色谱联用技术LCMS

由于 HPLC目前的应用极其广泛， 特别是在我们药学专业应用更为普遍， 所以 LC-MS 在使用上比 GC-MS 有更 高的使用价值。
二、LC-MS的工作原理
与GC-MS基本相同，最大的不同是接口不同。 另外， LC-MS 一般用来分析挥发性差，热不稳 定的样品，应用范围增大。 非极性化合物不能分析。（难以离子化）
（1）种类：甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合 物以及易挥发盐的缓冲溶液。 若流动相需用缓冲溶液，该缓冲液最好具有挥发 性，这样可减少缓冲盐在离子源内的沉积。
应当根据样品所需的极性以及样品的pH值，调节 流动相的pH。
蛋白酵素
流动相应当具有低的蒸发热和低的表面张力，以 增强离子的解吸作用，离子化效率提高。 （2）流速：和色谱柱的内径有关，内径越小流量越 小。 0.3 1.0 2.1 4.6 内径(mm) 10 30~60 200~500 >700 流速(μl/min)
五、 HPLC-MS的灵敏度
MSD与DAD的比较
（三甘油）
（椰子油） 椰子油
氨基甲酸盐
六、LC-MS联用仪的真空
七、 碰撞诱导解离（CID）技术
电喷雾是一种“软”电离技术，通常只形成准 分子离子，提供分子量信息。但是在实际工作中， 特别是对未知化合物的分析，不仅需要分子量，而 且更需要尽可能多的化合物碎片信息。 碰撞诱导解离（CID）可解决这一不足。
电喷雾接口（ ESI）液滴变化示意图:
Charged Droplets
--+ + ++ + + + + + + + + + + + - + - + ++ - -- + + -+ --+ + ++
+ +
－
从毛细管喷出
Rayleigh限
（在3～8kV电场作用下） N2气流干燥
试样
＋ －
气态试样离子
+
+
① 电喷雾
电喷雾接口（ESI）工作原理:
三个步骤：a、带电液滴的形成； b、溶剂 蒸发和液滴碎裂；c、离子蒸发形成气态离子
电喷雾接口（ESI）工作原理:
a、带电液滴的形成 色谱流出物经毛细管顶端喷出，形成扇状喷雾， 再 3~8kV 的高电场作用下，形成高度电离、含有溶剂 的试样微小液滴。 b、溶剂蒸发和液滴碎裂
选择离子监测： SIM用于检测已知或目标化合物，比全扫 描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集 的方式一般用于定量。 若几种目标化合物用同样的数据采集方式 监测，那么可以同时测定几种离子.
Precursor Ion Scan(母离子扫描)
• Q1 sweeps a given mass range, Q3 is fixed • Used to determine the “origin” of particular product ion(s) created in the collision cell • Frequently used for drug metabolite identification (common product ion observed in the metabolites)
气态试样离子
+
+ +
+
<10nm
ESI的垂直模式：
以上过程是在大气压条件下进行的，在强电场驱使 下，电离的溶质离子通过一个金属毛细管进入真空区， 并电场作用不断加速聚焦进入质量分析器。 参见备注
电喷雾接口的特点:
主要给出准分子离子信息，（例如[M+H]＋、 [M+Na]＋ 、[M−H]−、 [M−Na]−等），以及大量的多 电荷离子，而较少给出化合物的碎片离子；
APCI的优势：适用于弱极性物质的测定。也可分析非 极性化合物，但灵敏度较低。
2. 正负离子模式的选择
由在溶液中能够形成的离子极性决定离子的极化方式。
（1） 正离子模式
如果在溶液中能够形成的离子为正离子，如碱性物质， 则离子化模式选择为正离子模式。得到的准分子离子一般 为[M+H]＋，其他也较常见的如[M+Na]＋ 、 [M+NH4]＋ 、 [M+Na+CH3OH]＋ 、 [M+H+CH3OH]＋ 等。 正离子模式一般用乙酸（pH3~4）或甲酸（pH2~3） 对样品进行酸化，若样品的pK值已知，pH至少低于pK值2 个单位。
这里所讲的CID是指“源内CID，In-Source CID”。
惰性气 体 参见备注
没有商业谱库
缩氨酸
八、多极质谱（串联质谱）
（Tandem Mass Spectrometry）
1. 空间上的串联质谱（tandem-in-space）
由两个以上的质量分析器串联而成。 简称串联 质谱。 常见的为：三级四极杆质谱
