高效液相色谱原理和操作详解
高效液相色谱仪原理及操作步骤
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这就像是给选手们准备好号码牌一样，得让它们有个“身份”呀。
样品的处理可得精心，不能有杂质啥的来捣乱。
接着就是进样啦，这就像是鸣枪起跑！把样品送进色谱柱这个“跑道”里，让它们开始“奔跑”。
在这个过程中，可别闲着呀，得时刻关注着仪器的运行状态。
就像看着比赛一样，看看选手们跑得顺不顺利。
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hplc高效液相色谱仪工作原理操作、维护要点的梳理总结
HPLC高效液相色谱仪工作原理操作、维护
要点的梳理总结
HPLC（高效液相色谱）是一种常见的分析仪器，用于分离、鉴定和定量分析化合物。
下面是HPLC高效液相色谱仪的工作原理、操作和维护要点的梳理总结：
工作原理：
1. 样品通过高压注射器注入进入液相色谱柱，柱内填充有固定相（如硅胶或离子交换树脂），流动相（溶剂）通过柱子，样品中的化合物在不同的固定相上有不同的分配系数，从而被分离出来。
2. 分离后的化合物通过检测器进行检测，检测器将化学信号转换为电信号，然后通过数据系统进行数据处理，得到化合物的保留时间、峰面积等信息。
操作要点：
1. 准备工作：检查仪器是否正常工作，准备好样品，选择合适的溶剂进行样品制备和提取。
2. 启动仪器：启动仪器，调节流速、温度等参数，使其达到预设值。
3. 注入样品：通过注射器注入样品，注意控制注入速度和量。
4. 运行分析：启动色谱柱和检测器，开始进行分析。
5. 数据处理：通过数据系统对分析结果进行数据处理，得到化合物的保留时间、峰面积等信息。
维护要点：
1. 定期清洁和维护仪器：定期清洁仪器，更换滤芯和柱子，保证仪器的正常工作。
2. 定期校准仪器：定期对仪器进行校准，保证分析结果的准确性。
3. 注意安全操作：在操作过程中应遵守安全规范，避免意外事故发生。
4. 储存样品：储存样品时应注意保存条件，避免样品变质或污染。
总之，HPLC高效液相色谱仪的工作原理、操作和维护要点都需要认真掌握，才能保证分析结果的准确性和仪器的正常工作。
高效液相色谱法原理及其应用
※梯度洗脱的优点： 1.缩短分析周期； 2.提高分离能力； 3.峰型得到改善，减少拖尾； 4.增加灵敏度。但有时引起基
线漂移。
※（三）进样装置
一、手动注射进样器 二、六通阀进样装置 三、自动进样器
进样阀的基本要求： 1. 耐高压 2. 进样量准确 3. 进样重复性好 4. 无流量和压力波动影响
2．恒压泵：恒压泵又称气动放 大泵，是输出恒定压力的泵。
注意
避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。 例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物， 四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混 合物等。
流动相 过滤——用滤
使用前 膜过滤或垂熔
漏斗过滤
脱气——采
用超声或过滤 的方法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
第二节 高效液相色谱仪
1．贮液瓶（滤芯，可滤 去颗粒状物质）
2．高压泵（输液泵、梯 洗脱度）
3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
※（一）输液系统
一、储液装置：过滤器 二、脱气装置：脱气机 流动相脱气： （1）吹氦脱气法 （2）加热回流法 （3）抽真空脱气法
※（二）高压输液泵及梯度洗脱装置 一、高压输液泵的种类 高压输液泵可以分为以下两类： 1．恒流泵：可输出恒定体积流量的
流动相。 （1）注射式泵（又称螺杆注射泵）
（2）往复型泵 （又称往复柱塞泵）
二、高压输液泵的原理 往复柱塞泵，柱塞向前运动，液 体输出，流向色谱柱；向后运动， 将贮液瓶中液体吸入缸体。如此 往复运动，保证将流动相以稳定 的速度流过色谱柱的部件。
吸附色谱 分配色谱 离子色谱 空间排阻 亲和色谱 色谱
固定相
全多孔固 固定液载 体吸附剂 带在固相
高效液相色谱的工作原理及操作注意事项
高效液相色谱的工作原理及操作注意事项高效液相色谱的工作原理及操作注意事项一、高效液相色谱的工作原理高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分离和分析技术，主要应用于化学、生物、医药等领域。
其工作原理是利用不同物质在固定相和移动相之间的分配平衡，实现对待测组分的高效分离。
以下是高效液相色谱的工作原理：1.流动相：高效液相色谱中的流动相也称为溶剂或载体，是携带待测组分通过色谱柱的介质。
流动相的选择应根据样品的性质、检测器的类型以及分离效果等因素进行选择。
2.固定相：高效液相色谱中的固定相是色谱柱中的填料，通常是涂布在硅胶或氧化铝等载体上的高分子聚合物。
不同物质根据其在固定相和流动相之间的分配系数进行分离。
3.洗脱过程：在高效液相色谱中，待测组分随流动相通过色谱柱，经过固定相和流动相之间的分配平衡实现分离。
分离后的组分会按照其在固定相和流动相之间的分配系数依次流出色谱柱，进入检测器进行检测。
