限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。

限制性核酸内切酶的分类：

根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。

第一型限制酶

同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；另有认知(recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并不能准确定位切割位点，所以并不常用。例如：EcoB、EcoK。

第二型限制酶

只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。

第三型限制酶

与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并不能准确定位切割位点，所以并不常用。例如：EcoPI、HinfIII。

限制酶在遗传学方面的应用：

1、在甚因工程方面

利用能产生“粘性末端”的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一限制酶处理不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性末端, 可以彼此“粘合”,再经连接酶处理, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶主要应用于以下两方

面

（1）目的基因与载体的重组

细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必须通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮助才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。将供体DNA与载体用同样的限制酶处理, 使载体带上各种各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再筛选出

所需的菌株, 便获得带有某一目的基因的繁殖系.用这种方法, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬菌体转人大肠

杆菌,并表达了信息.

（2）建造新的基因载体作为基因载体,在引人受体细胞后, 必须有较高的复制率, 以求获得大量的基因产物；必须具备一个选择性标志, 以便筛选；还要有一至多种限制酶的作用位点（每种酶只有一个切口）；也要求使用安全。显然, 要寻找理想的天然载体是不容易的。实际上, 基因工程中所采用的载体, 都是重新建造的。

2、在遗传分析方面

要确定杂种子代中某部分DNA来源于哪一亲本, 用经典的遗传分析方法, 是相当困难的,若借助于限制酶, 则大为方便.

3、在生物进化方面

用限制酶处理后的DNA水解片段的电泳图谱进行比较的方法, 来分析生物的亲缘关系和进化, 特别是在近缘生物的分析中, 更具独特的优点.它既比DNA碱基顺序分析要简便,也比蛋白质氨基酸顺序的分析要直接, 更比染色体组型分析要精细.

例子：

EcoRI Escherichia coli

5'GAATTC

3'CTTAAG

5'---G//AATTC---3'

3'---CTTAA//G---5'

BamHI Bacillus amyloliquefaciens

5'GGATCC

3'CCTAGG

5'---G//GATCC---3'

3'---CCTAG//G---5'

限制性核酸内切酶 NotⅠ

一、概念：

NotⅠ是一种罕见的限制性内切酶，它可识别八个碱基的核酸序列( 5'-GC/GGCCGC-3') ，在低盐的情况下它还可识别( 5'-AC/GGCCGT-3')。NotⅠ不仅为一普通的限制性内切酶，它在生物领域的其他方向也具有重要的应用价值及研究潜力，有关NotⅠ蛋白性质特征及功能机制等方面的报道最近日渐增多。

二、应用：

1.NotⅠ识别位点每65kb 的随机碱基序列中才出现一次，故可被用于基因组大片段的产生以

及DNA 甲基化定位图谱的绘制。

2.因为其识别位点中富含G∶C序列，故其在真核生物基因组的GpC岛上出现频率较高（GpC

岛通常位于基因转录起始区域，并且是DNA甲基化的热点区域）因此它可在很大程度上影响基因的表达。NotⅠ对甲基化相当敏感，甲基化其识别位点的2或6位胞嘧啶上C5的任何一位都会阻止DNA被切割。基于其低频率性和甲基化敏感性，NotⅠ通常可被用于在地标基因组扫描技术( Restriction Landmark Genomic Scanning，RLGS)中引进放射性标记物，这一技术已在肿瘤细胞中异常甲基化的研究中得到了广泛应用［3］。

3.在目前已被公认的各种限制性内切酶中，NotⅠ是唯一一个发现具有金属结构域的蛋白酶。

这一结构域由金属离子及四面体结构的Cys4模体构成的，位于靠近DNA识别位点的区域，在维持蛋白的组织结构上起一定作用。这一研究结果表明NotⅠ有可能是随机性核酸内切酶( 其可识别更长的目的片段) 与限制性核酸内切酶的中间进化产物。因此，为进行Not Ⅰ蛋白结构、性质及机理的进一步研究，其高表达菌株的构建及高纯度蛋白的大量获得显得极为重要。

三、研究现状：

但目前商品化NotⅠ蛋白的价格依然居高不下，其主要原因在于表达量低、提纯程序繁琐、得率低等问题的存在，这一原因亦是造成许多其他广泛应用的限制性内切酶价格昂贵的主要因素。现在NotⅠ纯化流程涉及到了磷酸纤维素阴离子交换柱、肝素琼脂糖亲和层析柱、DEAE-琼脂糖柱、PEI 柱四步上柱洗脱过程，最后再将NotⅠ在其存储缓冲液中透析过夜，整个纯化流程约需3 ～4d，工艺繁琐且蛋白损失相当严重。

为探索限制性内切酶的提纯新工艺，可通过分离和鉴定了NotⅠ基因后，及重组体的改建，对重组菌进行诱导条件摸索，获得了高表达工程菌。应用KTA purifier 100蛋白纯化系统，对蛋白的纯化工艺进行创新优化，使提纯步骤大大简化，提纯时间缩减为原来的1 /10，提高了得率、保证了酶活，从而使其在产量和效率上较以前报道均有很大程度提高，为实验室制