外源基因在真核细胞中的表达

2. 报告基因
报告基因是指用于检测组装的嵌合基因在导入细胞后 是否具有功能的一种指示基因，它通常是编码在离体条件 下易于检测的酶。
具体是将报告基因连接在待研究的目的基因的启动子 的下游，其后再连接真核生物的终止信号，然后将构建的 融合基因转化受体细胞，组织，获得转基因植株。在转基 因植株生长发育的不同阶段，不同器官和组织乃至细胞， 分析其中的报告基因产物-酶活性，从而了解该目的基因 在何时、何处表达。 作为报告基因，其表达产物及产物的类似功能在未转 化细胞中原本并不存在。
基因枪由激发器、枪管、挡板和无菌小室 等组成。将一定量的带有目的基因的质粒DNA， CaCl2、亚精胺与钨粒一起离心或振荡，可将目 的基因吸附于钨粒，通过基因枪把钨粒以430米 /秒的速度轰击目标，使目的基因穿过细胞壁和 细胞膜进入受体细胞。
3、超声波法： 根据超声波的空化作用，把外源基因导入 受体细胞。1990年许宁等把GUS基因通过该方 法导入了小麦幼穗愈伤组织。
（2）二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolate
reductase，Dhfr）
二氢叶酸还原酶为真核细胞核苷酸合成所必需，而氨甲喋 呤（mathotrexate，MTX）作为竞争性抑制剂抑制Dhfr酶的 活性，当培养基中存在MTX时，则由于植物细胞中不能合成 四氢叶酸而抑制生长。 有一种Dhfr的突变酶，它与氨甲喋呤的亲和力较正常酶降 低260倍，突变酶不为MTX所抑制，抗MTX，将编码该酶的 基因与CaMV35S启动子拼接后导入植物细胞，则转化植物细 胞能在含有MTX的培养基上正常生长。相反，未转化植物细 胞，其Dhfr对培养基中的MTX十分敏感，而不能存活。
（3）潮霉素磷酸转移酶（hpt）
潮霉素B作为一种抗生素对大多数植物均有毒性，但当潮 霉素B被细菌中分离到的潮霉素磷酸转移酶催化而磷酸化时， 其毒性丧失。利用这一特性，可以把hpt作为选择标记，即把 htp基因和适合植物的强启动子构建成嵌合基因，转化受体植 物，转化有htp基因的植物细胞能表达出潮霉素磷酸转移酶， 使培养基中的潮霉素B磷酸化而失去毒性，反之，未转化该基 因的细胞则被潮霉素毒害致死。 除了以上3种常用的选择标记基因之外，还有庆大霉素抗 性基因，链霉素抗性基因等抗生素类选择标记，此后，又发 展出非抗生素选择标记，如抗草甘膦类除草剂基因等。
二、植物基因转移技术
植物基因转移也称为遗传转化（genetic transformation），是指利用重组DNA技术， 细胞培养技术或种质系统转移技术，将外源基 因导入植物细胞或组织，获得转基因植物的技 术。
将外源基因成功转入植物细胞中，需要考虑3个方面： 1. 如何使外源基因进入细胞？ 2. 进入植物细胞的基因是整合到基因组中，还是滞留在 细胞之中？
（1）新霉素磷酸转移酶（氨基葡萄糖苷磷酸转移酶， neomycin phosphotransferase Ⅱ, NptⅡ）
Npt Ⅱ 基因表达产生的酶可催化许多氨基葡萄糖苷类抗生 素（如新霉素，庆大霉素，卡那霉素和G-418）的O-磷酸化， 使抗生素失去对细胞的毒性，这是由于磷酸化的抗生素不能 与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，进一步 影响70S起始复合体合成，干扰线粒体和叶绿体的蛋白质生物 合成，使植物细胞最终死亡，因此，与外源基因结合的Npt基 因转化细胞后，就可在含有抗生素的培养基上存活下来。
原位组织化学定位应用于对稳定转化植物进行 Gus 融合基因 时空表达模式的精确分析，方法是用X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β– 葡糖醛酸， 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid ） 作为底物，把待检测材料浸泡在含有底物的缓冲液中保温，在组织、 细胞、原生质体被Gus转化的部位，Gus酶切割葡萄糖醛酸部分， 产生无色的吲哚氧基中间产物，随后经氧化二聚作用形成 5，5'-二 溴-4，4'-二氯靛蓝的蓝色沉淀，经显微镜镜检，观察Gus活性部位， 继而了解嵌合基因表达的组织化学定位。 该方法检测要注意排除假阳性存在的可能，有人对52中植物的 内源Gus活性进行测定，发现在营养生长阶段没有内源Gus活性， 而在繁殖器官如胚、胚乳、果实种子、种皮中均有明显的内源活性， 而随着种子萌发又逐渐消失。
