荧光素FITC标记抗体的方法
异硫氰酸荧光素标记机理
异硫氰酸荧光素标记机理
异硫氰酸荧光素标记是利用化学反应将异硫氰酸荧光素（FITC）标记在目标分子上，用于生物医学和细胞生物学的研究。
FITC是一种荧光染料，可被激发发射绿色荧光，特异性标记分子后，可通过荧光显微镜或流式细胞仪等技术进行检测和定量。
异硫氰酸荧光素标记机理包括两个步骤：活化和标记。
首先，异硫氰酸根离子（NCS）与FITC分子中的胺基发生互反应，生成活化的FITC异硫酰（FITC-O-S-C-NH2），它具有高度反应性和亲水性，易与含有游离胺基、硫氢酰基或巯基的分子反应。
然后，FITC异硫酰与目标分子中含有以上官能团的基团结合，生成FITC标记分子。
异硫氰酸荧光素标记技术具有灵敏、可重复和定量等优点，常用于荧光标记抗体、蛋白质、核酸和细胞等生物大分子以及药物等小分子的研究。
荧光素FITC标记抗体的方法
荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1．Marsshall法(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol／LPBS等。
(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。
f．PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。
FITC标记抗体流程
其中FITC应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长520～530nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.0～9.5)条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。
抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。
当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。
一,FITC标记抗体流程（1）将待交联的蛋白（浓度≥1mg/ml）对交联反应液透析三次(4 ℃)，至pH＝9.0。
交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。
（2）将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/ml。
每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。
（3）按P:F（蛋白质：FITC）=1mg:150μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 ℃反应8 hr。
（4）加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L， 4 ℃终止反应2 hr。
（5）将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
（6）交联物的鉴定蛋白浓度(mg/ml) = [ A280– 0.31×A495] / 1.4F/P比例: 3.1×A495 / [A280–0.31×A495]，该值应介于2.5 ~ 6.5之间。
（7） FITC交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃暗处保存。
二,免疫荧光组织化学染色方法1.直接法简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。
操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。
荧光素FITC标记抗体方法
荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1．Marsshall法(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol／LPBS等。
(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。
f．PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。
(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。
(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。
(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。
if和ihc法
if和ihc法
IF和IHC法是两种常用的免疫组织化学技术，用于检测组织
或细胞中特定蛋白的表达情况。
IF（Immunofluorescence）法是一种利用荧光染料标记抗体或
抗原的技术。
首先，组织样本或细胞样本被固定并与特异性的抗体结合。
然后，将荧光染料标记的二抗加入样本中，与前一步所结合的抗体结合形成复合物。
最后，通过荧光显微镜观察，根据荧光信号的分布，可以判断特定蛋白在细胞或组织中的表达情况。
相比之下，IHC（Immunohistochemistry）法使用酶或酶标记的二抗，并使用染色剂表现酶的活性，用于显示特定蛋白在组织细胞中的位置和含量。
首先，组织或细胞样本被固定并与特异性的抗体结合。
然后，添加酶标记的二抗，使其与前一步中的抗体结合。
接着，通过染色反应，如使用DAB（二氨基苯）
等染色剂，使标记的抗体和酶形成可见的染色产物。
最后，通过光学显微镜观察，根据颜色的分布和密度，可以判断特定蛋白在样本中的表达情况。
两种方法都可用于定性和定量分析蛋白的表达水平和定位。
选择使用哪种方法取决于研究的具体需求和样本特点。
荧光素标记抗体技术