4.检测器：高效液相色谱中使用的检测器根据待测组分的性质和检测要求进行选择，常见的有紫外-可见光检测器、荧光检测器、电导检测器等。
检测器的作用是将组分的浓度转化为可测量的电信号，以便进行记录和分析。
二、高效液相色谱的操作注意事项在使用高效液相色谱进行实验操作时，需要注意以下事项：1.样品准备：在进行高效液相色谱分析前，需要对样品进行必要的处理和制备。
应尽可能避免样品中的杂质和干扰物质对分离和分析的影响。
同时，样品的浓度应适中，以避免色谱柱过载或检测器过载。
2.流动相选择：流动相的选择对高效液相色谱的分离效果和分析结果至关重要。
应根据样品的性质、实验要求以及分离效果等因素选择合适的流动相。
同时，应注意流动相的纯度和稳定性，以保证实验结果的可靠性。
3.色谱柱选择：高效液相色谱中使用的色谱柱是分离和分析的关键元件。
应根据样品的性质、待测组分的类型以及分离要求等因素选择合适的色谱柱。
同时，应注意色谱柱的粒径、孔径和填料性质等参数，以确保达到最佳的分离效果。
高效液相色谱分析原理及流程
高效液相色谱分析原理及流程高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。
通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。
所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。
这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。
而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。
高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。
近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。
世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。
高效液相色谱分析原理(一)高效液相色谱分析的流程由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
(二)高效液相色谱的分离过程同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
HPLC原理和操作详解
HPLC原理和操作详解HPLC，即高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography），是一种高效的色谱技术，广泛应用于药学、化学、生化分析等领域。
下面将详细介绍HPLC的原理和操作步骤。
一、HPLC原理：1.进样：样品通过自动进样器或手动注射器进入色谱系统。
样品通常需先进行前处理，如固相萃取、离心沉淀等。
2.流动相输送：流动相可分为两种类型，一种是常规流动相，另一种是梯度流动相。
常规流动相的组成可能是单一溶剂或多溶剂的混合溶剂，根据需要可进行改变。
梯度流动相是指在色谱运行过程中，溶剂混合比例以一定速率进行连续改变。
3.固定相柱填充：识别需要分离的目标物的特性，并选择合适的固定相填充材料，如反相、离子交换相、尺寸排除相等。
填充材料应具有良好的化学稳定性、机械强度和化学机械平衡。
4.分离机理：样品在固定相柱填充物上发生与固体表面或固定相填充物之间的相互作用（如静电吸附、分配等），从而实现化合物的分离。
分离机理主要有单分配系数、亲水性、分子量、酸碱性等。
二、HPLC操作步骤：1.仪器准备：a.打开进样器、检测器、泵、柱箱等设备。
b.保持温度稳定，通常在恒温器中设置适当的温度。
c.准备流动相，根据需要将溶剂装入各个瓶中，并进行气体除泡和真空除泡操作。
2.进样准备：a.样品前处理，如离心沉淀、固相萃取等。
b.选用适当的进样方式（手动或自动），将样品加载到进样器中。
3.初步浓度选择：a.根据需要选择荧光、紫外、电导率检测器等。
b.根据样品性质和实验要求，选择合适的波长和浓度范围。
4.进行分离：a.根据样品的性质和需求，选择合适的固定相柱填充材料，并安装在柱箱中。
b.设置流速和梯度条件。
5.结果分析与报告：a.根据检测器的信号，得到峰的图形。
b.使用仪器自带的软件或其他数据处理软件，进行峰识别、配比和浓度计算。
c.生成分析报告。
6.仪器的维护：a.根据使用手册，进行常规的维护和保养。
高效液相工作原理及使用
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
特点1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。
一般可达150～350×105Pa。
2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。
高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。
3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。
如荧光检测器灵敏度可达10-11g。
另外，用样量小，一般几个微升。
5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。