1、电激法：利用高压电脉冲把外源基因导入植物 细胞实现转化的方法。
1985年由斯坦福大学Fromm M等最先将CAT基 因通过电激法导入胡萝卜、烟草、玉米的原生质 体，测得瞬间表达。随后康乃尔大学将外源基因 导入原生质体实现稳定表达。
转化率随质粒DNA浓度、电脉冲强度以及持续 时间增加而增加。
2、基因枪法（particle bombardment） ：是 利用高速微弹粒将外源遗传物质导入细胞或组织 中的方法，也称为微弹射击法、粒子轰击法等。
4、聚乙二醇法（PEG）： PEG（polyethylene）具有细胞粘合作用 和扰乱细胞膜的磷脂双分子层的作用。1980 年由Darey最早利用该方法将外源基因转入原 生质体。
1985年以后利用该方法将报告基因转入种 植物原生质体，获得瞬间表达或稳定表达。
PEG法转化率低，一般在10-5-10-6。
目前已发展出多种遗传转化方法，包括物理方 法、化学方法以及生物学方法。其中以农杆菌介 导的遗传转化应用最广泛，占约80％。 转化的目的基因包括各种抗病、抗虫、抗除草 剂、延迟保鲜、改变花色花型、改良品质以及疫 苗等基因。
转化方法可以划分为直接基因转移和间接基因 转移。 （一）直接基因转移： 采用物理或化学的方法将外源目的基因转移到 植物细胞，并整合到染色体DNA上的技术。包括电 激法、基因枪法、超声波法、真空渗入法、 PEG法、 磷酸共沉淀法、微注射法、脂质体介导法等。
革兰氏阴性农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）中存在的一种质粒DNA。具有 一段T－DNA能够将外源基因转入植物染色体 DNA中并实现整合。
Ti质粒约200Kb，一半序列参与质粒复制、冠瘿 碱代谢和接合作用；对致瘤不起作用，另一半序列包 括T－DNA区和毒性区（Vir region）。 T－DNA：章鱼碱型农杆菌Ti质粒T－DNA由两部分 组成，一部分与致瘤有关，称为左转移DNA（TL－ DNA），另一部分与致瘤无关，称为右转移DNA（TR－ DNA）。 TL－DNA含有编码合成激素类和冠瘿碱类的基因， 由于激素基因在植物细胞内的表达，产生了过量的生 长素和细胞分裂素，破坏了内源激素平衡，而导致植 物细胞发生癌变。
外源基因在真核生物细胞中的表达，对于分
子生物学理论研究，对真核生物基因表达调控的
探讨提供了其他试验方法难以达到的有力手段。
外源基因如何才能转入真核细胞？又如何能
从数量庞大的细胞群体中筛选出遗传转化的细胞？
又是如何对转化的真核生物进行鉴定？
一、选择标记基因和报告基因：
1. 基因转化的选择标记
选择标记一般是一种基因，即选择标记基因，他在转化 前与待转化外源基因相连接，当把已转化和未转化的细胞 群体臵于加有选择剂的（抗生素）的培养基上进行培养时， 已转化的细胞群体或再生植株由于带有选择标记基因，该 基因的产物---酶能分解培养基中加入的选择剂，因此，转 化细胞对选择剂具有抵抗能力，不受选择剂毒害而正常地 生长，发育。相反未转化细胞或再生植株受培养基中选择 剂的毒害，而不能存活下来而被淘汰。
3. 用于转化的外植体是否能够再生？
植物遗传转化技术是在1974年发现农杆菌Ti 质粒的基础上形成的基因转移技术，1983年获得 第一例转基因植物。1985年Horsch首创了叶盘法 （leaf disc transformation），1987年，康乃尔大 学研究者设计出基因枪；1987年，Jefferson等人 提出GUS（葡糖苷酸酶）基因融合系统，作为报 告基因。
（1）β-葡糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidase gene，Gus）
Gus基因是编码β-葡糖醛酸糖苷酶的基因，最初为细菌中分离的uid