荧光素标记抗体技术(一)原理目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或罗达明(Lis samine rhodamine B200, RB200)。
在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。
在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。
(二) 操作步骤将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，透析后抗体液移入小烧杯中↓称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)使终浓度为1mgFITC／1mlDMSOFITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFITC／mgIgG；如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG在10ml小烧杯中先放入抗体↓按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中↓将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h↓用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G25柱↓收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P比值。
第二个荧光素峰为游离荧光素计算:2.87×A495F／P＝────────A280-0.35×A495合适的F／P值为2～4。
(三) 试剂器材1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。
2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。
3. PBS、DMSO4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。
5. PD10柱(Sephadex G25柱)6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等(四) 注意事项1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。
抗体FITC标记操作流程记录
抗体FITC标记操作流程记录1.准备实验材料和试剂：-使用双蒸水去离子水做媒介，保证无杂质。
-准备用于标记的FITC抗体和FITC标记试剂盒。
-合适的缓冲液（例如PBS）用于稀释抗体和洗涤样品。
2.准备样品：-如果需要标记的是细胞，将细胞培养在合适的培养基中，并将其接种在预处理好的玻片上。
-如果需要标记的是组织切片，将组织固定在适宜的固定剂中，切割成适当的厚度。
3.处理样品：-对于细胞样品，进行适当的固定和渗透，以保持细胞形状和抗原结构的完整。
-对于组织样品，进行适当的脱水、透明化和抗原修复等步骤。
4.准备标记试剂：-按照标记试剂盒的说明书，将FITC标记剂和稀释液按照特定比例混合，并充分搅拌均匀。
5.标记抗体：-将抗体与FITC标记试剂混合，然后在室温下孵育一段时间（通常为30-60分钟）。
-注意避免直接阳光照射，以免造成荧光剂失效。
6.洗涤样品：-使用PBS或合适的缓冲液对细胞或组织样品进行洗涤，以去除未与抗体结合的游离FITC。
7.孵育样品：-将标记好的抗体溶液滴加在样品上，使其充分覆盖样品表面，并在室温下孵育一段时间。
-孵育时间通常为1-2小时，以确保抗体与抗原结合充分。
8.再次洗涤样品：-使用PBS或合适的缓冲液对样品进行再次洗涤，以去除未与抗体结合的游离FITC。
9.固定样品：-对于细胞样本，使用适当的固定剂固定细胞并保存形态。
-对于组织切片，将标记好的样品用适当的固定剂进行固定。
10.显微观察和图像获取：-将标记好的样品放在显微镜下观察。
-使用适当的荧光滤光片来选择FITC的激发和发射波长，并记录图像。
11.数据分析：-根据显微观察到的荧光信号，分析抗体FITC标记的结果。
-可以通过计算荧光强度、分析荧光背景等进行数据分析。
12.结果的记录和表示：-将观察到的结果记录下来，并通过图表或图片等形式表示。
13.清洁和处理垃圾：-将使用过的试剂瓶、玻片和其他实验用具进行清洁和处理。
-将废弃物按照规定的程序进行垃圾处理，以确保实验室的安全和环境保护。
带你了解多种异硫氰酸荧光素（FITC）荧光抗体的标记
带你了解多种异硫氰酸荧光素（FITC）荧光抗体的标记1. 将待标记的抗体/蛋白（浓度≧1mg/ml）对标记反应液 (90mM NaHCO3，10mM Na2CO3，126mM NaCl,pH9.0) 于4℃透析三次。
2. 将FITC(Frdbio)溶于DMSO中，浓度为20mg/ml。
每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。
3. （抗体/蛋白质：FITC）=1mg:150μg的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光4℃反应8h。
4. 加入5M的NH4Cl至终浓度50mM，4℃终止反应2h。
5. 将标记产物在PBS中透析4次以上，至透析液清亮。
6. 交联物的鉴定蛋白浓度(mg/ml)=[A280–0.31×A495]/1.4抗体/蛋白质：FITC比例=3.1×A495/（A280–0.31×A495），该值应介于2.5～6.5之间。
7. FITC标记的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，30%甘油，短期保存于4℃避光，长期应该-20℃避光保存。
