外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位策略

《生物工程进展》2001,V ol.21,N o.6
专　论
外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位策略
钟向阳　石歆莹　周宏灏
(中南大学湘雅医学院基础与临床药理研究所,中国湖南　长沙　410078)
摘要　外源基因在大肠杆菌中表达是对基因重组技术的成功应用。

外源基因在不同的大肠杆菌表达系统中表达产物可能定位于大肠杆菌空间结构的不同位置:胞质,胞质膜,胞周质,胞外膜和
胞外培养基,五种表达定位方式各有其特点和用途。

关键词　大肠杆菌　外源蛋白　表达定位作者简介:钟向阳,男,博士。

石歆莹,女,博士生。

周宏灏,男,教授,博士生导师。

基因重组技术能从数量和质量上提供天然组织中难以得到的蛋白质等产物。

以大肠杆菌为宿主的体系是表达外源蛋白的首选体系,其遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、易于操作。

虽然人们开发出了多种真核表达体系,以克服大肠杆菌含内毒素、缺少翻译后修饰、高表达时易折叠错误等不足,但尚不能完全取代大肠杆菌表达体系。

大肠杆菌细胞学结构特点使表达的外源蛋白可能定位的五个位
置是:胞质,胞质膜,胞周质,外膜和胞外培养基[1]。

1　表达的外源蛋白定位在胞内
将外源DNA 或目的基因与表达载体构建成DNA 重组体,转化大肠杆菌后外源蛋白表达定位于胞内,是常见的表达方式。

11直接表达:即非融合蛋白表达。

将外源基因插到原核表达载体强启动子和有效S D 序列下游,以外源基因mRNA 的AUG 为起始翻译,表达产物位于胞内,氨基端和羧基端不含其他蛋白或多肽序列。

小分子蛋白较易表达,产物接近天然蛋白,但易被水解,不稳定。

当外源基因在大肠杆菌高效表达,特别是表达出大分子蛋白时,则易在胞内形成包涵体。

111　包涵体的形成及利用包涵体是由蛋白肽链错误折叠形成的不溶于水的非结晶性蛋白聚集体。

通常一级结构正确,但其立体结构有误;无生物学活性或活性很低,需变性、复性才可能得到活性蛋白。

包涵体的分离方法简单(差别离心、洗涤等),其形成可减轻外源蛋白对宿主的毒害,如果复性成本又较低,可考虑促进包涵体的
生成以获取大量表达产物。

外源基因在菌体内表达成有天然构象的蛋白,需一系列蛋白因子辅助。

包涵体形成可能主要与二类分子数量不足有关,也与蛋白折叠时环境条件密切相关
[2]。

112　蛋白肽链折叠与蛋白因子辅助
菌体内有二类分子参与肽链折叠:
分子伴侣是高度保守和分布广泛的蛋白,能帮助新生肽链折叠和转运,稳定蛋白质的未折叠状态和中间折叠状态,防止分子内和分子间不合适的相互作用,但不直接参与二级结构的构成。

大肠杆菌分子伴侣包括G roE L 、G roES 、DanK 、Dan J 、G rpE 、G rpE 、Htp G 等
[2,3]。

折叠酶是另一类辅助蛋白,催化与折叠有关的
化学反应,包括Dsb (二硫键催化酶)系列、PPIase (肽基脯氨酸顺反异构酶)等。

DsbA 、DsbB 等催化大肠杆菌中二硫键的形成[4]
,PPIase 催化折叠过程中起
限速步骤的顺反式异构反应,使肽链折叠时脯氨酸
残基由顺式变为反式
[2]。

Lee 等将G roES ΠE L 、DanK 与原胶原酶在大肠杆
菌中共表达或融合表达,以增加辅助蛋白肽链折叠的分子,可以提高后者的折叠效率和可溶蛋白的产量,防止形成包涵体
[5]。

