组织DNA提取原理和步骤 详细概述
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1）短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的pH 与DNA 贮存有关， pH为 8时，可减少DNA
脱氨反应，pH低于7.0时DNA容易变性。
2）长期贮存：
TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿
可有效防止细菌和核酸的污染。
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方法：
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浓度计算
DNA浓度（μg/ml）= A260nm× 50 × 稀释倍数 × 1/光径 *1OD 值相当于 50 μg/ml dsDNA，40μg/ml ssDNA 或 RNA， 2Oμg/ml寡核苷酸。
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试剂及其作用
1.裂解液（Homogenization buffer）: 10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 1mmol/L EDTA 0.1mol/L NaCl 1%SDS EDTA:抑制DNA酶活性
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完整性鉴定(integrity identification)
凝胶电泳法：
基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电
泳图谱脱尾现象； 总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如 加样槽中存在条带，可能是DNA污染。
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Fra Baidu bibliotek
核酸的贮存——DNA保存 (storage)
2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide，EB），可嵌 入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量 呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）
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EB与DNA的结合
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500l全血提取的基因组DNA电泳
动物组织提取基因组DNA
每克组织 + ml裂解液 组织匀浆器，匀浆 取2.0ml匀浆，加等体积苯酚-氯仿，摇匀5min， 2,500rpm 10min 取水相
加等体积氯仿-异戊醇,摇匀5min, 2,500rpm 10min
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取水相 加5M NaCl至终浓度0.3M NaCl, 加2.5倍体积 冰无水乙醇 ，摇匀 见白色沉淀,玻棒挑起
测定DNA在A260nm的光吸收值。
A260×稀释倍数×50＝
μg/ml
(A值等于1时，相当于50μg/ml双链DNA， 40μg/ml单链DNA或RNA， 20μg/ml单链寡核苷酸）
紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。
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各种碱基的紫外吸收光谱
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DNA
70%乙醇洗涤一次 沉淀溶于1ml TE 适当稀释 紫外分光光度计测A260nm,A280nm
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定量
吸取 DNA 原液 μl，用 ddH2O 稀释至 μl ， 在 紫 外 分 光 光 度 计 上 测 定 A260nm 及 A280nm， 计 算 A260nm/A280nm 比 值 及 DNA 浓 度 。 一 般 以 A260nm/280nm≈1.8为标准。 A260nm/A280nm 若＜ 1.6 ，提示有蛋白质或 酚污染，应进一步纯化。
组织DNA提取
Tissue DNA Extraction
http://www.shsmu.edu.cn/
[实验目的] 学习从生物组织中提取 DNA，为研究 DNA 的理化 性质与结构功能打好基础。
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提取DNA总的原则：
1 保证核酸一级结构的完整性；
2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的
为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自
由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，
造成DNA降解。
氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用
Tris-Hcl饱和酚，并调节至中性。
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3.氯仿-异戊醇（Isoamyl-alcohol）： 能降低分子表面张力，所以能减少抽提过 程中泡沫的产生，同时异戊醇有助于分相，使 离心后的上层水相、中层变性蛋白质及下层有 机溶剂相维持稳定。
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DNA酚抽提法示意图
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DNA鉴定(DNA identification)
浓度鉴定(concentration)
纯度鉴定(purity)
完整性鉴定(integrity)
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浓度鉴定 (concentration identification)
1）紫外分光光度法(ultraviolet spectrophotometery)
各种组织细胞破碎方法
细胞破碎方法 应用
机体软组织
动物韧性组织 细菌、酵母 细胞混悬液 培养细胞 细菌、病毒 红细胞
Ⅰ机械法
1匀浆法
2捣碎法 3研磨法
Ⅱ物理法
1超声法 2反复冻融法 3冷热交替法 4低渗裂解
Ⅲ化学法
1有机溶剂
2去垢剂 3酶解法
细菌、酵母
组织、培养细胞 细菌、酵母
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破裂细胞 、释放核酸
污染应降低到最低程度；
3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶
剂和过高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
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原理：
粉碎组织DNP 裂解液 裂解细胞膜、核膜 DNP 苯酚、氯仿 DNA（RNA） RNA酶 Protase Ｋ 苯酚、乙醇
纯DNA
紫外定量
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纯度鉴定(purity identification)
紫外分光光度法：
在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收，纯的DNA，
A260与A280之比应在1.80；低于此值表明制备物中留有蛋 白质成份。高于此值表明有RNA的残留量。 纯的RNA A260与A280之比应在2.0。 A260/A280比值是纯度检测的重要指标。
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4 . 冰 无 水 乙 醇 （ Absolute ethonal） 和 7 0 % 乙 醇 (70% Ethonal): 无水乙醇会夺去 DNA 周围的水分子，使 DNA失去水 而易于聚合；可除去残余的氯仿。 70%乙醇洗涤可去除残余的盐离子，盐离子的存在 会使之不易溶解，并可抑制酶反应。
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SDS是离子型表面活性剂，主要功能： ①溶解细胞膜蛋白而破坏细胞膜； ②解聚细胞中的核蛋白； ③与蛋白形成复合物
