中华鳖病原性维隆气单胞菌的分离及药敏试验

第34卷 第5期

水生生物学报

Vol. 34, No.5 2010年9月

ACTA HYDROBIOLOGICA

SINICA

Sep, 2 0 1 0

收稿日期: 2010-03-18; 修订日期: 2010-06-29

基金项目: 浙江省重点科技项目(No. G2*******)资助

作者简介: 沈文英(1970—), 女, 浙江绍兴人; 副教授, 硕士; 主要从事水生经济动物营养和病害防治研究。E-mail: zoology@ 通讯作者: 李卫芬, E-mail: wfli@

DOI: 10.3724/SP.J.1035.2010.01060

中华鳖病原性维隆气单胞菌的分离及药敏试验

沈文英1,2 李卫芬2 高 研2

(1. 绍兴文理学院生命科学学院, 绍兴 312000; 2. 浙江大学动物科学学院饲料研究所, 杭州 310029)

ISOLATION AND DRUG SENSITIVITY STUDY OF PATHOGENIC BACTERIA AEROMONAS VERONII FROM SOFT-SHELLED TURTLE,

TRIONYX SINENSIS

SHEN Wen-Ying 1,2, LI Wei-Fen 2 and GAO Yan 2

(1. College of Life Science , Shaoxing University , Shaoxing 312000, China ;

2. Institute of Feed Science , College of Animal Science , Zhejiang University , Hangzhou 310029, China )

关键词: 中华鳖; 维隆气单胞菌; 分离鉴定; 药敏试验

Key words: Trionyx sinensis ; Aeromonas veronii ; Isolation; Drug sensitivity

中图分类号: S947.1 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2010)05-1060-05

中华鳖(Trionyx sinensis )是我国主要淡水养殖名优品种之一。但随着中华鳖养殖规模的扩大和集约化程度的提高, 导致鳖病暴发流行, 阻碍了养鳖业的进一步发展。迄今为止, 研究发现的鳖病共约40余种, 其中以中华鳖疖疮穿孔病、腐皮病、白底板病、肠道坏死症及细菌性肝水肿病为主要病害[1,2], 主要由嗜水气单胞菌和温和气单胞菌感染引起[3—5]。维隆气单胞菌属于弧菌科气单胞菌属的一个成员, 具有较强的毒力[6,7], 能引起腹泻、

肺炎以及伤口感染[8]和自身限制的肠胃炎[9]。有关维隆气单胞菌在水生生物上的致病性尚未见报道。浙江省是开展中华鳖工厂化养殖较早的地区, 目前约占全国产量的60%以上。2006年6月起, 浙江省暴发了大面积的鳖病, 给养殖户造成了严重的经济损失。本研究对发病中华鳖典型病灶、肝脏和肺组织进行了病原菌的分离、鉴定及药敏试验, 为有效防治鳖病提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

实验用患病鳖于2006年6月取自浙江省临平市中华鳖养殖场, 共3只。临床症状表现为: 精神沉郁、行动迟缓、反应迟钝; 底板呈白色; 四肢、颈部和裙边等处均有

溃烂, 斑中间有灰褐色圆形凹陷; 背壳有大量腐皮脱落, 壳上有硬币大小的白色凹斑。剖检病变表现为: 腮腺红肿、组织糜烂、有出血斑; 打开内腔有异味、肝肿大、质地脆化、表面有小出血点; 胃、肠壁出血、内充满黏性 液体。

健康鳖取自浙江省临平市中华鳖养殖场, 规格为100—200 g, 在水产基地养殖一周后, 确认健康后用于致病性实验。

鉴别培养基和微量生化管购自杭州天和微生物试剂厂, 质粒提取试剂盒、割胶回收试剂盒、T 4连接酶、T-Vector 购自上海生工生物工程有限公司, 克隆宿主菌 E. coli Top10, 本实验室保存。

1.2 病原菌的分离与培养

从患病鳖典型病灶、肝脏和肺组织取样接种到LB 和TCBS 培养基上, 30℃培养18h 。结果: LB 平皿上长出圆形, 边缘整齐的白色半透明状菌落; TCBS 上呈黄色菌落。挑选单个菌落作纯培养, 分离菌经30 1℃8h 培养后作毒力试验和细菌鉴定。