不同蛋白质成熟途径不同,可能涉及不同的蛋白因子对蛋白质折叠起作用。

随着人们对折叠过程和机制的更深了解,能使更多蛋白实现胞内表达。

113　蛋白肽链折叠与环境条件优化
防止包涵体形成,最现实的办法是从培养和诱导条件入手。

如降低大肠杆菌生长温度以减少肽链间疏水表面相互作用,增加折叠成可溶性空间结构的机会;改变pH 值;缩短诱导时间;降低诱导物浓
5
度等。

融合蛋白表达,是防止包涵体形成的另一胞内表达方式。

21融合蛋白表达:
将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质、蛋白质片断或短肽(主要为原核来源)的DNA序列融合,在菌体内表达。

常用葡萄球菌A蛋白、谷胱甘肽巯基转移酶(G ST)、硫氧化还原蛋白(T rxA)、六个组氨酸(His)6小肽编码序列分别与S D序列连接构建融合表达载体。

融合表达具有如下优点:(1)利用原核宿主的表达调控系统,易于启动,可增加目的蛋白的表达量;
(2)可减少菌体内水解酶的作用,使目的蛋白、特别是小分子目的蛋白得到保护;(3)融合蛋白大多可正确折叠,减少了包涵体的形成;(4)便于亲和层析分离和检测,目的蛋白可从融合蛋白获得;(5)引导蛋白(或肽)一般不影响目的蛋白结构和功能,免疫原性小,融合蛋白可直接作抗原生产抗体。

但如果融合蛋白的两部分互相作用影响折叠,很容易受蛋白酶水解[6]。

融合表达也可能形成包涵体。

从融合蛋白分离纯化目的蛋白成本较高,也限制了其应用。

G raham RW[7]等用含纤维素结合结构域序列的表达载体pTugA和pTugAS,生成的融合蛋白含目的蛋白和纤维素结合域,可用纤维素亲和吸附分离纯化,降低了成本,简化了纯化步骤。

2　外源蛋白表达定位在胞质膜上
膜蛋白在分子识别、信号传导、物质运输、细胞代谢等方面有重要的意义。

由于结构和功能研究的需要,常需获得一定量的具生物活性的膜蛋白。

将跨膜蛋白表达定位在大肠杆菌质膜,已有些成功的报道。

G蛋白偶联受体含七个跨膜区,有重要的生理和药理学意义。

大肠杆菌内膜上表达定位的G蛋白偶联受体,已用于受体与配基的结合、G蛋白与效应物的偶联、受体自身的结构等研究[8]。

G risshammer R等[9,10]将鼠神经降压素受体(NTR)与大肠杆菌信号肽或周质蛋白M BP融合表达,Western blot分析表明,表达产物位于大肠杆菌内膜(质膜)。

为便于外源蛋白的分离,在NTR后加上多个His融合表达,发现“尾长”影响其表达效率。

Breyer RM等[11]在大肠杆菌内膜上表达β2肾上腺素受体,行突变后分析了受体结合配基的能力。

P2 4502b4蛋白也是一膜结合蛋白,在大肠杆菌可实现高效表达,用含T7启动子的表达载体每升培养物可获60mg外源蛋白,改变培养和诱导条件甚至高在100mgΠ升[12]。

3　分泌外源蛋白到胞周质
蛋白分泌到胞周质,是由大肠杆菌蛋白转运系统识别和转运,需要信号肽和Dan系列蛋白、G roE LΠES、Sec系列蛋白[13](SecAΠPrLD、SecB、SecC、SecD、SecEΠPrLG、SecF、SecG和SecYΠPrLA)等作为分子伴侣参与,而DsbA、DsbG则有助于蛋白在周质折叠[14,15]。

以蛋白跨膜转运和靶向装配研究为基础,人们发展了将外源蛋白分泌至胞周质的表达系统。

将外源基因融合到信号肽序列(通常来自大肠杆菌)下游,当含信号肽的前体蛋白经大肠杆菌内膜分泌到周质时信号肽被切除,成熟蛋白(目的蛋白)释放至周质。

这样(1)外源蛋白与胞质蛋白隔离,减少了降低,也避免了外源蛋白对胞浆可能的毒性作用;(2)生成的外源蛋白N端不会多一个蛋氨酸;(3)外源蛋白在胞周质中有利于二硫键形成,肽链正确折叠,有生物活性[15],(4)纯化较方便。