A基因，后被应用于植物细胞转化，Gus基因的广泛应用，一方面是其测 定方法简单、灵敏、植物内源背景活性低。另一方面是由于它既可以通 过荧光分光光度计进行定量分析，又可以进行组织化学染色定位。 荧光法测定β-葡糖醛酸糖苷酶的活性，一般用于测定Gus基因在原生 质体中的瞬间表达，或测定 Gus基因在稳定完整细胞中的表达。测定时 以 4- 甲 基 伞 形 酮 葡 萄 糖 苷 酸 （ 4-methylumbelliferyl-β-Dglucuronide ）为底物，在Gus酶催化下，生成4-甲基伞形酮和 β-D-葡 萄糖醛酸。当4-甲基伞形酮的羟基解离后可被 365nm波长的光激发，从 而产生455nm荧光，在荧光分光光度计上进行定量分析。
（二）间接基因转移： 某些病原生物（农杆菌、病毒等）能够通 过感染宿主细胞，将病原生物DNA整合到宿主 细胞基因组中，因此改造病原DNA，利用其侵 染能力，能将外源基因导入植物或动物细胞， 产生转基因植物。 以农杆菌或病毒为载体的基因转移过程称 为间接基因转移。
1、农杆菌介导的基因转移： （1）Ti质粒：
5、脂质体转化法： 利用磷酸碱或磷酸丝氨酸等脂质构成的 双层膜囊，可以包裹质粒，DNA大分子、病毒 颗粒等，通过脂质体与原生质体融合将外源 基因转入原生质体细胞，或通过注射法实现 转化。 6、真空渗入法： 利用真空作用使外源基因进入植物体，细 胞并实现DNA的整合。
7、显微注射法：
利用显微装臵将质粒DNA注射入宿主细 胞的方法。利用极细(1μm)的玻璃毛细管 装入待转移的外源DNA，然后在显微镜下直 接将毛细管插入原生质体等细胞，并注射 DNA。
外源基因在真核细胞中的表达
基因的体外重组和表达体系最早是利用大肠杆菌作 为宿主，以后逐渐发展到真核生物细胞作为宿主，如酵 母、植物细胞和动物细胞等。以植物细胞作为转化受体，
不仅能把一些植物基因或DNA片段作为外源基因转化到
受体植物，而且能把动物或微生物中存在的基因转化并 整合到植物基因组中，使其在植物细胞中表达。
Vir区：是T－DNA以外涉及诱发肿瘤的区域，在Ti质
粒的物理图上位于T－DNA左侧，长30－40Kb，Vir区 并不整合入植物基因，但却是T－DNA转移所必需。 T－DNA边界序列：T－DNA长约23Kb，但在其两端边界 各有一个25bp的正向重复序列，高度保守，一般认为 右端重复序列对T－DNA转移起重要作用。
gfp基因是从维多利亚水母中分离纯化的一种可以发出绿
色荧光的物质。GFP为238个氨基酸的小蛋白，发色团能吸 收可见光而发射荧光，用荧光显微镜可检测到GFP产生的绿 色荧光。GFP检测不需要添加任何底物或辅助因子，不使用 同位素，不需要测定酶的活性等优点，且在原核和真核生 物中都能表达，表达产物对细胞无毒性。
最早由Klein TM在1987年创立，并将烟草 花叶病毒RNA和CAT基因(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)导 入洋葱表皮细胞。
系统将带有包裹有目的基因的金属颗粒（金 粒或钨粒），以很高的速度轰击植物细胞，由于 小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而 进入基因组，从而实现稳定转化的目的。
（2）氯霉素乙酰转移酶（ ch来自百度文库oroamphenicol acetyltransferase，Cat）
Cat基因来自细菌转座子Tn9，它编码氯霉素乙酰转移酶，以氯霉素 为底物，使氯霉素乙酰化而先后生成3-乙酰氯霉素、1-乙酰氯霉素和 1.3-二乙酰氯霉素。乙酰化的氯霉素不再对植物细胞产生毒性，故可作 为选择标记。乙酰化反应产物采用薄层层析法分离，放射自显影检测各 种乙酰化产物在层析位臵的放射强度。
（3）荧光素酶基因（luciferase gene） 多取自萤火虫和细菌细胞。反应底物为荧光素，在ATP 和Mg2+存在下，酶促氧化脱羧，生成激活态氧化荧光素发 射光子，产生荧光，荧光强弱可以通过荧光计测定，也可 作X-光片直接检测。
荧光素+ATP+O2
氧化荧光素+AMP+PPi+CO2+光
（4）绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP） 基因