WB实验步骤详细总结

蛋白提取（所有操作在冰上进行）

1. 裂解

1) 配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF 在-20℃保存，提前一天4℃解冻）

取2ml 裂解液，加20μlPMSF 混匀

2) 称取30mg 组织，切碎放入标记好的AP 管中，加入600μl 上述1中液体（加入液

体与组织比例为20：1），冰上静置10min

2. 匀浆

先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头） 在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s ，两次（间隔5s ），冰上静置30min 3. 离心（在基础4楼416室）

1) 自带1ml 枪以及蓝枪头和黄枪头，三个的离心管（①，②两个标记，③加少量超

纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）

2) 将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min 离心15min 3) 用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 4. 变性（上样缓冲液：样品=4：1）

将样品转移至2~3个管中

加上样缓冲液，100℃变性10min 仪器屏幕： 5. 保存

变性结束

AP

管盖放一然后4℃1. 清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对

齐，以免漏胶。

2.

配制分离胶 1) 准备：1ml 枪（蓝色枪头），200μl 枪（黄色枪头）10μl （白色枪头）

2)

10%分离胶的配置：（用50ml 烧杯。板配块胶，板配2块板） 混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡）

3.

灌胶

沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml 移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止 4.

水封

立即用1ml 超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min 5.

搅拌混匀立即灌胶至溢出，插入梳子（10孔或15孔）凝胶30min 或20min 6. 电泳（电泳液最多使用两次）

1)

安装电泳装置

低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔出防止拔歪）

2) 组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪 3)

连接电泳仪

电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳 先调电压至70mV ，跑约20min 。（Mark 跑开，分出彩带即可） 再调电压至120mV ，跑约60min 。（不能跑过下面的玻璃板）

注：Mark 的条带从红色条带往下依次为：70→55→40→35→20，待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸泡 7. 转膜（转移液可用3-4次）

1) 剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终保持湿润）

2) 剪PVDF 膜（用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF 膜），然后用甲醇活化10s 以上

3) “夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、两层滤纸→胶→膜→两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）

4) 安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。加入转膜液至满（否则仪器无法启动）

5)

打开开关，调节电流至100mA ，转膜2h （恒流）盆中加满冰 转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色 8.

封闭 1)

配制5%脱脂奶粉： 脱脂奶粉 50mlTBST 2) 液可以重复利用29.

一抗 1)

用TBST 配，每一格加5mlTBST ，再分别加入抗体 抗体的量：

2)膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上）

3)4℃冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床416室）10.洗脱

用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。

11.二抗

1)用3%的脱脂奶粉

的脱脂奶粉

50mlTBST

2)每格吸入5ml3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为

l

注意：吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用

免抗

3)膜分别加入小格，慢摇1-2h（常温）

12.洗脱

用TBST在皿中洗脱，摇床10min每次，洗三次。

13.显影：

U盘

A液，B液（显影液。4℃保存）

200μl枪+枪头（黄）

膜（置于皿中）

1)开机后自动预冷，温度降到1-20℃才可

2)显影液现配现用（A液：B液=1：1）

3)膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液枪吧显影液均匀

涂在膜上

4)先点击自动曝光，看下效果，显示不清晰再手动该曝光时间，内参一

般显影15s（影像的条带粗细深浅一致则说明已调齐）内参好说明各步实验操作均无误，目的蛋

白结果好坏就取决于抗体的专一性。

5)每张图保存多张不同清晰度的以备用，拷贝至U盘

试剂配方：