荧光素FITC标记蛋白荧光素FITC标记的抗Brdu单克隆抗体异硫氰酸荧光素(FITC)标记胸腺五肽(TP5)FITC-TP5FITC标记的叶酸类衍生物FITC荧光标记糖FITC标记某一种药物FITC标记一种糖蛋白实验用FITC标记小分子化合物分子量400-500FITC-PhalloidinFITC标记鬼笔环肽FITC荧光素标记细菌FITC标记葡聚糖FITC标记重组灵芝免疫调节蛋白5'——FITC标记的PCNA反义寡核苷酸FITC标记的帕西瑞肽衍生物FITC标记糖肽类抗生素FITC标记的虾自斑综合症病毒FITC标记的维生素B12衍生物荧光素FITC标记甘氨酸FITC标记壳聚糖荧光浆料FITC标记红桂木凝集素小编YQ2021.1。
荧光素FITC标记抗体的方法
荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1．Marsshall法(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol／LPBS等。
(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于使最后免疫球蛋白浓度为再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，烧杯中，20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。
f．PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓。
荧光抗体标记_实验报告
一、实验目的1. 掌握荧光抗体标记技术的基本原理和操作步骤。
2. 学会使用荧光显微镜观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。
3. 了解荧光抗体标记技术在生物医学研究中的应用。
二、实验原理荧光抗体标记技术是将荧光素与特异性抗体结合，形成荧光标记抗体。
这种标记抗体仍保持抗体原有的活性，当与相应的抗原发生特异性结合时，荧光标记抗体在荧光显微镜下呈现出明亮的荧光，从而实现对抗原的检测和定位。
三、实验材料1. 实验试剂：FITC标记的抗体、抗原、抗体稀释液、磷酸盐缓冲液（PBS）、甘油、甲醇等。
2. 实验仪器：荧光显微镜、离心机、移液器、吸管、试管、载玻片等。
四、实验步骤1. 标准化抗体将FITC标记的抗体用抗体稀释液稀释至适当浓度。
2. 制备抗原将待检测的抗原用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至适当浓度。
3. 制备细胞悬液将待检测的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，离心弃去上清液，加入适量的磷酸盐缓冲液重悬细胞。
4. 混合抗原与抗体将抗原与抗体按一定比例混合，在室温下孵育一段时间。
5. 洗涤将混合后的溶液在室温下用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次洗涤后离心弃去上清液。
6. 封片将洗涤后的细胞沉淀用甘油封片，封片剂与细胞沉淀的比例为1:1。
7. 荧光显微镜观察将封片置于荧光显微镜下观察，调整显微镜参数，观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。
五、实验结果通过荧光显微镜观察，发现荧光标记的抗体与抗原发生了特异性结合，形成明亮的荧光复合物。
阳性细胞在荧光显微镜下呈现出明显的荧光信号，而阴性细胞则无荧光信号。
六、实验讨论1. 实验过程中，抗体与抗原的孵育时间、洗涤次数和封片剂的选择对实验结果有较大影响。
本实验中，抗体与抗原的孵育时间为30分钟，洗涤次数为3次，封片剂为甘油。
2. 荧光抗体标记技术具有特异性高、灵敏度高、操作简便等优点，广泛应用于生物医学研究、临床诊断等领域。
3. 在实验过程中，应注意以下几点：（1）抗体与抗原的比例要适中，过多或过少都会影响实验结果；（2）孵育时间不宜过长或过短，以免影响抗体与抗原的结合；（3）洗涤时要充分，以去除未结合的抗体和抗原；（4）封片剂的选择要合适，以保证荧光信号的稳定。
荧光素FITC标记抗体的方法
荧光素FITC标记抗体的方法荧光素FITC（Fluorescein Isothiocyanate）标记抗体是一种常用的免疫染色技术，在生命科学研究中广泛应用于细胞、组织和分子的可视化及定量分析。
荧光素FITC标记抗体的方法主要包括材料准备、抗体标记、纯化和检测等步骤。
材料准备：1. 荧光素FITC标记剂（Fluorescein Isothiocyanate）2.抗体样品（可购买或通过克隆等方法获取）3. Phosphate-buffered saline (PBS)缓冲液（pH 7.4）4.碳酸氢钠（NaHCO3）5.钠氢磷酸二水合物（Na2HPO4·2H2O）6.无水甲醇或二甲基亚砜（DMSO）抗体标记：1. 将所需量的荧光素FITC标记剂溶解在无水甲醇或DMSO中，得到FITC标记剂的浓度为1-10 mg/mL。
2.将抗体溶液与FITC标记剂按照一定的比例混合，通常比例为1:1到1:10，充分混合。
3.在充满PBS缓冲液的离心管中加入混合液，并在黑暗条件下，在4°C下孵育1-2小时或过夜，以进行反应。
纯化：1.将样品离心5分钟，以去除半固体物质。
2.用PBS缓冲液洗涤标记抗体1-2次，以去除未反应的FITC和其他杂质。
3.使用滤过设备，例如蛋白尺寸排除柱（如蛋白G纯化柱），将抗体从未反应的FITC和其他杂质中进一步纯化。
检测：1.使用荧光显微镜或流式细胞术检测标记抗体的荧光素FITC信号。
2.荧光显微镜：将样品涂盖在载玻片上，使用适当波长的激发光源照射并观察荧光信号。
3.流式细胞术：将标记抗体与细胞混合，通过流式细胞术仪器检测细胞中FITC的荧光信号。
1.可以在活体组织或细胞中进行实时或定量检测。
2.FITC标记抗体稳定性较好，可以在长时间照射下保持荧光信号不衰减。
3.FITC标记抗体荧光信号强度较高，检测灵敏度较好。
4.FITC标记抗体可以与其他标记的抗体同时使用，实现多重染色。
fitc-bsa荧光标记法
fitc-bsa荧光标记法
以下是使用荧光标记牛血清白蛋白（FITC-BSA）荧光标记法的简要步骤：