– Used to optimize analyzer for specific ions – SIM used for quantitative analyses – Q1 SIM used to “optimize” precursor ion
• Maximize signal in preparation for MS/MS
150℃
[Sol+H]+＋M →
[M＋H] +＋ Sol （质子转移）
或 [Sol+H]－＋M → [M＋H]－ ＋ Sol Sol+＋M → M+ ＋Sol 或 Sol－ ＋MH → M－ ＋SH （质子抽出）
特点：
▲很少产生碎片，离子流集中在几种离子形式（一 般为准分子离子），所以灵敏度高。
API4000三重四级杆质谱仪示意图
CID

单四极杆与串连四极杆质谱对比
串联质谱基本功能： （各种扫描方式）
（1）Q1全扫描
（2）母离子（precursor ion）扫描
初始离子扫描
（3）子离子（Product Ion）扫描
（4）中性碎片丢失扫描
（5）多重反应监测
（Multiple Reaction Monitoring MRM ）
m1+ scanned
m3+ fixed
Example of Precursor Ion Spectrum
1.2e7 520.3 5 8 7 .5
Intensity, cps
9.0e6
6 3 3 .4
6.0e6 7 4 5 .6 3.0e6 8 0 2 .4 8 9 5 .6
Q1 Scan
1105.0
Atmosphere Vacuum System
Mass Analyser Data System
Sample Inlet
tector
三、LC-MS的接口
1. 接口的重要性
接口是HPLC与质量分析器之间的过渡装置并承 担着离子化的任务。 由于MS需在真空下操作，以便完成离子形成、 分离、检测的过程。但是HPLC出口含有大量的流动 相（溶剂）（0.2～2mL/min）。
液滴与干燥气作用，在干燥气的作用下，溶剂蒸 发，离子向液滴表面移动，造成液滴表面的离子密度 越来越大，当达到Rayleigh限时，液滴表面电荷产生的 排斥力与液滴表面的张力大致相等，液滴非均匀破裂， 分裂成更小的液滴，更小的液滴继续重复蒸发、电荷 过剩和液滴分裂的过程。
c、离子蒸发形成气态离子 当液滴分裂至小于10nm时，其表面形成的电场足够 强，电荷的排斥作用导致部分离子从液滴表面蒸发出来， 最终以单电荷或多电荷离子形式从液滴中转移至气相， 形成气相离子。
（2） 负离子方式
如果在溶液中能够形成的离子为负离子，如酸性物质， 则离子化方式选择为负离子方式。得到的准分子离子一般为 [M－H]－ 。 负离子模式可以用氨水或三乙胺对样品进行碱化，pH 至少高于样品pK值2个单位。 对于酸碱性不明确的物质，可以先使用APCI（+）模 式进行预试。
3. 流动相的种类及流量的选择
HPLC-MS的特点：
MS作为LC的检测器不仅能得到色谱数据，如：峰保留时间、 峰高、峰面积等，同时亦可得到质谱信息。具体如下： 1、质谱为通用性检测器，可测定不带生色团或荧光基团的 化合物； 2、质谱也是选择性检测器，用选择离子检测可一次完成定 性、定量分析，且灵敏度很高。 3、提高鉴别化合物的可信度；可准确分析色谱峰的纯度； 确定分子量。 4、可分析不适合 GC-MS分析的亲水性强、热不稳定及生 物蛋白化合物。 5、在线分析，免去了色谱组分的收集，减少样品损失，缩 短工作周期。 6、适用范围宽，正相、反相、离子对及手性色谱均可使用。 7、采用碰撞诱导解离技术 (CID) 以及多极质谱等可提供丰 富的化合物结构信息。
高效液相色谱－质谱 （HPLC-MS）联用技术
HPLC-MS简称LC-MS
一、概述
HPLC-MS是近些年出现的联用仪器，发展非常 迅速，弥补了 GC-MS 只能测定挥发性或半挥发性物 质的不足，使色谱－质谱联用技术得到了完善。 GC-MS 由于接口技术技术难度相对较小，因此， 开发使用较早，而 HPLC － MS 接口技术技术难度较 大，开发使用较晚。 HPLC-MS所提供的信息与GC-MS相同（TIC、 MC、SIM、全扫描三维图等）。
m1+ fixed
m3+ scanned
Example of Product Ion Spectrum
OH H N CH 3 CH 3
Ephedrine（麻黄碱）, MW = 165
M+1
中性丢失扫描
中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认 类型已知的化合物，也可以帮助进行未知 物结构判断。 例如：18-H2O，28-CO，30-HCOH， 32-CH3OH，44-CO2等等。