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2.苯酚-氯仿(Phenol-Chloroform): 苯酚：强蛋白变性剂 氯仿：蛋白变性剂，与水不互溶，与苯酚 互溶，可以带走残余的酚。
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脱氨反应，pH低于7.0时DNA容易变性。
2）长期贮存：
TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿
可有效防止细菌和核酸的污染。
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方法：
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浓度计算
DNA浓度（μg/ml）= A260nm× 50 × 稀释倍数 × 1/光径 *1OD 值相当于 50 μg/ml dsDNA，40μg/ml ssDNA 或 RNA， 2Oμg/ml寡核苷酸。
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试剂及其作用
1.裂解液（Homogenization buffer）: 10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 1mmol/L EDTA 0.1mol/L NaCl 1%SDS EDTA:抑制DNA酶活性
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完整性鉴定(integrity identification)
凝胶电泳法：
基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电
泳图谱脱尾现象； 总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如 加样槽中存在条带，可能是DNA污染。
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核酸的贮存——DNA保存 (storage)
2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide，EB），可嵌 入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量 呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）
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EB与DNA的结合
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500l全血提取的基因组DNA电泳
动物组织提取基因组DNA
每克组织 + ml裂解液 组织匀浆器，匀浆 取2.0ml匀浆，加等体积苯酚-氯仿，摇匀5min， 2,500rpm 10min 取水相
加等体积氯仿-异戊醇,摇匀5min, 2,500rpm 10min
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取水相 加5M NaCl至终浓度0.3M NaCl, 加2.5倍体积 冰无水乙醇 ，摇匀 见白色沉淀,玻棒挑起
测定DNA在A260nm的光吸收值。
A260×稀释倍数×50＝
μg/ml
(A值等于1时，相当于50μg/ml双链DNA， 40μg/ml单链DNA或RNA， 20μg/ml单链寡核苷酸）
紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。
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各种碱基的紫外吸收光谱
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DNA
70%乙醇洗涤一次 沉淀溶于1ml TE 适当稀释 紫外分光光度计测A260nm,A280nm
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定量
吸取 DNA 原液 μl，用 ddH2O 稀释至 μl ， 在 紫 外 分 光 光 度 计 上 测 定 A260nm 及 A280nm， 计 算 A260nm/A280nm 比 值 及 DNA 浓 度 。 一 般 以 A260nm/280nm≈1.8为标准。 A260nm/A280nm 若＜ 1.6 ，提示有蛋白质或 酚污染，应进一步纯化。
组织DNA提取
Tissue DNA Extraction
http://www.shsmu.edu.cn/
[实验目的] 学习从生物组织中提取 DNA，为研究 DNA 的理化 性质与结构功能打好基础。
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提取DNA总的原则：
1 保证核酸一级结构的完整性；
2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的
为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自
由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，
造成DNA降解。
氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用
Tris-Hcl饱和酚，并调节至中性。
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3.氯仿-异戊醇（Isoamyl-alcohol）： 能降低分子表面张力，所以能减少抽提过 程中泡沫的产生，同时异戊醇有助于分相，使 离心后的上层水相、中层变性蛋白质及下层有 机溶剂相维持稳定。
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浓度鉴定(concentration)
纯度鉴定(purity)
完整性鉴定(integrity)
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各种组织细胞破碎方法
细胞破碎方法 应用
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Ⅰ机械法
1匀浆法
2捣碎法 3研磨法
Ⅱ物理法
1超声法 2反复冻融法 3冷热交替法 4低渗裂解
Ⅲ化学法
1有机溶剂
2去垢剂 3酶解法
细菌、酵母
组织、培养细胞 细菌、酵母
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破裂细胞 、释放核酸
污染应降低到最低程度；
3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶
剂和过高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
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原理：
粉碎组织DNP 裂解液 裂解细胞膜、核膜 DNP 苯酚、氯仿 DNA（RNA） RNA酶 Protase Ｋ 苯酚、乙醇
纯DNA
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纯度鉴定(purity identification)
紫外分光光度法：
在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收，纯的DNA，
A260与A280之比应在1.80；低于此值表明制备物中留有蛋 白质成份。高于此值表明有RNA的残留量。 纯的RNA A260与A280之比应在2.0。 A260/A280比值是纯度检测的重要指标。
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4 . 冰 无 水 乙 醇 （ Absolute ethonal） 和 7 0 % 乙 醇 (70% Ethonal): 无水乙醇会夺去 DNA 周围的水分子，使 DNA失去水 而易于聚合；可除去残余的氯仿。 70%乙醇洗涤可去除残余的盐离子，盐离子的存在 会使之不易溶解，并可抑制酶反应。
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SDS是离子型表面活性剂，主要功能： ①溶解细胞膜蛋白而破坏细胞膜； ②解聚细胞中的核蛋白； ③与蛋白形成复合物
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2.苯酚-氯仿(Phenol-Chloroform): 苯酚：强蛋白变性剂 氯仿：蛋白变性剂，与水不互溶，与苯酚 互溶，可以带走残余的酚。
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