高效液相色谱柱柱效测定
九高效液相色谱仪的性能检查和色谱参数的测定
线性范围
检查自动进样器在不同进 样量下的线性响应范围， 以确保其适用于不同浓度 的样品分析。
检测器性能检查
噪声与漂移
评估检测器的基线噪声和漂移，以确保其稳定性和灵 敏度。
线性范围与响应因子
检查检测器在不同浓度下的线性响应范围和响应因子， 以确保其准确性和可靠性。
检测限与定量限
确定检测器的检测限和定量限，以评估其对于低浓度 样品的检测能力。
九高效液相色谱仪的性能检查和色 谱参数的测定
目录
• 性能检查 • 色谱参数测定 • 方法开发与验证 • 仪器维护与故障排除 • 数据处理与结果分析 • 法规要求与实验室管理实践
01 性能检查
泵系统性能检查
01
02
03
流量准确性
通过测量实际流量与设定 流量的偏差来评估泵系统 的准确性。
流量精密度
03 方法开发与验证
方法开发流程梳理
明确分析目标
确定需要分析的样品类型、目标化合物以 及分析要求。
确定洗脱程序
通过优化洗脱程序，包括梯度洗脱和等度 洗脱，使目标化合物在合适的时间内出峰，
并获得良好的峰形和分离度。
选择色谱柱和流动相
根据目标化合物的性质选择合适的色谱柱 和流动相，确保目标化合物能够得到有效 的分离和检测。
峰识别、定量计算及结果解读方法分享
峰识别
根据色谱峰的保留时间、峰形等特征，识别出样品中的各 组分，并与标准品进行比对验证。
定量计算
通过比较样品峰与标准品峰的峰面积或峰高，使用内标法、 外标法等定量方法，计算出样品中各组分的含量。
结果解读
根据定量计算结果，结合样品信息和相关标准，对检测结果进行解读和评估， 判断样品是否符合要求。同时，对异常结果进行原因分析，并提出相应的改进 建议。
GE中低压层析柱-柱效测定方法-详解
GE中低压层析柱柱效测定方法柱效测定是一项经常使用的操作，对于定量表征层析柱的工作状态是否良好，工艺的验证具有重要的意义。
但是实际工作中很多朋友都遇到不会测柱效或者测出来注销过低的状况，不知道如何解决。
所以今天我就给大家详细介绍一下柱效的正确测定方法，以及经常遇到的问题如何解决。
本方法适用于所有GE公司中低压液相色谱的预装柱及自己填装的层析柱。
介绍分为5个部分，测前准备、试剂选择、测柱效操作、测试结果积分、经常发生的问题。
1. 测前准备：⑴ÄKTA层析设备。
要求设备的型号与层析柱大小匹配，从上样阀门到紫外和电导检测器之间的体积要做到最小（管路内径尽量细，管路尽量短），这对于准确测量实验室小层析柱的柱效非常重要。
⑵测试平衡溶液及样品。
这个部分在试剂选择中单独细说。
⑶装填好的层析柱。
使用平衡缓冲液在测柱效的流速下至少平衡1.5 CV（柱体积），平衡方向与测柱效方向必须一致⑷样品环。
容积大于1%柱体积。
2. 试剂选择测柱效主要有两种测试系统：1 NaCl 测试系统；2 丙酮测试系统。
只要操作正确，两个系统测出来的结果是基本一致的。
但是要注意：各试剂的浓度不能随意改变，否则影响测试结果。
⑴NaCl测试系统对于所有种类的柱子和填料，都可以使用氯化钠系统测柱效平衡液： 0.4 M NaCl水溶液样品： 0.8 M NaCl水溶液3. 测柱效操作测柱效全程使用30 cm/h线性流速。
平衡层析柱至少1.5 CV，将1% CV的样品（NaCl或丙酮）注射进入层析柱，使用平衡液冲洗直至电导或紫外280nm出现响应峰。
4. 测试结果积分以UNICORN6版本为例演示给大家看如何操作（各UNICORN版本操作基本一致）。
以NaCl系统测柱效的所有操作针对电导曲线，以丙酮系统测柱效的所有操作针对UV 280曲线（手头没有测柱效结果，所以随便找了一个图，里面有两个峰。
大家测柱效的结果只有一个峰）1) 在Evaluation窗口中打开测柱效结果文件，在Curve窗格中点击右键，选择Customize2) 勾选复选框去掉不需要显示的曲线3)在工具栏中点击峰积分按钮，进行积分处理或者在Integrate下拉菜单中点击Peak Intergrate进行积分处理4) 选择需要积分的曲线以及积分表存储位置，基线类型默认为Calculatebaseline5) 在积分窗口中点击Peak Window，出现以下窗口，通过拖动左右两条直线可以选择需要进行积分的范围，点击OK确认6) 在积分窗口点击Reject Peaks对需要分析的色谱峰可进行高级定义，包括最小峰高、峰宽、峰面积、峰个数等，在这里最常用的是在Peakarea is less than输入需要显示的最大峰的个数，点击OK确定7) 在Column height (bed height)一栏中输入柱床高度，在柱效测定中此项必须填写8) 点击积分窗口中Save and Edit Peak Table按钮，可以对峰进行高级操作9) 点击积分窗口中的OK，查看积分结果10) 在Peak data区域点击右键，选择Customize 在Select peak table columns对话框中找到需要显示的数据， plate height（HETP）、Asymmetry 等，点击OK执行。