1. 将异硫氰酸荧光素（FITC）采用化学交联法标记到BSA分子上。
2. 对标记产物进行纯化，以确保其质量和荧光性能。
3. 进行蛋白定量、FITC浓度及效价鉴定，以确保标记的准确性和一致性。
4. 观察和检测荧光信号，以评估标记的效果。
此外，该方法具有以下优点：
1. 高度荧光稳定性：在光照和化学条件下具有较低的褪色率，因此荧光信号可以持久地保持较长时间。
2. 特异性标记：通过与BSA共价结合来特异性标记BSA分子，确保了标记的稳定性和特异性。
3. 生物相容性：BSA是一种常见的蛋白质，具有良好的生物相容性和低毒性，将荧光标记到BSA上可以提高荧光染料的稳定性和生物相容性，减少对样品或细胞的不良影响。
4. 灵敏度和检测性能：作为荧光标记物具有较高的灵敏度和检测性能，可以在相对低的浓度下进行检测和观察。
5. 多功能性：可以用于免疫荧光染色、细胞成像、蛋白质定位、细胞分析和分子相互作用研究等，其荧光信号可以与不同的实验技术和设备兼容，提供灵活和多样化的实验选择。
荧光素FITC标记抗体方法
荧光素FITC标记抗体方法荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）是一种常用的荧光染料，广泛应用于细胞和组织标记。
荧光素FITC标记抗体方法是通过将FITC染料与抗体共化合，实现对特定抗原的检测与定位。
下面介绍一种常用的荧光素FITC标记抗体方法。
一、材料准备：1.FITC染料：从商业供应商购买具有高纯度的FITC染料，最好使用高纯度的FITC染料。
2.抗体：选择与目标抗原结合的特异性抗体。
3. 缓冲液：例如0.01 M PBS（phosphate-buffered saline，PBS）等。
4. 交联剂：例如戊二醛（glutaraldehyde）等。
5.离心机：用于离心洗涤步骤。
6.荧光显微镜：用于观察荧光素标记的抗体。
二、FITC标记抗体方法步骤：1. 准备荧光素FITC溶液：根据抗体浓度调整FITC染料浓度。
通常建议使用1 mg/mL的FITC染料溶液。
2.准备抗体溶液：使用适当的缓冲液稀释抗体至所需浓度。
3.将荧光素FITC溶液与抗体溶液按比例混合，使其均匀混合，最好在黑暗条件下进行。
4.在混合物中加入适量的缓冲液，并将其在室温下静置足够时间（通常为1-2小时）。
此步骤是为了保证荧光素FITC与抗体充分反应，形成共价键。
5.添加适量的交联剂（例如戊二醛）进行交联反应。
该步骤有助于稳定化合物。
6.在室温下搅拌1-2小时，然后离心洗涤步骤中的沉淀。
7.使用冷冻离心机将上述混合液离心10分钟以除去未反应的FITC。
8.弃去上清液，用适量的缓冲液洗涤沉淀2-3次，以除去剩余的FITC染料。
9.加入适量的缓冲液使沉淀均匀悬浮，以得到FITC标记抗体的最终溶液。
10.对所得荧光素FITC标记抗体进行质控实验，如免疫组化或细胞标记实验等。
11.在荧光显微镜下观察标记抗体的染色效果，根据实验需要选择适当的显微镜参数进行观察。
总结：荧光素FITC标记抗体方法是一种常用的荧光标记方法，可以用于细胞和组织中的抗原的定位与检测。
有关FITC标记的事项
免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。
在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
应用范围：其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。
根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。
荧光的基本知识一、荧光现象（一）荧光的产生一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。
荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。
可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为光致荧光。
由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。
荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。
（二）荧光效率荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。
荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。
荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。
各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。
选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。
（三）荧光的猝灭荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。
FITC蛋白标记方法
FITC蛋白标记方法
1.溶液准备：0.15mol/L NaCl溶液，配法，称取8.775gNaCl溶解于
1L水中，
0.15mol/L NaHCO3-Na2CO3,PH9.0缓冲液，配法，取（1.59%）Na2CO3
10ml，（1.26%）NaHCO3 90ml,调PH到9.0
2.蛋白溶解液：按V0.15mol/L NaCl：V0.15mol/L NaHCO3-Na2CO3=9:1，溶解蛋白，使蛋白的终浓度为10mg/ml。
3.加入荧光素，加入的荧光素的质量按m蛋白：m荧光素=50~80mg:1mg,称取完成后加入事先配好的蛋白溶解液中，于4℃生化培养箱中，摇床混匀过夜。
注意加入荧光素后需要避光。
4.将混匀后的溶液转移到Millpore超滤管中，超滤管中滤膜可以拦截分子量大于3KD的分子，配平后以5000g的转速于日立高速离心机（型号？）离心至无荧光素滤出为止。
大约需离3次，每次离心需2-3h。
