猪链球菌2型毒力因子研究进展

猪链球菌2型毒力因子研究进展
摘要：猪链球菌是重要的人兽共患病，尤以猪链球菌2型最为流行。

通过对猪链球菌2型毒力因子的研究，已确定几种主要毒力因子，研究中又发现几种新型的毒力因子，期望从这些毒力因子当中发现它们的功能及其相互关系，揭开猪链球菌感染的神秘面纱，进而控制猪链球菌病的发生。

关键词：猪链球菌2型；主要毒力因子；新型毒力因子
猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是世界范围内引起猪链球菌病最主要的病原，也是重要的人畜共患病病原体，根据菌体荚膜多糖抗原性的不同，分为35个血清型（1—34型，1/2型）[1,2]。

可以引起猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎、肺炎、流产、多浆膜炎及人的急性脑膜炎、永久性耳聋、感染性中毒性休克综合症等疾病，严重的可导致死亡[1,3,4]。

主要致病血清型为SSl、SS2、SSl／2、SS7、SS9和SSl4，其中以SS2流行最广、致病性最强[5]。

我国发生的猪链球菌病主要由C群和D群引起。

由猪链球菌2型引起的猪链球菌病，过去在欧洲、南亚、北美一些国家流行比较多，但近些年在我国也时常发生。

国内1991年在广东省首次分离鉴定到SS2；1998年我国江苏发生的猪链球菌2型引起的链球菌病造成几十人感染，十余人死亡；2005年在四川发生的猪链球菌2型引起的链球菌病导致206人感染，38人死亡；2006年9月，广西某猪场发生由猪链球菌2型引起的链球菌病，导致多头猪只死亡，所幸无人感染。

由于猪链球菌2型引起的链球菌病属人兽共患病，死亡率较高，不仅可造成巨大的经济损失，而且给公共卫生带来严重威胁。

从2007年至2010年，每年暑假我都去猪场实习，发现我所到的几个猪场都将链球菌病列入免疫程序当中，可见人们对链球菌的恐惧并未消除。

SS2存在着强致病力、弱致病力和无致病力菌株。

强致病株引起猪严重的临床症状，并能从中枢神经系统分离出病菌。

弱致病力菌株仅引起温和的临床症状，偶尔能从中枢神经系统分离出该菌。

无致病菌力株不引起临床症状。

其致病力的差异与各菌株的毒力因子直接相关，猪链球菌的毒力因子较为复杂，已知猪链球菌的主要毒力因子有溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外蛋白因子(EPF)、溶血素(SLY)、荚膜多糖(CPS)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(FPBS)、毒力相关序列ORF2、谷氨酸脱氢酶(GDH)等，不同地区分离的猪链球菌菌株，其毒力因子出现的概率也不一样，尚缺乏统一的评价标准[6-9]。

引起脑膜炎、败血症和关节炎综合症的猪链球菌大约只有一半能用目前发现的毒力因子作为检测指标。

因此，探索新的毒力因子已成为该领域的研究热点和重点[3]。

1 主要毒力因子
MRP和EPF在致病性菌株检出率很高，在非致病性菌株中检出率极少，常作为判断致病性的指标之一；SLY分不具有很强的地域性，且在猪链球菌粘附和裂解Hep-2细胞的过程中发挥了重要的作用，纯化的SLY能导致人脑微血管内皮单层细胞产生病变；FPBS在细菌定植靶器官的过程中起到一定的作用；毒力相关序列ORF2在强弱毒株之间的序列存在差异，这种差异可能导致菌株致病性不同；GDH和CPS与猪链球菌的血清型分型有关，同时又都是毒力因子。

2 新型毒力因子
2.1 反应调节因子RevS基因
反应调节因子RevS基因是在2002年发现的SS2的第一个反应调节因子，并被证明是一个
孤立的反应调节因子。

通过动物竞争试验证明反应调节因子RevS基因与SS2在机体器官内的定居有关，其在细菌的发病机制中可能起着重要的作用。

鞠爱萍用我国四川资阳人源分离株05ZYH33为研究对象，研究探讨了RevS基因对该菌株致病性的影响及其可能的机制，构建中间为壮观霉素抗性基因，两侧为RevS编码基因上、下游同源序列的基因敲除载体，通过同源重组和PCR法鉴定，获得RevS编码基因完全被壮观霉素抗性基因替代的突变株。

该基因敲除后细菌的稳定性、生长曲线、菌落形态、溶血性、染色情况、镜下形态及蛋白表达等基本生物学性状没有发生明显的改变。

动物感染试验显示，RevS突变体对小鼠的致病性显著减弱，但对其主要宿主猪的致病性未见显著改变[10]。

这表明国内强毒株RevS突变体对猪致病性没有明显减弱，这种差异可能与实验动物的种类、大小、接种途径和剂量的不同有关，但也不排除国内毒株存在独特的致病因子和致病机制的可能[3]。