高效液相色谱法
（2）化学键合固定相 ） B. 极性键合相 极性键合相指键合有机分子 中含某些极性基团，与空白硅胶相比， 中含某些极性基团，与空白硅胶相比，其极性 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 常用的极性键合相有氨基、氰基等。 常用的极性键合相有氨基、氰基等。氨基键合 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈-水 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈 水
二、液相色谱的流动相
1. 流动相特性
（mobile phases of LC） ）
（2）化学键合固定相 ）
化学键合固定相是应用最广的色谱法。 化学键合固定相是应用最广的色谱法。将固定液的官能团键
合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 一般认为有分配与吸附两种功能。 一般认为有分配与吸附两种功能。 a. 硅氧碳键型： 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 硅氧硅碳键型： 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂， c. 硅碳键型： 硅碳键型： d. 硅氮键型： 硅氮键型： ≡Si—C ≡Si—N
4.6
高效液相色谱法
高效液相色谱法(high pressure Liquid 高效液相色谱法 chromatography，HPLC)是利用物质在两 ， 是利用物质在两 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 当两相作相对移动时， 当两相作相对移动时，被测物质在两相之间做 反复多次的分配， 反复多次的分配，这样使原来微小的差异产生 了很大的分离效果，达到分离、 了很大的分离效果，达到分离、分析和测定一 些理化常数的目的。 些理化常数的目的。
hplc柱效计算公式
hplc柱效计算公式
高效液相色谱（HPLC）柱效应是一种现象，它指的是分
子在柱上的分离过程中出现的浓度不均匀性。
它也称为柱压力或柱负荷，是指在一段时间内，分子浓度在柱内从输入端到输出端的变化。
这种不均匀的性质可能会影响HPLC柱的分离
性能，因此计算柱效应是必不可少的。
HPLC柱效应的计算公式为：N（t）= N0 * e^-k*t，其中
N（t）是时间t时，HPLC柱中溶质浓度，N0表示柱入口处溶质浓度，k为柱效应常数，与柱的长度、内径、温度和柱内表
面积有关。
通过计算柱效应，可以更好地了解柱效应的影响情况，和柱内溶质浓度的变化，从而提高HPLC柱的分离效率。
此外，柱效应的计算也可以帮助调整柱的温度和流速，以便更好地控制HPLC柱的分离性能。
此外，HPLC柱效应的计算还可以帮助确定各种溶质的柱
反应时间，从而帮助用户在柱上进行分离操作。
由于柱效应的计算可以帮助HPLC柱的有效利用，因此柱效应的计算是HPLC柱使用过程中必不可少的一部分。
总之，HPLC柱效应计算公式是：N（t）= N0 * e^-k*t，
它是用来衡量柱内溶质浓度变化的一种方法，可以帮助用户更好地控制HPLC柱的分离性能，从而提高分离效率。
此外，
柱效应的计算也可以帮助用户确定溶质的柱反应时间，从而获得更好的分离结果。
高效液相色谱柱
高效液相色谱柱高效液相色谱柱是一种在分析化学领域中广泛使用的技术。
它的原理是通过溶液在色谱柱中的流动过程中，对溶质进行分离和纯化。
高效液相色谱柱的优点是分析速度快、分离效果好、操作简便等。
本文将介绍高效液相色谱柱的原理、种类、应用以及未来的发展趋势等内容。
高效液相色谱柱的原理主要包括固定相和移动相两个基本要素。
固定相负责分离溶质，常用的固定相有疏水相、离子相、亲合相等。
移动相则是将溶质带动在柱子中流动的溶剂，通常是有机溶剂和水的混合物。
这样，在溶液在色谱柱中流动过程中，不同溶质会在固定相的作用下发生分离，从而实现对混合物的分析和纯化。
高效液相色谱柱根据固定相的不同可以分为几种不同的类型。
例如，疏水相色谱柱广泛应用于有机物的分离和分析，它的固定相表面通常具有疏水性，可以对有机物进行选择性的吸附和分离。
离子相色谱柱则适用于进行离子化合物的分离和分析，例如酸和碱等。
亲合相色谱柱主要是基于生物大分子与其他化合物之间的生物亲和性进行分析。
高效液相色谱柱在实际应用中有着广泛的用途。
在生命科学研究领域，高效液相色谱柱可以用于对蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在药物分析领域，高效液相色谱柱经常被用于药物的纯化和质量控制。
