第十八章_高效液相色谱法
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（2）键合相的性质 –含碳量：含碳的百分数 含碳量： 含碳量 –覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅 覆盖度 醇基总数的比例 –封尾（end-capping）：在键合反应后，用三 封尾（end-capping）：在键合反应后， 封尾 ）：在键合反应后 甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。 甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。 （3）键合相的特点 –使用过程中不流失；化学稳定性好；柱效高； 使用过程中不流失；化学稳定性好；柱效高； 使用过程中不流失 重现性好；适于梯度洗脱； 重现性好；适于梯度洗脱；载样量大
第十八章 十八章 高效液相色谱法 第一节 HPLC主要类型与原理 HPLC主要类型与原理
一、HPLC与经典LC区别 HPLC与经典LC区别 与经典LC 二、HPLC与GC区别 HPLC与GC区别 三、HPLC主要类型和原理 主要类型和原理
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高效液相色谱法：以气相色谱为基础， 高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。
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3、操作条件差别 、 GC：加温操作 ： HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） ：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 三、HPLC主要类型和分离方法 主要类型和分离方法
1、四类基本类型色谱法 、
分配色谱法（partition chromatography） 分配色谱法（ 吸附色谱法（adsorption chromatography） 吸附色谱法（ 离子交换色谱法（IEC） 离子交换色谱法（ 空间排阻色谱法（SEC） 空间排阻色谱法（
2、化学键合相色谱法（最常见常用的一种） 化学键合相色谱法（最常见常用的一种）
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化学键合相色谱
采用化学键合相为固定相的液相色 谱法， 谱法，化学键合相是通过化学反应 将有机基团键合在载体表面构成固 定相
特点
固定相非常稳定，在使用中不易流失。 固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各 种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种 种极性的官能团键合到载体表面， 类繁多样品的分离。 类繁多样品的分离。
极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
离子交换基团 胺基、 胺基、季铵盐 磺酸、 磺酸、羧酸
2、键合相的性质和特点 （1）键合反应 –硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅胶 硅氧烷（Si－ Si－ 硅氧烷 进行硅烷化反应 十八烷基氯硅烷 硅胶
ODS(C18)键合相 键合相
YWG－ 无定形硅胶YWG YWG上键合了十八硅烷 如：YWG－C18H37，无定形硅胶YWG上键合了十八硅烷 ODS，球形硅胶Spherisorb 基；Spherisorb ODS，球形硅胶Spherisorb 上键 合了ODS ODS。 合了ODS。
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2、流动相差别 、 GC：流动相为惰性气体 ： 组分与流动相无亲合作用力， 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 ： 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 分离度增加了因素，对分离起很大作用 分离度增加了因素， 流动相种类较多， 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用； 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用；选用不 pH值的选择也对分离起到重要作用 同比例的两种或两种以上液体作为流动相； 同比例的两种或两种以上液体作为流动相；可以增大分离 选择性
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（3）键合相色谱法分离机理 ）
相键合相色谱: 固定相极性>流动相极性 正相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相：氰基、 常用固定相：氰基、氨基 常用流动相 己烷-醇 己烷 醇 庚烷-醇 庚烷 醇 分离对象 极性 中等极性化合物
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分离机制？ 分离机制？ –分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质 分配：把有机键合层作为一个液膜看待， 分配 在两相的溶解 –吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、 吸附 定向作用 • 分离选择性： 分离选择性： –极性强的组分k大，后洗脱出柱。 极性强的组分k 极性强的组分 后洗脱出柱。 –流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k 流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k 流动相的极性增强 减小，tR 减小。 减小， 减小。
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（1）正相键合相色谱：采用极性键合相为固定相， ）正相键合相色谱：采用极性键合相为固定相， 以非极性或弱极性溶剂为流动相。 以非极性或弱极性溶剂为流动相。 固定相极性>流动相极性 固定相极性 流动相极性 组分极性越大， 组分极性越大，保留 时间越长
有机基团
正相键合相色谱 分离溶于有机溶剂的极性 至中等极性分子型化合物