5.离心结束后，将超滤管中的标记液倒入用锡箔纸包裹的塑料管中，不加叠氮钠于4℃保存。
参考文献：MMP-3 Contribute to Nigrostriatal Dopaminergic Neuronal Loss,BBB Damage, and Neuroinflammation in an MPTP Mouse Model of Parkinson’s Disease.。
医学免疫学：免疫荧光标记技术之荧光抗体制备
激发可使荧光很快的猝灭，因而要避免与以上化 学物质接触。
标记的温度和时间：在搅拌法时，应选择适当的 温度和时间。
标记温度 0～4 ℃ 7～9 ℃ 20～25 ℃
标记时间 18h
4h
1～2h
pH值：在标记过程中，pH对标记有很大的影响。 pH高反应快，偏低标记慢。pH大于10蛋白质易 变性，pH大于11荧光猝灭，一般pH以9±0.5合适。
FITC和蛋白质的比例：FITC和蛋白质的浓度应按 照一定的比例，一般质量比在1：100左右。
在碱性条件下fitc的异硫氰基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键使荧光素和蛋白质结合
免疫荧光标记技术
之荧光抗体制备
前言
荧光抗体：将荧光素与某种抗体以化学方法共价 结合而成。
常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙 基罗丹明（RB200）、藻红蛋白（PE）等， FITC最常用。
一个IgG分子有86个氨基酸残基，最多能标记15-20个荧 光素。
主要的试剂和器材
FITC 20mg/ml IgG溶液 0.005M pH7.0磷酸缓冲液、 0.5M pH9.5 碳酸
盐缓冲液 Sephadex G-25、层析柱 磁力搅拌器、称量瓶
实验步骤
精确称取FITC 2mg至称量瓶中，加入1ml 0.5M pH9.5 碳酸盐缓冲液溶解，在磁力搅拌器上不断 搅拌。（已完成）
将20mg/ml IgG溶液10ml置于另一称量瓶中，于 磁力搅拌器上搅拌，保持20℃，逐渐滴加入FITC 溶液。随即以pH试纸测试，用0.1M 碳酸钠溶液 调节，保持pH值在9.5左右。加盖，减少与空气 的接触，连续搅拌1h。（已完成）
荧光标记抗体
F/P=
2.87×OD495nm OD280nm－0.35×OD495nm
注意事项
1.影响标记效率的因素有温度、时间、pH、荧光素和蛋白 的量等，需注意控制。 2.荧光素及其标记抗体的操作过程注意避光，搅拌速度应适 当以避免气泡产生。 3.层析柱装柱注意正确操作，使柱体均匀、柱面平整，无气 泡、裂隙。 4.上样和洗脱时应做到“前切”和“后切”。“前切”指柱 顶缓冲液与凝胶平面相切时再加样品；“后切”指样品走至 与凝胶平面相切时再加入洗脱缓冲液。
常用于标记的荧光素： 异硫氰酸荧光黄（FITC） ） 四乙基罗丹明（RB200） ）
（2）标记抗体的纯化
①透析法 ②层析分离法
（3）荧光抗体的鉴定
F/P比率： F/P 将制备的荧光抗体稀释至A280≈1.0 A ≈1.0，分 别测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记 A 荧光素的特异吸收峰。
F/P值 F/P
实验步骤
收集：当黄绿色荧光出现在洗脱液时，用试管收集全 部黄绿色荧光溶液。 黄色荧光溶液洗脱较慢，用蒸馏水洗脱约15分钟，直 至黄色荧光消失，停止洗脱后，将柱内凝胶回收入凝 胶瓶内。
实验步骤
将试管内收集的溶液混匀，作10倍稀释 （0.8ml+7.2ml PB）后在紫外分光光度计分别测 OD495nm和OD280nm值。 计算F/P值，并对该比值作一简单分析。
用Sephadex G-50装25cm层析柱，凝胶沉积约18cm （离管口7 cm，避免凝胶柱干掉），用pH7.0， 0.005M 磷酸缓冲液（PB）平衡洗脱约10分钟，流速 控制为1ml/分钟。 吸取上述标记液上凝胶柱，注意不可使柱面干掉。 用pH7.0，0.005M PB洗脱，流速控制为1ml/分钟。 可看到黄色与黄绿色荧光在凝胶柱分开。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
荧光素FITC标记抗体的方法
当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下
FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质
常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1．Marsshall法
(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光
素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或
3．0的0．01mol／LPBS等。
(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为
20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。
f．PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。
③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，
继续避光搅拌12h左右。
结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500r／
min)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8．0缓冲盐水透析(0～4~C)过夜。
⑤过柱取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。
洗脱液：0．01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．2)；过滤量：12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析)；收集量：20ml(稀释1．7倍左右)。