在环境监测方面，高效液相色谱柱可以用于对环境污染物的检测和分析。
此外，高效液相色谱柱还被广泛应用于食品安全、农药残留检测、天然产物分析等领域。
随着科学技术的不断进步，高效液相色谱柱也在不断发展和完善。
目前，研究人员正在努力提高高效液相色谱柱的分离效率和分离速度，使其更加适用于复杂物质的分离和分析。
同时，也在研发新的固定相和移动相，以满足不同类型化合物的分析需求。
此外，一些新的检测技术和装置也被引入到高效液相色谱柱中，提高对溶质的灵敏度和准确性。
总之，高效液相色谱柱是一种重要的分析技术，具有广泛的应用前景和发展空间。
它在生命科学、药物分析、环境监测等领域都有着重要的作用。
随着科学技术的不断进步，相信高效液相色谱柱在未来会发展出更多的新技术和新应用，为我们的科研和生产提供更多的支持和帮助。
电化学实验
苯、萘、联苯的高效液相色谱分析及柱效能的测定一、目的要求1．学习高效液相色谱保留值定性、外标法定量分析方法。
2．了解高效液相色谱仪基本结构和工作原理，以及初步掌握其操作技能3．学习柱效能的测定方法二、实验原理高效液相色谱的定性和定量分析，与气相色谱分析相似，在定性分析中，采用保留值定性，或与其它定性能力强的仪器分析法（如质谱法、红外吸收光谱法等）联用。
在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等。
气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式，同样适用于高效液相色谱：速率理论及范弟姆特方程式对于研究影响高效液相色谱柱效的各种因素，同样具有指导意义：由于组分在液体中的扩散系数很小，纵向扩散项（B/u）对色谱扩展的影响可以忽略不计，而传质阻力项（Cu）则成为影响柱效的主要因素，提高柱内填料装填的均匀性和减小粒度，以加快传质速率，可提高液相色谱的柱效能。
目前常使用的固定相直径为5~10mμ。
液相色谱除了上述影响柱效的一些因素外，还应考虑到一些柱外展宽的因素。
三、实验用品1．仪器高效液相色谱（任一型号）紫外光度检测器恒流泵或恒压泵溶剂过滤系统高压六通进样阀微量进样器（100μL）超声波发生器2．药品苯、萘、联苯、甲醇（均为A.R）纯水（去离子水，再经一次蒸馏）标准贮备液分别配制浓度为1000μg · mL－1的苯、萘、联苯的甲醇溶液。
标准工作液将上述标准贮备液用甲醇稀释10倍，配成苯、萘、联苯的浓度分别为100μg · mL－1的甲醇溶液。
混合样品苯、萘、联苯四、操作步骤1．测定条件的选择（1）色谱柱长250 mm，内径 4.6 mm，装填C-18 烷基键合相，颗粒度10μm的固定相（2）流动相甲醇:水（83:17），流量1.0 mL· min－1（3）紫外光度检测器测定波长254 nm（4）进样量20μL2．仪器操作（1）将配置好的流动相于超声波发生器上，脱气15 min。
高效液相色谱实验
高效液相色谱实验The document was prepared on January 2, 2021高效液相色谱实验I. 色谱柱的评价请在实验前预习基础分析化学实验第二版137－140页.目的(1)了解高效液相色谱仪的工作原理；(2)学习评价液相色谱反相柱的方法.原理高效液相色谱是色谱法的一个重要分支.它采用高压输液泵和小颗粒的填料,与经典的液相色谱相比,具有很高的柱效和分离能力.色谱柱是色谱仪的心脏,也是需要经常更换和选用的部件,因此,评价色谱柱是十分重要的.而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常.评价色谱柱的性能参数主要有：（1） 柱效理论塔板数n式中t r 为测试物的保留时间,W 1/2为色谱峰的半峰宽.（2） 容量因子k’式中t 0为死时间,通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间.(3)相对保留值选择因子α式中k 1’和k 2’分别为相邻两峰的容量因子,而且规定峰1的保留时间小于峰2的.(4)分离度R s式中t r1、t r2分别为相邻两峰的保留时间,W b1、W b2分别为两峰的底宽.对于高斯峰来讲,W b =2.为达到好的分离,我们希望n 、α和R s 值尽可能大.一般的分离如α=,R s =,需n 达到2000.柱压一般为104 kPa 或更小一些.本实验采用多核芳烃作测试物,尿嘧啶为死时间标记物,评价反相色谱柱.仪器和试剂Waters 510高效液相色谱仪由Waters 510高压输液泵,Rheodyne 7725i 进样器,440检测器和记录仪组成色谱柱：5 cm × mm ., YWG-C 18H 37 ODS,10 μm流动相：甲醇－水80+20样品I ： 含尿嘧啶 mg ·mL －1、萘 mg ·mL －1、联苯 mg ·mL －1、菲 mg ·mL －1的甲醇混合溶液；样品I I ：尿嘧啶的甲醇溶液；萘的甲醇溶液；联苯的甲醇溶液；菲的甲醇溶液.