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3）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的 越大 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂， 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加， 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 中性盐的加入：使中性溶质的 增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 ：影响弱酸、 流动相的pH降低，弱酸 增大 增大， 增大； 流动相的 降低，弱酸k增大，tR增大；弱 降低 变小。 碱k变小。 变小
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二、HPLC与GC区别 与 区别
1、分析对象差别 、 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， ：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% 占有机物的 HPLC：溶解后能制成溶液的样品， ：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80% 用途广泛，占有机物的
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• 注意：流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶 注意：流动相的pH一般应在3 pH一般应在 溶解； 也有适用宽pH范围的键合相) 溶解；(也有适用宽pH范围的键合相) pH范围的键合相 二、化学键合相色谱法的流动相 • 对流动相的要求：流动相也称洗脱剂 对流动相的要求： – 与固定相不发生化学反应。 与固定相不发生化学反应。 – 对试样有适宜的溶解度。使k在1~10范围内， 对试样有适宜的溶解度。 范围内， 在 范围内 – 与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用 与检测器相适应。例如用紫外检测器时， 截止波长小于检测波长的溶剂。 截止波长小于检测波长的溶剂。 – 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙腈 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑ 等可以降低柱压，提高柱效。 等可以降低柱压，提高柱效。
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与经典LC区别 一、HPLC与经典 区别 与经典 主要区别：固定相差别， 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
1、经典 、经典LC：仅做为一种分离手段 ： 柱内径1~3cm，固定相粒径>100µm 且不均匀；常压输送流 ，固定相粒径 且不均匀； 柱内径 动相；柱效低（ ， ） 分析周期长； 动相；柱效低（H↑，n↓）；分析周期长；无法在线检测 2、HPLC：分离和分析 、 ： 柱内径2~6mm，固定相粒径<10µm（球形，匀浆装柱）； ，固定相粒径 柱内径 （球形，匀浆装柱） 高压输送流动相；柱效高（ ， ） 高压输送流动相；柱效高（H↓，n↑）；分析时间大大缩 短；可以在线检测
保留时间： 保留时间：
HO
COOH
COOH
OH OH
<
OH
OH
没食子酸
3,4-二羟基苯甲酸 二羟基苯甲酸
固定相: 非极性; 流动相: 固定相 非极性 流动相 极性 组分极性: 二羟基苯甲酸<没食子酸 组分极性 3,4-二羟基苯甲酸 没食子酸 二羟基苯甲酸
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一、化学键合相色谱法固定相 第十八章 十八章 高效液相色谱法 二、化学键合相色谱法流动相 第二节 固定相和流动相选择 三、分离条件的选择
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极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
（2）反相键合相色谱：采用非极性键合相为固定 ）反相键合相色谱： 相，以极性或弱极性溶剂为流动相 固定相极性<流动相极性 固定相极性 流动相极性 反相键合相色谱 组分极性越小， 组分极性越小，保 留时间越长
有机基团
分离溶于有机溶剂 的非极性或中极性化合物
反相键合相色谱疏溶剂分离机制
反相键合相色谱保留机Fra Baidu bibliotek——疏溶剂理论 疏溶剂理论 反相键合相色谱保留机制 溶质的保留主要是溶质 分子与极性溶剂分子间 的排斥力， 的排斥力，促使溶质分 子与键合相的烃基发生 疏水缔合。 疏水缔合。不是溶质分 子与键合相间的色散力。 子与键合相间的色散力。
反相键合相色谱疏溶剂分离机制
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例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇 水 甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水 十八烷基（ 十八烷基（疏水 基团） 基团）键合相
二醇基（ 二醇基（极性 基团） 基团）键合相
出峰顺序：苯酚，甲苯 出峰顺序：苯酚，
出峰顺序：甲苯， 出峰顺序：甲苯，苯酚
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键合色谱柱、 例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离 键合色谱柱 甲醇以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。 以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。
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（2）弱极性键合相： 弱极性键合相： 醚基和二羟基等键合相 用于反相或正相色谱 （3）极性键合相： 极性键合相： 常用氨基﹑ 常用氨基﹑氰基键合 相（氰乙硅烷基 CN)键合 ≡Si(CH2)2CN)键合 硅胶， 硅胶，一般用于正 相色谱
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键合固定相类 型 疏水基团 烷烃（ ）、苯基等 烷烃（C8和C18）、苯基等