2．Chadwick法
(1)试剂和材料抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯（25ml）搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）透析袋等。
(2)方法及步骤①抗体准备用o～4~C的pH8。
0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg／ml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中。
②荧光色素准备按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0．01rug计算，称取所需的荧光素，用3％碳酸钠水溶液溶解。
③将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在o～4~C 冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上持续搅拌)18～24h。
④透析和柱层析方法同Marsshall法。
3．改良法
(1)试剂和材料①0．01mol／L(pH7．2)PBS配法中，校定pH 至7．2。
NaCi 18g、Na2HP04 1．15g，溶于2000ml蒸馏水
②0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液配法取0．5mol／LNazCOs(5．3％)10ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合后，校定pH至9．0。
③3％碳酸钠水溶液配法称L 5g无水碳酸钠充分溶解于50ml
灭菌蒸馏水中即成。
④其他试剂和材料l％叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。
(2)方法及步骤①取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(0．15mol／LNaCl)及缓冲液(0．5mol／
LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀释使每毫升内含蛋白质lOmg，缓冲液为总量的10％，降温至4℃。
②加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白：荧光素＝
(50—80)mg‘lmg]，在0～4℃
下电磁搅拌12～14h。
③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。
④将制备好的荧光抗体加叠氮化钠o．01％，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，一20~C保存可达2
年以上。
4．透析标记法
此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。
(1)试剂和材料试剂和材料同改良法。
(2)方法及步骤①用0．025mol／L碳酸盐缓冲液pH9．0，将欲标记免疫球蛋白稀释成1％浓度，装入透析袋中。
②用同一缓冲液将FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。
③容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4~C电磁搅拌下透析标记24h。
取出透析袋中标记液，即刻用SephadexG50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于4℃中。
FITC
CAS#：3326-32-7
中文名：异硫氰酸荧光素
英文名：Flourescein iso-thiocyanate；FITC
结构式：
分子式：C21H11NO5S
分子量：389.38
性质：
1. 外观：黄色粉末
2. 纯度：≥95% (HPLC)
3. 产品描述：
FITC能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。
通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。
用于医学，农学和畜牧等方面，可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。
4. FITC标记抗体流程：
（1）将待交联的蛋白（浓度≥1mg/mL）对交联反应液透析三次4 ℃，至pH＝9.0。
交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。
（2）将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL。
每次交联使用的FI TC均应新鲜配制，避光。
（3）按P:F（蛋白质:FITC）=1mg:150μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 ℃反应8 h。
（4）加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L，4 ℃终止反应2 h。
（5）将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
（6）交联物的鉴定
蛋白浓度(mg/mL) = [ A280–0.31×A495] / 1.4
F/P比例: 3.1×A495/ [A280–0.31×A495]，该值应介于2.5 ~ 6.5之间。
（7）FITC交联的蛋白应置于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃避光保存。
储存条件：4℃避光保存。