基因工程-第三章-基因工程的载体

一、质粒（plasmid）的一般性质 2、特征

不相容性

利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因 子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配 到子细胞的过程中，就会彼此竞争 ，几种质粒中只能 有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不 相容性。
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主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶 类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1， URA3，LEU2，HIS4等。
3）生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, CAT
4） 噬菌斑
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3. 使用标记基因注意要点
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起 始序列, 密码子偏爱性 4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一 种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基 因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四 环素分子进入细菌细胞。
质粒（2μ）复制起点，又含有ARS片段
b. 不同生物复制起点混合—穿梭载体（shuttle vector）两种
生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种
生物中以质粒或病毒形式存在
*
穿梭载体范围：细菌—细菌（放线菌），细菌—酵母菌，
细菌—真菌，细菌—动物
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分子克隆载体的复制起点种类、标记基因与拷贝 数的关系
1. 复制起点种类与拷贝数间的关系
1) 质粒复制起点类型：低拷贝（严紧型，1-2 copies，受宿主染色 体基因控制）；高拷贝（松弛型，>20 copies，受宿主染色体控 制较弱） 2) ARS型载体：拷贝数较高（约20 copies） 3) 病毒型复制起点：高拷贝
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第一节 E.coli 质粒载体
一、质粒（plasmid）的一般性质 3、分类 接合型和非接合型 严紧性和松弛型 在基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒
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第一节
E.coli 质粒载体
二、质粒（plasmid）载体的构建 1、理想质粒载体所具备的条件 质粒较小 质粒带有可供选择的标记 带有尽可能多的单一限制酶切位点 应有较高的基因表达能力
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第一节
E.coli 质粒载体
一、质粒（plasmid）的一般性质 2、特征

自主复制性

质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控 制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染 色体DNA而自主复制
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第一节
E.coli 质粒载体
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第一节
2、特征

E.coli 质粒载体
一、质粒（plasmid）的一般性质
携带遗传标记

在实验室中将质粒通过物理方法导入受体细胞，但是 即使在最佳条件下，受体细胞中也只有少数细胞能稳 定地接受质粒，要想找到这些进入了质粒的受体细胞， 就要利用载体质粒上的遗传标记，天然质粒上碰巧携 带许多功能基因，它们便可被用作选择标记。
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2. 标记基因的种类
1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r， Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因
2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）
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第一节
E.coli 质粒载体
一、质粒（plasmid）的一般性质 1、定义
质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而 自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子 （Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）
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第一节
E.coli 质粒载体
二、质粒（plasmid）载体的构建 2、质粒人工构建的目的

天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用 作基因工程的载体必须对之进行改造构建：
（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择 （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组 （3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量 （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。
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3. 按复制起点划分克隆载体
1) 质粒复制型—复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体 2) ARS复制型—ARS（autonomus replicative sequence)，或 称染色体复制型 3) 病毒复制型—复制起点来自病毒，若为RNA病毒，必须反转
录为cDNA。
第三章 基因工程的载体

载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体 •酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
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发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
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5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活 性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和
β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有
当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作 用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编 码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和 LacZα）均可作为标记基因。
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2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。 Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺 环的水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合 成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化 的氯霉素不能结合在核糖体上。
β—半乳糖苷酶基因的优点:
a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
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6）葡萄糖苷酸酶基因（GUS）
该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水 解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十 分广泛，因为许多生物中没有这种基因。
4) 混合复制型 a. 同种生物复制起点混合—质粒形式存在；质粒或病毒 形式存在
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例：大肠杆菌（E.coli）的噬粒（phagemid）载体既含有来自质
粒的复制起点，又含有来自噬菌体（如M13）的复制起点。在 不同条件下，它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制，从 而获得质粒ds- DNA或噬菌体ss –DNA 又如：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的某些载体既含有
1. 具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移 性） 2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整 合位点 3. 长度尽可能小，以提高其载装能力 4. 具有多种单一的酶切位点 5. 具有合适的选择性标记
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遗传标记基因
1. 标记基因的作用
1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主 细胞
4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因
Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷 类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5和 Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞 内。
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这种指示可以是选择性的（Apr ，Tcr ，Kanr），也可 以是非选择性的（如lacZ）
2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。
* 这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选 择性的（如TcS， lacZα, GUS），绝大多数为后者。 **有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一 作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前 多采用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作 选择性标记基因（lacZ，GUS等）。
7）萦光素酶基因
萦光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂萦光素氧化的酶，并产 生萦光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细 菌（Photobacterium fischeri）产生的萦光素酶，它与FMN-氧化 还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
8）发光蛋白质基因
发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使 大肠杆菌菌落呈蓝色。
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分子克隆载体的复制起点与种类
1. 复制起点的种类
1) 核内复制起点 a. 染色体复制起点—原核生物(环状)和真核生物(线状)染色体 b. 染色体外复制起点 原核与真核生物 i. 质粒—DNA,RNA,线状,环状,单链,双链 ii. 病毒—同上, 细胞内和病毒颗粒内 2) 核外复制起点 两种质体中亦可能含有质粒 a. 线粒体—所有真核细胞 b. 叶绿体—所有绿色植物细胞
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第一节
E.coli 质粒载体
一、质粒（plasmid）的一般性质 2、特征

可扩增性

pMB1或ColEI类质粒在蛋白质合成中断时，质 粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白 质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或 ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复 制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝， 这叫做氯霉素扩增。
达型载体及各种探针型载体。
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第三章 基因工程的载体

作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞
2. 为外源基因提供复制能力或整合能力
3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
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ห้องสมุดไป่ตู้
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第三章 基因工程的载体

作为基因工程载体必须具备的基本条件
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人工构建的质粒根据其功能及用途分为：
1.
2.
3.
4.
5.
6.
多拷贝质粒 经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷 贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。 测序质粒 拷贝数高，加装测定顺序所必需的序列，如多切口接头， 便于各种片段方便克隆 整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确 重组整合入受体细胞的染色体上 穿梭质粒 含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复 制 表达质粒 装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便 任何外源基因在受体细胞内的高效表达 探针质粒 筛选克隆或寻找基因元件，他通常装有一个可以定量测 定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动基因、终止子等。
如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar
et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克
隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不
同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表
分子克隆载体的转化频率和稳定性
1. 影响转化频率的因素
1) 复制起点类型：尽可能选择高拷贝复制起点 2) 标记基因：尽可能选择高效表达的标记基因
2. 影响稳定性的因素
1) 复制起点类型—低拷贝载体稳定，高拷贝载体稳定性 差 2) 选择压力 3) 载体在宿主细胞中的状态—自主复制型和整合型 宿主细胞的遗传特性和生理特性
2. 标记基因与拷贝数的关系
若标记基因表达效率高，宿主细胞可能不大量产生标记基 因以满足选择压力要求，因而载体拷贝数会降低。对于不同标记 基因，可采取相应方法提高其拷贝数。 如：对于药物抗性标记基因，可提高药物浓度。 对于营养标记基因，可降低该基因的表达效率或更换其他低 效率的标记基因
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