川资阳人源分离株05ZYH33为研究对象，研究探讨了RevS基因对该菌株致病性的影响及其可能的机制，构建中间为壮观霉素抗性基因，两侧为RevS编码基因上、下游同源序列的基因敲除载体，通过同源重组和PCR法鉴定，获得RevS编码基因完全被壮观霉素抗性基因替代的突变株。该基因敲除后细菌的稳定性、生长曲线、菌落形态、溶血性、染色情况、镜下形态及蛋白表达等基本生物学性状没有发生明显的改变。动物感染试验显示，RevS突变体对小鼠的致病性显著减弱，但对其主要宿主猪的致病性未见显著改变[10]。这表明国内强毒株RevS突变体对猪致病性没有明显减弱，这种差异可能与实验动物的种类、大小、接种途径和剂量的不同有关，但也不排除国内毒株存在独特的致病因子和致病机制的可能[3]。

2.2 蛋白酶

Jobin M C等对致病性SS2产生的一系列蛋白酶进行了研究，先后发现了分子质量55 ku 的精氨酸氨基肽酶、胰凝乳蛋白酶样和具有酪蛋白酶活性的物质及在SS2细胞内和培养液上清中的70 ku的肽酶活性物质(DPP IV)。精氨酸氨基肽酶、酪蛋白酶和DPP IV活性在所有的被检测的SS2中均可检查到，而胰凝乳蛋白酶活性只在欧洲分离的致病性SS2株检测到。这种蛋白酶的最佳pH为6--8，最佳温度为25℃--42℃[11]，这是关于致病性SS2产生的蛋白酶的首次报道，进一步的研究需搞清这些蛋白酶对细菌致病性的影响。

2.3 38、45、39、44 ku蛋白

Okwumabua O等[12]用SS2的全细菌蛋白的多克隆抗体构建和筛选了一个基因文库，从这个基因文库中寻找到了一个长为2.0 kb的DNA片段。该基因编码的多肽含有445个氨基酸残基，分子质量为38 ku。该蛋白位于细菌表面，可从细胞壁提取物中分离到，并可与SS2感染的猪阳性血清反应，表明该蛋白可作为诊断用抗原。以该蛋白免疫的猪可抵抗野生型株SS2的感染，因此该蛋白可用于疫苗的构建。

用同样的方法，发现了一个与谷氨酸脱氢酶同源的蛋白片段。该片段由长1.6 kb的Dral 区编码，分子质量为45 ku，具有谷氨酸脱氢酶活性，具有良好的免疫原性。

Quessy S等早在1997年就发现了一种分子质量为39 ku的蛋白。该蛋白与白蛋白有良好的结合活性，其N末端与甘油醛三磷酸脱氢酶高度同源。进一步研究表明，在猪链球菌肉汤培养基中添加白蛋白可导致猪链球菌毒力的增加。因此认为，该蛋白与白蛋白的相互作用是导致SS2的感染发病的一个重要机制。

Gott schalk M等以高致病力的SS2为基础，构建了2株无致病力的细菌突变体，通过对比，发现一种分子质量为44 ku的胞壁蛋白存在于亲本株中，而在突变菌株中不存在，该蛋白具有很好的免疫原性，被认为是SS2的毒力因子之一[3]。

2.4 纤维蛋白溶血酶原

Jobin M C等[13]研究了致病性SS2的纤维蛋白溶血酶原的结合活性。发现人和猪的纤维蛋白溶血酶原均可以和SS2结合，这种结合可以被￡氨基己酸抑制。SS2表面的纤维蛋白溶血酶原受体具有耐热和耐十二烷基磺酸钠的特性。其中的一个受体被确认为甘油醛一3一磷酸脱氢酶。SS2的这种纤维蛋白溶血酶原结合活性足以激活游离的纤维蛋白溶血酶原，反过来可以降解纤溶酶(纤维结合素)，这是有关致病性SS2纤维蛋白溶血酶原结合活性的首次报道，但是这种结合活性与细菌毒力的关系仍不清楚。

2.5 89 kb毒力岛

Chen C等[14]研究发现，强致病株98HA／H12和05ZY／H33染色体中均有一个约89 kb的特有核酸片段，生物信息学分析该片段具有基因组毒力岛(patlaogenicity island,PAI)的特征。该PAI仅存在于中国流行株。89 kb毒力岛G+C含量为36．8％，远低于基因组的G+C含量