1.3 人工感染与动物毒力检测试验

按刘恭植等[10]反复法进行。将纯培养菌株于营养琼脂培养基(NA)斜面上活化后(30, 18h), ℃用无菌生理盐

5期沈文英等: 中华鳖病原性维隆气单胞菌的分离及药敏试验 1061

水洗下菌苔, 采用比浊法制成 1.0×108 CFU/mL的菌悬液, 取该培养物对已暂养一周的100—200 g左右健康鳖

进行腹腔注射, 对照组注射无菌生理盐水, 剂量均为0.4 mL/只, 试验组和对照组各注射5只, 分别饲养于28—30℃的水族箱中, 观察 10d。同上法重复感染。

1.4病原菌形态分析和生理生化特性鉴定

将纯培养菌株于营养琼脂培养基(NA) 30℃培养18h,

用等渗的无菌生理盐水洗下菌苔, JEM-1011型透射电镜(日本电子)观察病原菌形态。细菌生理生化特性鉴定按照

微量生化管操作说明进行。

1.5细菌基因序列的扩增和测序

以细菌16SrDNA通用引物[11](8f: 5′-AGAGTTTGAT- CCTGGCTCAG-3′, 1492r: 5′-AAGGAGGTGATCCAGCC- GCA-3′)为引物, 全菌裂解法制备的菌液DNA为模板, 采

用常规的PCR方法进行扩增。PCR反应体系(50 μL)为: 5 μL的10×扩增缓冲液,模板DNA 1 μL,引物10 μmol/mL

各1 μL, 10 μmol/mL dNTP 1 μL, 5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL, 超纯水40.5 μL, 混匀。反应条件: 94 ℃预变性

5 min; 94 44s

℃, 52 60s

℃, 72 2 min

℃, 30个循环; 最后72℃延伸5 min。取PCR产物10 μL, 1%琼脂糖凝胶电泳

检测。用AxyprepDNA凝胶回收试剂盒方法回收和纯化PCR扩增片段。将回收产物克隆到PUCm-T载体, CaCl2

转化法将连接好的重组质粒转化到E. coli Top10感受态细胞, 通过蓝白斑筛选重组子, 采用PUCm-T载体引物M13 F

和M13 R鉴定出阳性重组子, 进行序列测定(Invitrogen 公司)。

1.6药敏性测定

采用药敏纸片琼脂平板扩散法进行。将病原菌纯培

养物于肉汤液中(28)

℃培养16h后, 取0.2 mL均匀涂布于

平皿上, 贴上药敏纸片, 设4个重复, 于28—30℃下培养18—24h后测量抑菌圈直径。2结果

2.1中华鳖毒力感染实验

人工回感中华鳖结果表明, 分离菌株对健康鳖有较强的致病力, 3d发病率高达100%, 发病中华鳖临床症状和病理变化与自然病例相同, 从病灶和内脏组织均能分离到接种菌, 感染后10d内死亡率达到100%。对照组鳖则无异常, 仍健康活泼。

2.2病原菌的鉴定

细菌的形态鉴定分离菌株培养18 h后形成的菌落低凸、圆形, 直径l—2 mm, 边缘光滑湿润, 有刺激性气味。光镜检测发现分离菌株革兰氏染色为阴性, 短链状杆菌, 呈单个或成对分布; 电镜观察发现该菌具有一条明显的鞭毛, 鞭毛长约为菌体长的2倍(图1)。

细菌的生理生化特性分离菌最佳生长条件是30 18h,

℃也能在37 LB

℃上生长, 在LB培养基中浑浊均匀, 在半固体培养基中有动力, 此结果与形态观察结果相吻合。该菌氧化酶和v-p反应阳性, 能产生吲哚, 利用葡萄糖、麦芽糖、乳糖等作为碳源和能量来源, 并能产酸, 具有区别于其他气单胞菌的特征: 赖氨酸脱羧酶阳性, 精氨酸双水解酶阴性。该菌大多数生理生化特性与维隆气单胞菌(Aeromonas veronii)标准菌株一致(表1)。根据《常见细菌系统鉴定手册》[12]和布坎南等编的《伯杰细菌鉴定手册》[13]鉴定为维隆气单胞菌(A.veronii)。

细菌16S rDNA基因序列测定分离菌株基因组经PCR扩增获得了预期的1.5 kb的特异条带, 挑选阳性克隆进行测序, 获得了细菌16S rDNA基因的部分序列。测定的序列(登录号为HM032146)进行BLAST同源序列比对, 与维隆气单胞菌(A. veronii)参考菌株(X74684.1 ATCC 35624T)的16S rDNA 同源性达99%, 分离菌株16S rDNA基因和维隆气单胞菌参考菌株16S rDNA基因

图1 病原菌形态结构 (×8000)

Fig. 1 The morphological structure of the pathogenic bacteria strain (×8000)