溶液浓度约为·mL －1；实验内容（1） 准备流动相.将色谱纯甲醇和色谱纯水按比例配制200mL 溶液,混合均匀并经超声波脱气后加入到仪器储液瓶中.（2） 检查电路连接和液路连接正确以后,接通高压泵、检测器和记录仪的电源.设定操作条件为：流速 mL ·min －1,压力上限2′104 kPa 约3000 psi,检22/1r )/(54.5W t n =00r /)('t t t k -=12'/'αk k ＝)/()(2b2b1r1r2s W W t t R +-=测波长254 nm 该仪器检测波长已固定,灵敏度 AUFS,记录仪走纸速度 cm ·min －1,记录灵敏度为5 mV.开启记录仪走纸开关记录基线.并调节基线到合适位置一般为距右10%处.（3） 待基线平稳后建议观察检测器的读数显示,将进样阀手柄拨到“Load ”的位置,使用专用的液相色谱微量注射器取5μL 样品注入色谱仪进样口,然后将手柄拨到“Inject ”位置,同时按一下检测器的标记按钮,同时计时,记录色谱图.（4） 重复3的实验两次.（5） 用同样方法进纯样品的甲醇溶液,确定出峰顺序.（6） 根据三次实验所得结果计算色谱峰的保留时间、半峰宽,然后计算色谱柱参数n 、k’,以及相邻两峰的α、R s（7） 将流速降为0,待压力降为0后关机.思考题1. 高效液相色谱与气相色谱相比有什么相同点和不同点2. 如何保护色谱柱延长使用寿命高效液相色谱实验II固相萃取水样中的多核芳烃并以内标法测定其含量目的（1） 学习固相萃取法处理样品；（2） 用内标法定量.原理固相萃取法是色谱法的一个重要的应用.在此方法中,使一定体积的样品溶液通过装有固体吸附剂的小柱,样品中与吸附剂有强作用的组分被完全吸附；然后,用强洗脱溶剂将被吸附的组分洗脱出来,定容成小体积被测样品溶液.使用固相萃取法,可以使样品中的组分得到浓缩,同时可初步除去对感兴趣组分有干扰的成分,从而提高了分析的灵敏度.固相萃取不仅可用于色谱分析中的样品预处理,而且可用于红外光谱、质谱、核磁共振、紫外和原子吸收等各种分析方法的样品预处理.C18固相萃取小柱具有疏水作用,对非极性的组分有吸附作用,因此可以从水中将多核芳烃萃取出来,完成浓缩样品的作用.固相萃取小柱还有其他类型,如极性、离子交换等.内标法的原理是,设在V mL 样品中含有W i g 待测组分i,加入W S g 内标物S,混匀后进样,得组分i 及内标物S 的峰面积分别为A i 及A S .由于峰面积正比于通过检测器的物质量,所以有：W i =f i A iW S =f S A S式中f i 、f S 分别为组分i 和内标S 的校正因子.两式相除,得所以,组分i 的体积浓度为：S Si S i i W A A f f W ⋅⋅=V W A A f V W A A f f VW SS i i S S i S i i '⋅⋅=⋅⋅=fi’可用已知被测物i和内标物浓度的样品进样分析得到.内标法是一种相对测量方法,因此,进样量不必准确,操作条件稍有变化对结果没有什么影响.仪器和试剂Waters 510高效液相色谱仪由Waters 510高压输液泵,Rheodyne 7725i进样器和440检测器组成色谱柱：5 cm× mm ., YWG-C18H37ODS,10 μm流动相：甲醇－水80+20 流速： mL·min－1检测波长：254 nmC18固相萃取小柱：2支25 mL移液管：1支50 mL医用注射器：1支10 mL医用注射器：2支2 mL容量瓶：2个样品I：内标标准样,含萘 mg·mL－1、联苯 mg·mL－1、菲 mg·mL－1的甲醇溶液.样品II：内标物溶液.含联苯 mg·mL－1的甲醇溶液.样品III：含萘、菲的被测水样.实验内容（1）固相萃取小柱预处理：用10 mL注射器将2 mL甲醇压过小柱,再将2 mL 纯水压过小柱.（2）用移液管取25 mL水样,用50 mL注射器压过小柱,这时水样中的萘和菲被吸附在小柱上.在小柱下端承接一2 mL的容量瓶,将约 mL甲醇用10 mL 注射器压过小柱到容量瓶中,加入一定量内标联苯溶液,定容摇匀,得到浓缩的样品.（3）按“实验I”中的步骤,进样分析内标标准样和浓缩样品各三次.（4）取平均结果,计算峰面积A s和A i；根据内标标准样的浓度计算f i’,再计算出浓缩样品中的萘和菲的浓度,进而计算出原水样中的浓度mg·mL－1.思考题1.内标法与外标法各有哪些特点本实验为什么采用内标法为好2.为什么要对色谱分析中的样品进行预处理简单列出三个以上的原因.。
高效液相色谱柱效能的测定
应用最广，对大部分有机化合物有响应。
特点： 灵敏度高； 10-9g·mL-1 线性范围宽； 对流动相的流速和温度 变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
高效液相色谱柱效能的测定