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一、化学键合相色谱法的固定相
• 固定相应符合下列要求： 固定相应符合下列要求： –颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀 –化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好 1、键合相的种类 （1）非极性键合相 ： 与苯基等键合在硅胶表面； －非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； 非极性烃基， －用于反相色谱； 用于反相色谱； －长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 稳定性更好。 稳定性更好。
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1、流动相对分离的影响 、
n α -1 k2 R= ⋅ ⋅ 4 α 1 + k2
– n：由色谱柱（固定相）性能决定， ：由色谱柱（固定相）性能决定， – α：主要受溶剂种类的影响， α：主要受溶剂种类的影响， – k：受溶剂配比的影响。 ：受溶剂配比的影响。 2、流动相的强度和选择性 • 溶剂的极性（强度） 溶剂的极性（强度） –正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 正相色谱：溶剂极性越强， 正相色谱 –反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 反相色谱： 反相色谱
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反相键合相色谱保留行为主要影响因素
1）溶质的分子结构（极性） 溶质的分子结构（极性）
极性越弱，疏水性越强， 越大 越大， 也越大。 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱， 越大 越大； 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性， 值变小 值变小。 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。 2）固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加， 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质 也增大。 的k也增大。 也增大 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的 越大
疏水基团 C18基 C8基 苯基
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（3）键合相色谱法分离机理 ）
反相键合相色谱: 固定相极性<流动相极性 反相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相： 常用固定相：C18（ODS） ） 常用流动相 甲醇-水 甲醇 水 乙睛-水 乙睛 水 分离对象 非极性 中等极性化合物
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（2）键合相的性质 –含碳量：含碳的百分数 含碳量： 含碳量 –覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅 覆盖度 醇基总数的比例 –封尾（end-capping）：在键合反应后，用三 封尾（end-capping）：在键合反应后， 封尾 ）：在键合反应后 甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。 甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。 （3）键合相的特点 –使用过程中不流失；化学稳定性好；柱效高； 使用过程中不流失；化学稳定性好；柱效高； 使用过程中不流失 重现性好；适于梯度洗脱； 重现性好；适于梯度洗脱；载样量大
第十八章 十八章 高效液相色谱法 第一节 HPLC主要类型与原理 HPLC主要类型与原理
一、HPLC与经典LC区别 HPLC与经典LC区别 与经典LC 二、HPLC与GC区别 HPLC与GC区别 三、HPLC主要类型和原理 主要类型和原理
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高效液相色谱法：以气相色谱为基础， 高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。
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3、操作条件差别 、 GC：加温操作 ： HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） ：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 三、HPLC主要类型和分离方法 主要类型和分离方法
1、四类基本类型色谱法 、
分配色谱法（partition chromatography） 分配色谱法（ 吸附色谱法（adsorption chromatography） 吸附色谱法（ 离子交换色谱法（IEC） 离子交换色谱法（ 空间排阻色谱法（SEC） 空间排阻色谱法（
2、化学键合相色谱法（最常见常用的一种） 化学键合相色谱法（最常见常用的一种）
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化学键合相色谱
采用化学键合相为固定相的液相色 谱法， 谱法，化学键合相是通过化学反应 将有机基团键合在载体表面构成固 定相
特点
固定相非常稳定，在使用中不易流失。 固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各 种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种 种极性的官能团键合到载体表面， 类繁多样品的分离。 类繁多样品的分离。
极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
离子交换基团 胺基、 胺基、季铵盐 磺酸、 磺酸、羧酸
2、键合相的性质和特点 （1）键合反应 –硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅胶 硅氧烷（Si－ Si－ 硅氧烷 进行硅烷化反应 十八烷基氯硅烷 硅胶