2.2 蛋白酶
Jobin M C等对致病性SS2产生的一系列蛋白酶进行了研究，先后发现了分子质量55 ku 的精氨酸氨基肽酶、胰凝乳蛋白酶样和具有酪蛋白酶活性的物质及在SS2细胞内和培养液上清中的70 ku的肽酶活性物质(DPP IV)。

精氨酸氨基肽酶、酪蛋白酶和DPP IV活性在所有的被检测的SS2中均可检查到，而胰凝乳蛋白酶活性只在欧洲分离的致病性SS2株检测到。

这种蛋白酶的最佳pH为6--8，最佳温度为25℃--42℃[11]，这是关于致病性SS2产生的蛋白酶的首次报道，进一步的研究需搞清这些蛋白酶对细菌致病性的影响。

2.3 38、45、39、44 ku蛋白
Okwumabua O等[12]用SS2的全细菌蛋白的多克隆抗体构建和筛选了一个基因文库，从这个基因文库中寻找到了一个长为2.0 kb的DNA片段。

该基因编码的多肽含有445个氨基酸残基，分子质量为38 ku。

该蛋白位于细菌表面，可从细胞壁提取物中分离到，并可与SS2感染的猪阳性血清反应，表明该蛋白可作为诊断用抗原。

以该蛋白免疫的猪可抵抗野生型株SS2的感染，因此该蛋白可用于疫苗的构建。

用同样的方法，发现了一个与谷氨酸脱氢酶同源的蛋白片段。

该片段由长1.6 kb的Dral 区编码，分子质量为45 ku，具有谷氨酸脱氢酶活性，具有良好的免疫原性。

Quessy S等早在1997年就发现了一种分子质量为39 ku的蛋白。

该蛋白与白蛋白有良好的结合活性，其N末端与甘油醛三磷酸脱氢酶高度同源。

进一步研究表明，在猪链球菌肉汤培养基中添加白蛋白可导致猪链球菌毒力的增加。

因此认为，该蛋白与白蛋白的相互作用是导致SS2的感染发病的一个重要机制。

Gott schalk M等以高致病力的SS2为基础，构建了2株无致病力的细菌突变体，通过对比，发现一种分子质量为44 ku的胞壁蛋白存在于亲本株中，而在突变菌株中不存在，该蛋白具有很好的免疫原性，被认为是SS2的毒力因子之一[3]。

2.4 纤维蛋白溶血酶原
Jobin M C等[13]研究了致病性SS2的纤维蛋白溶血酶原的结合活性。

发现人和猪的纤维蛋白溶血酶原均可以和SS2结合，这种结合可以被￡氨基己酸抑制。

SS2表面的纤维蛋白溶血酶原受体具有耐热和耐十二烷基磺酸钠的特性。

其中的一个受体被确认为甘油醛一3一磷酸脱氢酶。

SS2的这种纤维蛋白溶血酶原结合活性足以激活游离的纤维蛋白溶血酶原，反过来可以降解纤溶酶(纤维结合素)，这是有关致病性SS2纤维蛋白溶血酶原结合活性的首次报道，但是这种结合活性与细菌毒力的关系仍不清楚。

2.5 89 kb毒力岛
Chen C等[14]研究发现，强致病株98HA／H12和05ZY／H33染色体中均有一个约89 kb的特有核酸片段，生物信息学分析该片段具有基因组毒力岛(patlaogenicity island,PAI)的特征。

该PAI仅存在于中国流行株。

89 kb毒力岛G+C含量为36．8％，远低于基因组的G+C含量
41．3％，密码子使用偏性也不同于全基因组，暗示其很可能是通过水平基因转移在菌株问传递，使原本没有毒力的菌株发生了显著的毒力增强。