一、实验目的： 1.学习高效液相色谱柱效能的测定方法。 2.了解高效液相色谱仪的基本结构及工作原理。 3.初步掌握高效液相色谱仪的操作及使用。
应的流动相并过滤脱气。 二、开 机 1.依次打开2130高压泵、检测器和计算机电源开关，
设定合适的检测波长。 2.双击桌面上的T2000P色谱工作站图标，进入工作站
系统。
三、编辑HPLC分析方法 1.双击“方法”图标，编辑HPLC分析方法。 2. 保存所编辑的HPLC分析方法。 四、样品分析与采集数据 1.在文件栏中选择分析方法文件。 2.手动进样: 在方法栏中依提示输入文件名称、样品
己烷（分析纯）、甲醇（色谱纯）、水为二次蒸馏 水
四、实验条件：
1.检测器：紫外光度检测器，测试波长254nm 2.流动相：甲醇：水(83：17)，流量0.8 ml/min 3.色谱柱：长250mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合
相(粒度5μm) 4.进样量：20 μL
五、实验步骤：
1. 根据实验条件，将仪器调至可进样状态，待基线平 稳后，即可进样。 2. 吸取标准使用液（含甲苯、萘、联苯各10ug/ml的 正己烷溶液）20μL，注入高效液相色谱仪。 3. 记录下色谱图。 4. 从色谱图中测得甲苯、萘、联苯的保留时间tR，半 峰宽Y1/2，计算对应的理论塔板数n及分离度R。
2、主要部件
（1）、进样装置
使用高压定量进样阀(六通阀)进样装进样体积 由定量管控制，进样准确，重现性好，适于定量 分析。
高效液相色谱实验技术问题解答
高效液相色谱实验技术问题解答高效液相色谱以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测。
1、高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的? 解：气相色谱理论和技术上的成就为液相色谱的发展创造条件，从它的高效、高速和高灵敏渡得到启发，采用5一10四微粒出定相以提高柱效，采用高压泵加快液体流动相的流速;设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器，提高检测灵敏度，克服经典液相色谱曲缺点，从而达到高效、快速、灵敏。
2、与气相色谱法相比高效液相色谱有哪些优点和不足? 解：气相色谱的分析对象是在校温下具有一定的挥发性、对热稳定购物质。
因此它只限于分析气体和沸点低的化合物或挥发性的衍生物。
而高效液相色谱由于以液体作为流动相，只要被分析的物质在选用的流动相中有一定的按解度，便可以分析，所以适用性广，不受样品挥发性和热稳定性的限制，特别适合于那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合物，例如，生化物质和药物、离子型化合物、热稳定性差的天然产物等。
在目前已知的有机化台物中，只有20%样品可不经化学处理而能满意地用气相色谱分离，80%的有机化合物要用高效液相色谱分析。
气相色谱中流动相是惰性的，它对组分没有作用力，仅起运载作用、而高效液相色谱的流动相不仅起运载作用，而且流动相对组分有一定亲合力，可以通过改变流动相种类和组成提高分离的选择性，另外可作流动相的化合物多，选择余地广。
与气相色谱相比，高效液相色谱的另一个优点是样品的回收比较容易，只要开口容器放在柱子末端，就可以很容易地将所分离的各组分收集。
回收是定量的，可以用来提纯和制备具有足够纯度的单一物质。
高效液相色谱不足的是，日前检测器的灵敏度不及气相色谱。
必须特别注意“柱外效应”对柱效率及色谱分离的影响。
3、试比较气相色谱与液相色谱的H-u曲线，分析产生不同的原因。
解：从图可看出，气相色谱和液相色谱得到的H-u曲线，形状迥然不同，流动相的流速对柱效的影响也不一样，在气相色谱的H-u曲线上，塔板高度H随u变化呈双曲线.曲线有一最低点，这时柱效最高，板高最小，流速最佳。
高效液相色谱结果分析
测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收 试验法”和“加样回收试验法”。
(1)回收试验 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定， 测定值为 M
回收率
M - 空白
R=
X 100%
A
(2)加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已 知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M
回收率 R = M - P X 100% A
数据要求 在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如 高、中、低三个不同浓度样品各测三次.