而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。
对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。
据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。
高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。
用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。
其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。
lc-20at高效液相色谱仪操作原理
lc-20at高效液相色谱仪操作原理
LC-20AT高效液相色谱仪的操作原理基于液相色谱技术。
液
相色谱技术是一种利用液体作为固定相来分离和分析混合物的方法。
LC-20AT高效液相色谱仪的操作原理主要包括以下几个步骤：
1. 移液：将待分析的样品通过进样器导入到色谱柱中。
进样器通常采用自动进样装置，可以精确控制进样体积和进样时间。
2. 溶解：样品在进入色谱柱之前需要溶解在溶剂中，以便在溶液中均匀分布。
3. 色谱柱：进样器将样品引入到色谱柱中。
色谱柱是液相色谱仪的核心部件，用于分离混合物中的化学组分。
色谱柱内部填充有固定相，样品在固定相上发生分配和扩散，从而实现化合物的分离。
4. 流动相：流动相是液相色谱中的重要组成部分，它可以是纯溶剂或溶剂的混合物。
流动相通过色谱柱时，样品分离出来的成分会以不同的速率移动。
流动相的选择和流速的控制对分离效果至关重要。
5. 检测器：分离后的化合物通过检测器进行检测和定量。
常用的检测器有紫外可见光检测器和荧光检测器等。
检测器通过测量样品吸光度、荧光强度或其他性质来进行定量分析。
6. 数据分析：色谱仪将检测到的信号转换为数据，并进行数据处理和分析。
这些数据可以用于定量分析、峰识别、定性分析等。
综上所述，LC-20AT高效液相色谱仪的操作原理是通过样品的移液、溶解、色谱柱分离、流动相传递、检测器检测和数据分析等步骤，实现对混合物中化合物的分离和定量分析。
高效液相色谱仪的基本构造和工作原理
高效液相色谱仪的基本构造和工作原理一、概述高效液相色谱（HPLC）是一种广泛应用于化学、制药、食品、环保等领域的重要分离分析技术。
其通过高压泵推动流动相通过色谱柱，实现样品中各组分的分离，并通过检测器对分离后的组分进行检测。
本文将详细介绍高效液相色谱仪的基本构造和工作原理。
二、基本构造1. 流动相储存器：用于储存流动相，通常为高压密封容器，可确保流动相的纯度和稳定性。
2. 高压泵：为色谱分离提供动力，推动流动相通过色谱柱。
高压泵应具有稳定的输出压力和流量，以保证色谱分离的效果。
3. 色谱柱：是HPLC的核心部件，用于分离样品中的各组分。
色谱柱内部填充有固定相，不同组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，从而实现分离。
4. 检测器：用于检测色谱柱流出的组分。
常见的检测器有紫外-可见光检测器、荧光检测器、电导检测器等，可根据不同物质的吸收、发射或电导特性进行检测。
5. 记录仪：用于记录检测器的信号，生成色谱图。
记录仪应具有高灵敏度和线性响应范围。
6. 进样器：用于将样品注入色谱柱。
进样器应具有微量进样功能，且进样操作简便、快速。
7. 数据处理系统：用于处理记录仪记录的信号，进行色谱峰识别、定量和定性分析等。
数据处理系统应具有强大的数据处理能力和友好的用户界面。
8. 废液收集器：用于收集色谱分离过程中产生的废液，确保实验环境的整洁和安全。
三、工作原理高效液相色谱仪的工作原理基于色谱分离原理。
在色谱分离中，流动相携带样品通过固定相，不同组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，导致组分在两相之间的传递速度不同，从而实现各组分的分离。
在HPLC中，高压泵提供动力，推动流动相通过色谱柱，实现快速、高效的分离。
同时，检测器对分离后的组分进行检测，记录仪记录检测信号，最终由数据处理系统对色谱图进行分析和处理。
四、高效液相色谱仪的操作流程1. 准备工作：检查仪器各部件是否正常，确保流动相储存器、色谱柱、检测器等部件的连接完好。
高效液相色谱原理和操作详解
高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论 (3)一、液相色谱理论发展简况 (3)二、HPLC的特点和优点 (4)三、色谱法分类 (5)四、色谱分离原理 (5)II．基本概念和理论 (10)一、基本概念和术语 (10)二、塔板理论 (17)三、速率理论（又称随机模型理论） (19)III．HPLC系统 (22)一、输液泵 (23)二、进样器 (27)三、色谱柱 (29)四、检测器 (35)五、数据处理和计算机控制系统 (41)六、恒温装置 (42)IV．固定相和流动相 (43)一、基质（担体） (43)二、化学键合固定相 (46)三、流动相 (49)1．流动相的性质要求 (49)2．流动相的选择 (50)3．流动相的pH值 (51)4．流动相的脱气 (52)5．流动相的滤过 (53)6．流动相的贮存 (54)7．卤代有机溶剂应特别注意的问题 (54)8．HPLC用水 (55)V．HPLC应用 (56)一、样品测定 (56)二、方法研究 (58)附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 (58)一、对起草单位的要求： (58)二、对复核单位的要求： (59)I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
