基因工程-第三章-基因工程的载体

2013-9-23
苏州科技学院生物系
叶亚新
2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。 Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺 环的水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合 成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化 的氯霉素不能结合在核糖体上。
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第一节
E.coli 质粒载体
二、质粒（plasmid）载体的构建 2、质粒人工构建的目的

天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用 作基因工程的载体必须对之进行改造构建：
（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择 （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组 （3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量 （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。
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2. 标记基因的种类
1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r， Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因
2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）
主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶 类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1， URA3，LEU2，HIS4等。
3）生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, CAT
4） 噬菌斑
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3. 使用标记基因注意要点
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第一节
E.coli 质粒载体
一、质粒（plasmid）的一般性质 2、特征

可扩增性

pMB1或ColEI类质粒在蛋白质合成中断时，质 粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白 质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或 ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复 制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝， 这叫做氯霉素扩增。
7）萦光素酶基因
萦光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂萦光素氧化的酶，并产 生萦光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细 菌（Photobacterium fischeri）产生的萦光素酶，它与FMN-氧化 还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
8）发光蛋白质基因
发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使 大肠杆菌菌落呈蓝色。
如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar
et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克
隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不
同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表
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人工构建的质粒根据其功能及用途分为：
1.
2.
3.
4.
5.
6.
多拷贝质粒 经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷 贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。 测序质粒 拷贝数高，加装测定顺序所必需的序列，如多切口接头， 便于各种片段方便克隆 整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确 重组整合入受体细胞的染色体上 穿梭质粒 含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复 制 表达质粒 装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便 任何外源基因在受体细胞内的高效表达 探针质粒 筛选克隆或寻找基因元件，他通常装有一个可以定量测 定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动基因、终止子等。
分子克隆载体的转化频率和稳定性
1. 影响转化频率的因素
1) 复制起点类型：尽可能选择高拷贝复制起点 2) 标记基因：尽可能选择高效表达的标记基因
2. 影响稳定性的因素
1) 复制起点类型—低拷贝载体稳定，高拷贝载体稳定性 差 2) 选择压力 3) 载体在宿主细胞中的状态—自主复制型和整合型 宿主细胞的遗传特性和生理特性
2. 标记基因与拷贝数的关系
若标记基因表达效率高，宿主细胞可能不大量产生标记基 因以满足选择压力要求，因而载体拷贝数会降低。对于不同标记 基因，可采取相应方法提高其拷贝数。 如：对于药物抗性标记基因，可提高药物浓度。 对于营养标记基因，可降低该基因的表达效率或更换其他低 效率的标记基因
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第一节
E.coli 质粒载体
一、质粒（plasmid）的一般性质 1、定义
质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而 自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子 （Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）
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分子克隆载体的复制起点与种类
1. 复制起点的种类
1) 核内复制起点 a. 染色体复制起点—原核生物(环状)和真核生物(线状)染色体 b. 染色体外复制起点 原核与真核生物 i. 质粒—DNA,RNA,线状,环状,单链,双链 ii. 病毒—同上, 细胞内和病毒颗粒内 2) 核外复制起点 两种质体中亦可能含有质粒 a. 线粒体—所有真核细胞 b. 叶绿体—所有绿色植物细胞
苏州科技学院生物系叶亚新 Nhomakorabea 第一节
E.coli 质粒载体
一、质粒（plasmid）的一般性质 2、特征

自主复制性

质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控 制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染 色体DNA而自主复制
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第一节
E.coli 质粒载体
β—半乳糖苷酶基因的优点:
a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
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6）葡萄糖苷酸酶基因（GUS）
该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水 解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十 分广泛，因为许多生物中没有这种基因。
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第一节
2、特征

E.coli 质粒载体
一、质粒（plasmid）的一般性质
携带遗传标记

在实验室中将质粒通过物理方法导入受体细胞，但是 即使在最佳条件下，受体细胞中也只有少数细胞能稳 定地接受质粒，要想找到这些进入了质粒的受体细胞， 就要利用载体质粒上的遗传标记，天然质粒上碰巧携 带许多功能基因，它们便可被用作选择标记。
质粒（2μ）复制起点，又含有ARS片段
b. 不同生物复制起点混合—穿梭载体（shuttle vector）两种
生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种
生物中以质粒或病毒形式存在
*
穿梭载体范围：细菌—细菌（放线菌），细菌—酵母菌，
细菌—真菌，细菌—动物
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1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起 始序列, 密码子偏爱性 4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一 种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基 因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四 环素分子进入细菌细胞。
这种指示可以是选择性的（Apr ，Tcr ，Kanr），也可 以是非选择性的（如lacZ）
2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。
* 这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选 择性的（如TcS， lacZα, GUS），绝大多数为后者。 **有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一 作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前 多采用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作 选择性标记基因（lacZ，GUS等）。
第三章 基因工程的载体

载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体 •酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
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发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
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第一节 E.coli 质粒载体
一、质粒（plasmid）的一般性质 3、分类 接合型和非接合型 严紧性和松弛型 在基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒
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第一节
E.coli 质粒载体
二、质粒（plasmid）载体的构建 1、理想质粒载体所具备的条件 质粒较小 质粒带有可供选择的标记 带有尽可能多的单一限制酶切位点 应有较高的基因表达能力