4.精密度(precision)
（通常采用峰面积A）成比例(正比). 标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度. 标准曲线线性一般采用5-9点，并非点越多越好!
3.准确度(accuracy)
准确度 指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近 的程度，用百分回收率表示。
相对回收率 直接反映测定结果与真实值的接近程度,应 控制在100%左右(95%～105%)。
Unacceptable t=2
Awful t=4
正常
前伸
三.液相色谱图名词术语(7)
基线(Baseline): 在正常操作条件下,仅由流动相所产生 的响应信号.
基线噪声(Baseline Noise): 由各种因素所引起的基线波 动.
基线飘移(Baseline Drift): 基线随时间定向的缓慢变化.
分析方法重现性的测定是通过在不同的实验室内不同 的实验者对同一样品的分别测试而获得的。(获得的这 种再与正常检定下的精密度进行比较,从而确定该法的 耐用性,或称粗放度).
高效液相色谱(HPLC)柱效测定
实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定093858 张亚辉一. 实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。
2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。
3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。
二. 实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。
在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。
反之，则称为正相色谱分离系统。
反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
分离度（R）的计算公式为：R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(W1＋W2)式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的半峰宽。
除另外有规定外，分离度应大于1.5。
本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。
它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。
但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。
待测物性质见表1。
表1色谱柱测试条件如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂1、仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。
2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水四. 实验步骤1、色谱条件色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）柱温：室温流动相：初始为高纯水：20％，甲醇：80％检测器：DAD检测器;检测波长：220nm；进样体积：20µl定量环，实际注射每次可控制在40µl。
高效液相色谱柱柱效测定
高效液相色谱柱柱效测定高效液相色谱柱柱效测定及分离条件考察一、实验目的1(了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理2(学习高效液相色谱仪的使用3(学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法4(考察流动相配比对分离情况的影响二、基本原理高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它亦是根据不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的差异来对混合物进行分离的。
气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式同样适合于高效液相色谱，即:22,,tt,,RR,,n,5.54,16 ,,,,YY,,,1/2,式中:t为组分的保留时间 RY为色谱峰的半峰宽度 1/2Y为色谱峰的峰底宽度影响高效液相色谱分离的因素很多，其中，流动相的种类及配比是最重要的参数。
三、仪器和试剂1(仪器:Agilent 1200 高效液相色谱仪(紫外检测器)(50μL微量进样器 23(试剂:苯、萘、联苯、甲醇均为分析纯;纯水为重蒸的去离子水。
配制成含苯、萘、联苯各30μL/ml 的甲醇溶液。
四、实验条件1(色谱柱长15cm，内径 4.6mm，装填5,m的C-18烷基键合固定相2(流动相组成1:甲醇:水(95:5);组成2:甲醇:水(85:15);流量均为0.8ml/min 3(紫外光度检测器波长254nm4(进样量5μL五、实验步骤1(设定流动相为“组成1”的比例，按照标准操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器流路及电路系统达到平衡，且色谱基线达到平直时，开始进样。
2(吸取5μL苯、萘、联苯的甲醇溶液进样，在此条件下用色谱工作站记录色谱数据。
3(改变流动相比例至“组成2”，待平衡后重复步骤2操作。
4(用色谱工作站之“数据处理”系统处理数据文件并记录所需数据。
六、数据记录及处理(记录实验条件。
1(1)色谱柱与固定相(2)流动相及其流量、柱前压(3)检测器波长(4)进样量2(分别记录三个组分色谱峰的保留时间t和相应色谱峰的半峰宽Y。
R1/23(分别计算苯、萘、联苯在两种流动相组成条件下的理论塔板数n，并比较流动相组成改变前后色谱分离的差异。
苯甲酸红外吸收光谱 高效液相色谱 库伦滴定法 利用紫外吸收光谱 气相色谱填充柱的柱效 重铬酸甲滴定
用重铬酸钾电位滴定硫酸亚铁溶液一、实验目的1.学习电位滴定的基本原理和操作2.熟悉酸度计的使用方法二、实验原理电位滴定法定义: 是根据滴定过程中指示电极电位的突跃来确定滴定终点的一种滴定分析方法。