在胞周质表达定位时,常将外源基因融合到大肠杆菌周质蛋白phoA、外膜蛋白Om pA或Lam B的信号肽序列下游。

如人血管生成素序列与Om pA信号肽序列融合,可表达人血管生成素分泌至周质[16]。

但外源蛋白能否分泌表达定位于胞周质,与蛋白本身性质有关;高效表达的外源蛋白也可能折叠不正确,在胞周质中形成包涵体[17];表达效率相对较低,信号肽未切除或切除不正确[18]。

4　外源蛋白分泌到胞外培养基
少数蛋白可被大肠杆菌分泌到胞外。

以此人们开发出了分泌外源蛋白到培养基的表达系统。

外源基因与原核序列融合表达,将外源蛋白分泌到培养基中,分泌过程中信号肽被切除或不被切除。

这一表达方式有利于二硫键形成和蛋白折叠,减少了包涵体形成,避免了蛋白酶水解,纯化蛋白产物方法简单,便于工业化生产。

HlyA为大肠杆菌溶血素(haem olysin),可被分泌到胞外培养基。

含HlyA的分泌表达系统中,HylA 信号肽与外源蛋白序列融合,菌体内溶血素转运蛋白Hly B、HlyD和外膜蛋白T olC等协助表达产物从胞内转移至胞外,HlyA信号肽不被切除,融合蛋白
15
中HlyA信号肽不影响外源蛋白的正确折叠[19]。

L型大肠杆菌具细胞壁缺陷,利用其进行外源蛋白的分泌表达可减少外膜给分泌带来的障碍,使得只分泌到胞周质的蛋白可直接分泌到胞外培基,能实现工业化生产[20]。

5　表达外源蛋白定位于菌体表面
大肠杆菌蛋白经分泌可定位于菌体表面。

以大肠杆菌表面蛋白与外源肽或蛋白融合,表达外源肽或蛋白的菌株可用于构建活菌苗、筛选文库,研究蛋白与配体的相互作用、细胞间的粘附等[21]。

按菌体表面蛋白的类型,外源蛋白表达定位方式有三种:第一种方式是将外源肽插入大肠杆菌外膜蛋白的膜外区,使一些短肽在细菌表面呈示。

Nakajima H 等[22]将随机多肽与细菌侵袭素膜外环状结构域融合,在大肠杆菌表面呈现,从而构建成随机多肽文库,并用于筛选与人的细胞表面受体结合的靶肽。

第二种方式是将外源蛋白序列插入菌体表面的结构如鞭毛和菌毛的蛋白中,插入片断多为小片断,但也有长至300多个氨基酸的外源蛋白。

外源蛋白与鞭毛蛋白序列融合,在鞭毛蛋白缺陷型菌体表面呈现[23]。

又如将抗原性肽序列插入一型菌毛蛋白序列的特定区域,外源肽随一型菌毛蛋白在外膜表面呈现[24]。

菌株的这些结构有利于抗原与宿主免疫系统接触,可用于构建重组活疫苗。

第三种方式以菌体表面脂蛋白[25]或Lpp2Om pA 融合体[26]作为靶向载体蛋白,将外源蛋白或肽序列与脂蛋白或Lpp2Om pA的N端或C端序列融合,表达定位于菌体表面,可以表达大到40-50K D的外源蛋白。

G FP蛋白与Lpp2Om pA的C端融合,融合蛋白达43K D,经免疫电镜、免疫荧光、蛋白印迹证实被锚定到细菌表面,可用于多肽文库构建、活疫苗开发、信号传导研究[27]。