对89 kb毒力岛进一步的功能注释显示其含有2个双组分信号转导系统。

双组分信号转导系统是原核生物中普遍存在的信号调控系统，通过调控多种毒力因子的表达参与致病过程。

2.6 ORF2的发现
Smith H E等[15]用体内互补法将强毒株基因文库引入遗传背景相似的弱毒株，然后接种无菌仔猪，再从中枢神经系统分离病原，成功的发现一段毒力相关序列。

经计算机分析，其中包括两个完整的阅读框。

ORFl与已知基因同源性高，但与致病性无关，ORF2与已知任何基因无同源性，可能与致病性有关，被认为是一种新的毒力因子。

李于武等[16]对我国江苏分离的致病性菌株HA9801株的基因序列进行了分析，发现其相应ORF2序列与国外推测的毒力基因完全同源。

通过检测发现，该基因在SS2中阳性率为7／8，在其他型猪链球菌中为9／23，在猪源的链球菌中总检出率为16／31。

2.7 分泌性核酸酶SsnA基因
Fontaine M C等[17]从临床分离到的所有致病性SS2中发现了一种分泌性核酸酶
SsnA(3126 bp)基因。

氨基酸序列分析发现，该核酸酶含有3个较为保守的序列，分别是一段编码35个氨基酸的信号肽序列、一段编码22个氨基酸的DNA结合区域以及一段革兰氏阳性菌细胞壁的特有基序。

研究表明，SsnA在整个猪链球菌的生长过程中都表达。

用去顶端的SsnA衍生物制备的抗血清能中和SsnA的活性。

利用核酸电泳和免疫转印分析菌株SX332和它的缺失株的亚细胞成分，表明SsnA存在于细胞壁上。

分析了258株分离于猪表面(鼻拭子或上颚棉拭子)和猪的内部(关节、脑、其他内部器官)的猪链球菌，发现核酸酶的表达水平和分离的位置有密切的关系(P<0.001)，提示这可能是一种新型的毒力因子。

张东等[18]也对SsnA基因进行了研究，通过对8株SS2中国重庆分离株SsnA基因测序分析，发现这8株间同源性高，可能有共同来源。

SsnA分泌阴性菌株与阳性菌株基因序列同源性高于98％，提示基因突变不是调控SsnA分泌的主要因素，该酶的分泌机制有待进一步研究。

同时通过对多种血清型猪链球菌进行基因检测和活性检测，发现SsnA在多种型别的链球菌中存在，但主要在2型中表达。

分析核酸酶活性为阳性的菌株在培养4、8、16、32、48h 均可以检测到SsnA的分泌，而阴性菌株在这些时间段均不能检测到SsnA的活性，说明核酸酶在链球菌整个生长周期中都有分泌。

另外，还证明Ca2+和Mg2+为分泌性SsnA的活性必需因子。

2.8 脂磷壁酸D-丙氨酰位点
在研究猪链球菌能够通过血脑屏障引起脑膜炎的机制过程中，Fittipaldi N等[19]用可选择的荚膜转录序列鉴定分析了一些病原体与猪脑微血管内皮细胞相互作用时上调的基因。

其中，他们鉴定了一个猪链球菌的dlt操纵子的一个成员dltA。

此前有研究表明，dlt操纵子在细菌细胞壁的合成过程中，负责将D-丙氨酸残基整合到脂磷壁酸(LipoteichoieAcid，LTA)上，而LTA是革兰氏阳性菌细胞壁上的重要的两性分子，在细菌的致病过程中发挥重要作用。

Finipaldi N等[20]用等位基因置换的方法获得了一株野生SS2的dltA缺失株，缺失后细菌则不能将D-丙氨酸整合到LTA上。

结果发现，缺失株对阳离子抗菌肽的敏感性增加，此外，与野生型菌株相比，缺失株更容易被宿主的炎性细胞杀灭，而且对猪的BMEC的黏附和侵入明显减少。

动物感染试验显示缺失株在CDl鼠和猪体的感染过程中都被致弱，这反映了缺失株在逃避宿主免疫清除机制和穿透宿主防御的能力大大减弱。

研究结果表明，LTA的D-丙氨酰位点是一个非常重要的毒力因子。

2.9 其它的新型毒力因子
除了以上几种新型毒力因子外，还有其它的新型毒力因子，如FBPS基因、编码噬菌体的基因序列Ssl、自溶素、精氨酸脱亚氨酸酶系统、浑浊因子、转录调节因子、氨基酸通透
酶、ABC转运子及表面锚定蛋白基因等[3]。

这些新型基因的功能有的已经知晓，有的仍需进一步研究。

3 小结
虽然科学家们对SS2的毒力因子已进行了许多研究，但是仍然不能确定区分致病和非致病的统一标准，也没有发现一个可以明确区分毒力株、弱毒株和无毒力株的标志性的毒力因子，这是因为猪链球菌的毒力受多种因素的影响。

因此，越来越多的科学家认为，猪链球菌的毒力是多种因子的相互作用的结果，一种因子与另一种因子或多种因子共同作用，或是一种因子的部分功能由另一种因子的功能补充完成，或是这些蛋白本身不是毒力因子，但它的合成与毒力有关。

总之，关于猪链球菌2型毒力因子的研究任重而道远，而猪链球菌2型新型毒力因子的探索也是我们今后的重点研究方向。

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