与直接电位法的区别：定量参数不同；与化学滴定法的区别：确定滴定终点方法不同。
重铬酸钾法电位滴定硫酸亚铁铵溶液中亚铁离子含量测定原理:用K2Cr2O7滴定Fe2+,其反应式如下Cr2O72- + 6 Fe2+ + 14H+ =2Cr2+ + 6 Fe3+ +7H2O利用铂电极作指示电极,饱和甘汞电极作参比电极,与被测溶液组成工作电池。
在滴定过程中,随着滴定剂的加入,铂电极的电极电位发生变化。
在化学计量点附近铂电极的电极电位产生突跃,从而确定滴定终点。
实验装置如右图三、仪器与试剂酸度计移液管（10ml）磁力搅拌器铂电极量筒（10ml）饱和甘汞电极酸式滴定管 0.010mol/L K2Cr2O7标准溶液硫酸亚铁铵溶液二苯胺四、实验内容和步骤用移液管准确移取10ml 0.1mol/L硫酸亚铁铵溶液于烧杯中，加入1.5mol/LH2SO4溶液20ml，加水至约50ml，将饱和甘汞电极和铂电极插入溶液中，放入转子，开动搅拌器，然后用K2Cr2O7标准溶液滴定，待到达滴定终点时仪器停止工作，记录仪器最终现实的数据，重复操作两次，计算硫酸亚铁铵溶液的准确浓度。
五、数据记录和结果分析电位滴定数据记录表V/ml 9.952 9.991 9.936E/mV 682.7 659.1 668.5c/1⋅0.016637 0.016704 0.016610Lmol-取平均值c=0.0166501L⋅mol-六、思考题1.为什么氧化还原滴定可以用铂电极作指示电极？答：在氧化还原滴定中，Fe 2+ 在阳极发生氧化反应，失去电子，电子通过电极和导线传递到阴极，Cr 2O 72-在正极得到电子被还原，发生还原反应，所以产生了电流。
在这个过程中铂电极并不参与任何化学反应。
高效液相色谱法 中国药品检验标准操作规范 2010年版
高效液相色谱法高效液相色谱法（《中国药典》2010年版二部附录V D）系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期鉴定并符合有关规定。
1.1 色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。
孔径在15nm（1nm=10Å）以下的填料适于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
除另有规定外，分析柱的填充剂一般在3~10μm之间。
粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。
使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。
以硅胶为载体的键合固定相的使用温度不超过40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60℃。
流动相的pH指应控制在2~8之间。
当pH指大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH指小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。
高效液相色谱法(HPLC)的概述
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC主要内容包括：1.高效液相色谱法（HPLC）的概述2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼）3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类4. 液相色谱的适用性5.应用高效液相色谱法（HPLC）的概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。
由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用X围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）为最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
系统组成：（一）高压输液系统由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。
1.贮液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。
贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。
层析柱柱效测定steptest方法
层析柱柱效测定steptest方法层析柱柱效测定（step test）是一种常用的分析方法，它可以用来测定样品中各种成分的含量和纯度。
该方法通过将样品通过层析柱，利用不同成分在柱中的迁移速率不同的特性，进行分离和检测。
本文将详细介绍层析柱柱效测定的原理、步骤和应用，并结合实例进行说明。
一、原理层析柱柱效测定是利用不同成分在固定相和移动相之间的分配系数不同，来进行成分分禶的一种分离和检测方法。
在层析柱柱效测定过程中，首先将待测物样品通过固定相柱，然后通过外加的移动相进行洗脱，不同成分在移动相中的迁移速率不同，从而实现各成分之间的分离。
最终，利用检测器对不同成分进行检测和测定。
二、步骤1.样品准备：样品需要经过适当的处理和前处理，以满足后续层析柱柱效测定的要求。
常见的前处理包括提取、净化、稀释等。
2.柱效条件的选择：根据待测成分的特性和柱效测定的需求，选择合适的柱效条件，包括柱效柱、固定相、移动相、流速等。
3.样品进样：将前处理好的样品通过进样器送入柱效柱，通常使用高效液相色谱仪（HPLC）实现。
4.洗脱条件的设置：通过外加的移动相进行洗脱，使样品中的不同成分在柱中进行分离。
5.检测器检测：通过检测器对柱效柱流出的物质进行检测和测定，获取不同成分的含量和纯度信息。
6.数据处理和分析：对检测到的数据进行处理和分析，得到分析结果。
三、应用层析柱柱效测定在药物分析、环境监测、食品安全等领域得到了广泛的应用。
以药物分析为例，层析柱柱效测定可以用于药物的纯度检测、含量测定、残留量检测等。
在环境监测方面，可以用于水质、大气、土壤中各种污染物的检测和分离。
在食品安全领域，可以用于食品中添加剂、农药残留、重金属含量等的检测和测定。