一些菌体表面蛋白序列对于外源蛋白正确定位是必需的。

当外源蛋白较大时,可能影响蛋白的空间结构而影响其在外膜上正确定位[28]。

结语:对基因表达和蛋白质合成的机制、影响因素的认识,是大肠杆菌表达外源蛋白的基础。

蛋白表达是一项很复杂的工作,特定蛋白可否在大肠杆菌或其他系统中按需要表达,目前尚无法预知。

五种表达定位方式各有特点,在研究工作积累和实验探索的基础上,应根据表达目的、研究内容、分离纯化条件、表达产物的性质,选择不同的大肠杆菌表达体系(特别是表达载体)。

随着对生物大分子合成和转移机制的进一步了解,会有更有效的表达系统出现,生产出更多符合人类需要的外源蛋白。

参考文献
　[1]C ornelis P.Curr Opin Biotechnol2000Oct;11(5):450-4
　[2]Thomas J G,Ayling A,Baneyx F.Appl Biochem Biotechnol1997
Jun;66(3):197-238
　[3]W ild J,R osmeissl P,W alter W A,et al J.bacteriol.1996;178:3608
-3613
　[4]G uilhot C,Jander G.M artin N A.1995;92:9895-
9899
　[5]Lee SC,Olins PO.J Biol Chem1992Feb15;267(5):2849-52.
　[6]W ild J,W alter W A,G ross CA,et al.J Bacteriol.1993Jul;175(13):
3992-7.
　[7]G raham RW,G reenw ood JM,W arren RA,et al.G ene1995M ay26;
158(1):51-4.
　[8]T ate CG,G risshammer R.T rends biotechnol1996N ov;14(11):426
-30
　[9]G risshammer R,Duckw orth R,Henders on R.Biochem J1993Oct
15;295(Pt2):571-6
　[10]G risshammer R,Tucker J.Protein Expr Purif1997Oct;11(1):53-
60
　[11]Breyer RM,S trosberg AD,G uillet J G E M BO J1990Sep;9(9):2679
-84
　[12]Saribas AS,G ruenke L,W askell L.Protein Expr Purif2001M ar;21
(2):303-9
　[13]Danese PN,S ilhavy T J Annu Rev G enet1998;32:59-94
　[14]Anders on C L,M attey2Dupraz,M issiakas D,et al.A M ol.M icrobiol.
1997;26:121-132
　[15]Wulfing C,Pluckthun A.M ol M icrobiol1994Jun;12(5):685-92
　[16]Y oon JM,K imSH,K w on OB,et al.Biochem M ol Biol Int1999;47:
267-73
　[17]Sribolmas N,Panbangred W,Sriurairataa S.Appl M icrobial Biotechn2
ol1997;47:373-8
　[18]Hewins on RG,Russel WP.J G en M icrobiol1993Jun;139(Pt6):
1253-9
　[19]Blight M A,H olland I B.T rends Biotechnol1994N ov;12(11):450-
5
　[20]G um pert J,H oischen C,Curr Opin Biotechnol1998;9(5):506-9
　[21]Francisco JA,G eorgiou G.Ann N Y Acad Sci1994N ov30;745:372
-82
　[22]Nakajima H,Shimbara N,Shim onishi Y,et al.G ene2000Dec30;
260(1-2):121-
　[23]W esterlund2W ikstrom B.Int J M ed M icrobiol2000Jul;290(3):223
-30
　[24]Pallesen L,P oulsen LK,Christiansen G,et alM icrobiology,1995
N ov;141(Pt11):2839-48.
　[25]K ornacker MG,Pugsley AP.M ol M icrobiol1990Jul;4(7):1101-9
　[26]G eorgiou G,S tephens D L,S tathopoulos C,et al.Protein Eng,1996,9
(2):239-47
　[27]Shi H,W en Su W.Enzyme M icrob T echnol2001Jan2;28(1):25-
34
25
　[28]S teidler L,Remaut E,Fiers W.M ol G en G ent1993Jan;236(2-3):187-92
Strategies and Approaches to Expression and Localization of
H eterologous Proteins in Escherichia coil
Zhong X iang2yang　Shi X in2ying　Zhou H ong2hao
(Institute of Basic and Clinical Pharmacology,X iangya M edical School,Central S outh University,Changsha　410078,Hunan,China)