ODS(C18)键合相 键合相
YWG－ 无定形硅胶YWG YWG上键合了十八硅烷 如：YWG－C18H37，无定形硅胶YWG上键合了十八硅烷 ODS，球形硅胶Spherisorb 基；Spherisorb ODS，球形硅胶Spherisorb 上键 合了ODS ODS。 合了ODS。
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2、流动相差别 、 GC：流动相为惰性气体 ： 组分与流动相无亲合作用力， 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 ： 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 分离度增加了因素，对分离起很大作用 分离度增加了因素， 流动相种类较多， 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用； 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用；选用不 pH值的选择也对分离起到重要作用 同比例的两种或两种以上液体作为流动相； 同比例的两种或两种以上液体作为流动相；可以增大分离 选择性
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（3）键合相色谱法分离机理 ）
相键合相色谱: 固定相极性>流动相极性 正相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相：氰基、 常用固定相：氰基、氨基 常用流动相 己烷-醇 己烷 醇 庚烷-醇 庚烷 醇 分离对象 极性 中等极性化合物
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分离机制？ 分离机制？ –分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质 分配：把有机键合层作为一个液膜看待， 分配 在两相的溶解 –吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、 吸附 定向作用 • 分离选择性： 分离选择性： –极性强的组分k大，后洗脱出柱。 极性强的组分k 极性强的组分 后洗脱出柱。 –流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k 流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k 流动相的极性增强 减小，tR 减小。 减小， 减小。
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（1）正相键合相色谱：采用极性键合相为固定相， ）正相键合相色谱：采用极性键合相为固定相， 以非极性或弱极性溶剂为流动相。 以非极性或弱极性溶剂为流动相。 固定相极性>流动相极性 固定相极性 流动相极性 组分极性越大， 组分极性越大，保留 时间越长
有机基团
正相键合相色谱 分离溶于有机溶剂的极性 至中等极性分子型化合物
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3）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的 越大 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂， 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加， 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 中性盐的加入：使中性溶质的 增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 ：影响弱酸、 流动相的pH降低，弱酸 增大 增大， 增大； 流动相的 降低，弱酸k增大，tR增大；弱 降低 变小。 碱k变小。 变小
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二、HPLC与GC区别 与 区别
1、分析对象差别 、 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， ：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% 占有机物的 HPLC：溶解后能制成溶液的样品， ：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80% 用途广泛，占有机物的
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• 注意：流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶 注意：流动相的pH一般应在3 pH一般应在 溶解； 也有适用宽pH范围的键合相) 溶解；(也有适用宽pH范围的键合相) pH范围的键合相 二、化学键合相色谱法的流动相 • 对流动相的要求：流动相也称洗脱剂 对流动相的要求： – 与固定相不发生化学反应。 与固定相不发生化学反应。 – 对试样有适宜的溶解度。使k在1~10范围内， 对试样有适宜的溶解度。 范围内， 在 范围内 – 与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用 与检测器相适应。例如用紫外检测器时， 截止波长小于检测波长的溶剂。 截止波长小于检测波长的溶剂。 – 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙腈 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑ 等可以降低柱压，提高柱效。 等可以降低柱压，提高柱效。
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与经典LC区别 一、HPLC与经典 区别 与经典 主要区别：固定相差别， 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
1、经典 、经典LC：仅做为一种分离手段 ： 柱内径1~3cm，固定相粒径>100µm 且不均匀；常压输送流 ，固定相粒径 且不均匀； 柱内径 动相；柱效低（ ， ） 分析周期长； 动相；柱效低（H↑，n↓）；分析周期长；无法在线检测 2、HPLC：分离和分析 、 ： 柱内径2~6mm，固定相粒径<10µm（球形，匀浆装柱）； ，固定相粒径 柱内径 （球形，匀浆装柱） 高压输送流动相；柱效高（ ， ） 高压输送流动相；柱效高（H↓，n↑）；分析时间大大缩 短；可以在线检测