四、实例分析以药物分析为例，某种药物制剂中含有多种成分，需要进行含量测定。
首先将药物样品经过适当的前处理后，通过HPLC装置进行层析柱柱效测定。
选择合适的柱效条件，进行样品进样、洗脱和检测。
高效液相色谱仪的测定原理
一． 实验目的：
1． 学习高效液相色谱法的测定原理；
2． 了解并掌握高效液相色谱仪（HP1100） 的基本构造。
二． 实验原理：
高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典 液相色谱法和气相色谱的基础上发展起来的，（经 典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、 长玻璃管柱内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质 在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入口压力 低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类 似，流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的 有机化合物，配合程序升温可分析高沸点的有机化 合物。）弥补了经典液相色谱法和气相色谱的缺点。
（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类
等）。
反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、
C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、
异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以
调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化
合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统
计，它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应 用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样
品或易解离样品的分析。为控制样品在分
析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的 pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的 pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值 会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷 基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范定相极性 流动相极性 组分洗脱次序
5． 检测器：常用的有紫外检测器 （VWD），光电二极管矩阵检测器（DAD）折光指 数检测器（RID），电导检测器（ECD），荧光检测 器（FD）。
折光指数检测器（RID），电导检测器 （ECD）分别测定柱后流出液的总体折射率和电 导率，测定灵敏度低，易受流量和温度的影响，造 成较大的漂移和噪声，不适合痕量分析。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
高效液相色谱柱柱效测定
一、实验目的
1．了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理
2．学习高效液相色谱仪的使用
3．学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法
二、基本原理
高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它亦是根据不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的差异来对混合物进行分离的。
气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式同样适合于高效液相色谱，即：
2
22/11654.5⎪⎭⎫ ⎝⎛=⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛=Y t Y t n R R 式中：t R 为组分的保留时间
Y 1/2为色谱峰的半峰宽度
Y 为色谱峰的峰底宽度
三、仪器和试剂
1．仪器1：高效液相色谱仪（紫外检测器）
2．仪器2：高效液相色谱仪（紫外检测器）
3．50μl 微量进样器
4．试剂：苯、萘、联苯、甲醇均为分析纯；纯水为重蒸的去离子水。
配制成含苯、萘、联苯各30μl/ml 的甲醇溶液。
四、实验条件
1．色谱柱1长15cm ，内径 4.6mm ，装填10μm 的C-18烷基键合固定相
2．色谱柱2长15cm ，内径 4.6mm ，装填5μm 的C-18烷基键合固定相
3．流动相 甲醇:水（85:15），流量0.8ml/min
4．紫外光度检测器 波长254nm ，灵敏度0.08
5．进样量 5μl
五、实验步骤
1．根据实验条件和实验录像指导，按KLC321仪器操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器流路及电路系统达到平衡，色谱工作站之“采样系统”基线平直时，即可进样。
2．吸取5μl 苯、萘、联苯的甲醇溶液进样，并用色谱工作站记录色谱数据，同时记录色谱数据文件名。
3．用色谱工作站之“数据处理”系统处理数据文件并记录所需数据。
4. 在仪器上测定色谱柱2的塔板数，打印色谱图并比较色谱柱柱效差异。
六、数据记录及处理
1．记录实验条件。
（1）色谱柱与固定相
（2）流动相及其流量、柱前压
（3）检测器及其灵敏度
（4）进样量
2．记录色谱峰的保留时间t R 和相应色谱峰的半峰宽Y 1/2。
3．分别计算苯、萘、联苯在该色谱柱上的理论塔板数n 和理论塔板高度。
七、思考题
1．由本实验计算出的各组分理论塔板数说明什么问题？
2．紫外光度检测器是否适用于检测所有有机化合物，为什么？
3. 试分析色谱柱1和色谱柱2测定结果的差异及产生的原因。