Abstract　The expression of heterolog ous proteins is the m ost fascinating application of the recombinant DNA tech2 nique.The vectors from various expression systems of Escherichia coli provide the means for targeting a heterolog ous pro2 tein to any of the four subcellular com partments of the bacterial cell(cytoplasm,cytoplasmic membrane,periplasm and outer membrane)and extracellular medium.The production and localization of heterolog ous proteins or parts thereof in different com partments of Escherichia coli offers multiple applications.O f particular im portance is that secretion of pro2 teins is applicable for the production of proteins thereby enhancing protein activity and stability.Factors in fluencing fold2 ing,stability and export of extra2cytoplasmic proteins are als o better understood.
K ey w ords　Escherichia coli,heterolog ous proteins,expression and localization
　(接第37页)
　[17]　M as on I J,Fuller2Pace F,Sm ith R,M ech2Dev,1994445(1):15-
30.
　[18]　Y an G.,Fukabori Y,Nikolaropoulos S,M ol.Endocinal19926:
2123-2128.
　[19]　Alaid E T,Rubin J S,Y oung P,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
199491:1074-1078.
　[20]　Nemeth J A.,Z elner D J,Lang S,J.Endocrinol.1998Jan;156(1):
115-25.
　[21]　De Bellis A,Crescioli C,J.Clin Endocrinol M etab199883(6)2186
-91.
　[22]　Tsuboi R,Sato C,Shi C M,J.Dermatol199219(11):652-3.
　[23]　Brauchle M,Fassler R,W erner S.J2Invest2Dermatol1995　105
(4):579-84.
　[24]　Chedid M,Rubin J S,Csaky K G,J.Bio.Chem.1994269(14):
10753-10757.
　[25]　Ulich TR,Y i E S,Longmuir K,J.clin.Invest.199493:1298-
1306.　[26]　Borok2Z.,Danto S I,Dimen L L,Am.J.Physiol.1998　274:
L149-58.
　[27]　Y ano T,et al Am.J.Respir.Cell.M ol.Biol199615(4):433-
42.
　[28]　Xu X,M cC orm ick2Shannon K,V oelker DR,Am.J.Respir.Cell.
M ol.Biol.199818(2):168-78.
　[29]　Charafeddine L,D’Angio CT,Richards JL.Am.J.Physiol1999276
(1pt1):L105-13.
　[30]　Sugahara K,Iyama K,K uroda M J,J.Pathol1998186(1):90-8.
　[31]　Play fond R J,M archbank T,M andir N,Pathology1998184:316-
322.
　[32]　Farrell2Cl Bready J V,Rex K L,Lacey D L.Cancer Res.199858
(5):933-9.
　[33]　钟兴武龚向明中华眼科杂志　19981月第34卷第1期:15
-18.
　[34]　S iddiqi I Funatom i H,K obrin M S,Biochem2Biophys2Res2C ommum
1995215(1):309-15.
　[35]　Leung H Y,M ehta P,G ray L B,Oncogene199715(9):1115-20.
Progress in K eratinocyte G row th F actor
Jin Ping　Li Y u2xin　Ma T ong2hui　He Men2yuan
(The Institute of G enetics and Cytology,N ortheast N ormal University,Changchun　130024)
Abstract　K eratinocyte growth factor is a member of the fibroblast growth factor(FG F)family and was originally is olated from the conditioned medium of a human embry onic lung fibroblast cell line.KG F is secreted from cells of mes2 enchymal origin and possesses a target specificity restricted to cells of epithelial origin,regulating their proliferation,mi2 gration and differentiation.KG F consisted of a single polypeptide chain of26228K D.KG F bind to and activates KG F re2 ceptor(KG FR).KG F expression is regulated by sex steroid horm ones and s ome cytokines,including I L21,I L26and TG F. Recent studies have show that KG F may have im portant roles in maitaining epithelium and repairing the damaged epitheli2 um after injury of lung,gastrointestinal tract and cornea.
K ey w ords　KG F;FG F;epithelial cell;alveolar type II epithelial cell
35。