保留时间： 保留时间：
HO
COOH
COOH
OH OH
<
OH
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没食子酸
3,4-二羟基苯甲酸 二羟基苯甲酸
固定相: 非极性; 流动相: 固定相 非极性 流动相 极性 组分极性: 二羟基苯甲酸<没食子酸 组分极性 3,4-二羟基苯甲酸 没食子酸 二羟基苯甲酸
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一、化学键合相色谱法固定相 第十八章 十八章 高效液相色谱法 二、化学键合相色谱法流动相 第二节 固定相和流动相选择 三、分离条件的选择
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极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
（2）反相键合相色谱：采用非极性键合相为固定 ）反相键合相色谱： 相，以极性或弱极性溶剂为流动相 固定相极性<流动相极性 固定相极性 流动相极性 反相键合相色谱 组分极性越小， 组分极性越小，保 留时间越长
有机基团
分离溶于有机溶剂 的非极性或中极性化合物
反相键合相色谱疏溶剂分离机制
反相键合相色谱保留机Fra Baidu bibliotek——疏溶剂理论 疏溶剂理论 反相键合相色谱保留机制 溶质的保留主要是溶质 分子与极性溶剂分子间 的排斥力， 的排斥力，促使溶质分 子与键合相的烃基发生 疏水缔合。 疏水缔合。不是溶质分 子与键合相间的色散力。 子与键合相间的色散力。
反相键合相色谱疏溶剂分离机制
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例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇 水 甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水 十八烷基（ 十八烷基（疏水 基团） 基团）键合相
二醇基（ 二醇基（极性 基团） 基团）键合相
出峰顺序：苯酚，甲苯 出峰顺序：苯酚，
出峰顺序：甲苯， 出峰顺序：甲苯，苯酚
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键合色谱柱、 例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离 键合色谱柱 甲醇以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。 以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。
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（2）弱极性键合相： 弱极性键合相： 醚基和二羟基等键合相 用于反相或正相色谱 （3）极性键合相： 极性键合相： 常用氨基﹑ 常用氨基﹑氰基键合 相（氰乙硅烷基 CN)键合 ≡Si(CH2)2CN)键合 硅胶， 硅胶，一般用于正 相色谱
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键合固定相类 型 疏水基团 烷烃（ ）、苯基等 烷烃（C8和C18）、苯基等
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一、化学键合相色谱法的固定相
• 固定相应符合下列要求： 固定相应符合下列要求： –颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀 –化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好 1、键合相的种类 （1）非极性键合相 ： 与苯基等键合在硅胶表面； －非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； 非极性烃基， －用于反相色谱； 用于反相色谱； －长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 稳定性更好。 稳定性更好。
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1、流动相对分离的影响 、
n α -1 k2 R= ⋅ ⋅ 4 α 1 + k2
– n：由色谱柱（固定相）性能决定， ：由色谱柱（固定相）性能决定， – α：主要受溶剂种类的影响， α：主要受溶剂种类的影响， – k：受溶剂配比的影响。 ：受溶剂配比的影响。 2、流动相的强度和选择性 • 溶剂的极性（强度） 溶剂的极性（强度） –正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 正相色谱：溶剂极性越强， 正相色谱 –反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 反相色谱： 反相色谱
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反相键合相色谱保留行为主要影响因素
1）溶质的分子结构（极性） 溶质的分子结构（极性）
极性越弱，疏水性越强， 越大 越大， 也越大。 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱， 越大 越大； 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性， 值变小 值变小。 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。 2）固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加， 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质 也增大。 的k也增大。 也增大 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的 越大
疏水基团 C18基 C8基 苯基
2010-12-2
（3）键合相色谱法分离机理 ）
反相键合相色谱: 固定相极性<流动相极性 反相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相： 常用固定相：C18（ODS） ） 常用流动相 甲醇-水 甲醇 水 乙睛-水 乙睛 水 分离对象 非极性 中等极性化合物
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