分析化学高效液相色谱法
分析化学高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和测定化学物质的重要分析方法，具有高分离效率、高灵敏度、宽线性范围和广泛的应用范围等优点。
下面将从仪器原理、工作原理和应用等方面对HPLC进行详细分析。
一、仪器原理：HPLC仪器主要由溶剂系统、进样器、柱温箱、液相分离柱、检测器和数据处理系统等组成。
1.溶剂系统：通常采用双头柱泵供应稳定的流动相。
溶剂通过比例调节阀混合形成所需的溶剂混合物。
2.进样器：它将少量的样品溶液注入到流动相中，通常使用自动进样器进行样品进样。
3.柱温箱：控制流动相的温度，以提高分离的效果。
柱温一般在室温到高温之间进行控制。
4.液相分离柱：是HPLC的核心部分，其中填充有液相固定相。
根据不同的分析目标和样品性质，可以选择不同类型的液相柱，如反相色谱柱、离子交换柱等。
5.检测器：常见的检测器有紫外-可见光谱检测器（UV-VIS）、荧光检测器、折射率检测器等。
根据不同化学物质的性质和要求，可以选择不同的检测器。
6.数据处理系统：包括记录和处理仪器所得到的信号。
常见的数据处理系统有计算机数据采集系统，可以进行数据的分析和处理，生成相应的色谱图。
二、工作原理：HPLC通过运用固定相与移动相之间的亲疏水性差异来实现化学物质的分离。
样品在液相中与固定相发生相互作用，不同化合物的相互作用程度不同，因此在液相中呈现出不同的流动速度。
根据样品分离的顺序，不同的化合物在一定时间内通过液相分离柱，进而被检测器检测到。
HPLC中的流动相一般由溶剂和缓冲液组成，并通过色谱柱中的固定相将待测试的物质分离开来。
其中，缓冲液（通常称为背后电解质）可以调节流动相的pH值，改变待测试物质的性质，从而影响其分离。
三、应用：HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全和生化分析等领域。
1.药物分析：HPLC可以用于药物分析中，以检测药物的含量、纯度和杂质成分。
药物的测定可以通过校准曲线来进行分析。
2.环境检测：HPLC可以用于环境监测中，例如水质分析、大气污染物分析等。
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分析技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
本文将介绍高效液相色谱的基本原理、操作步骤以及一些常见的注意事项。
一、高效液相色谱的基本原理高效液相色谱是基于溶液通过固定相的柱子进行分离的原理。
通过控制溶液的流动速度，样品中的化合物将根据其化学特性在固定相上产生不同的保留时间，进而实现分离和定量分析。
在高效液相色谱中，离子交换、尺寸排除、亲和力、反相等不同的柱填料被广泛应用。
根据不同的样品性质和需要分离的化合物，选择合适的柱填料是非常重要的。
此外，流动相的选择也是影响分离效果的重要因素。
二、高效液相色谱的操作步骤1. 样品准备：样品应经过适当的前处理，如过滤、稀释等，以确保样品中的杂质不会影响分析结果。
需要注意的是，样品的pH值也会对分析结果产生影响，因此在样品准备过程中可根据需要进行调整。
2. 样品进样：将经过适当处理的样品注入进样器中，控制进样量和进样速度。
可以选择自动进样或手动进样的方式，保证样品的稳定和准确性。
3. 流动相的配制：根据分析需要，选择适当的溶剂组合并按照一定比例进行配制。
流动相的配制既要保证溶剂的纯度，又要考虑溶剂对柱填料的影响。
4. 柱温和流速的选择：根据柱填料的要求，选择合适的柱温和流速。
在进行分析前，需要对柱温和流速进行优化和调试，以获得较好的分离效果。
5. 检测器的选择和参数设置：根据需要分析的化合物特性，选择合适的检测器，并设置相应的参数。
常见的检测器包括紫外-可见光谱检测器、荧光检测器和质谱检测器等。
6. 数据分析与结果解释：根据检测器输出的信号，利用计算机软件对数据进行处理和分析。
根据不同的化合物特性，可以采用不同的数据分析方法和曲线拟合技术来定量分析目标化合物。
三、常见的注意事项1. 制备和使用流动相前，需仔细检查溶剂纯度，避免杂质对结果产生干扰。
2. 柱子的保养和维护非常重要，定期进行柱子的清洗和再生，以保证分离效果和柱寿命。
高效液相色谱的原理和应用
高效液相色谱的原理和应用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离技术，广泛应用于化学、制药、食品科学、环境监测等领域。
本文将介绍高效液相色谱的原理、仪器组成、常见模式、样品制备及其应用。
一、高效液相色谱原理高效液相色谱的原理是利用液相在不同固相填料上的吸附和分配现象，将化合物在不同填充柱中发生分离和纯化。
通常，HPLC 固定相含有一些化学基团，如反相和离子交换基团，可与样品中的化合物进行吸附和分配。
液相进样、柱温及流动相的组成等因素均会影响HPLC分离效果。
二、高效液相色谱仪器组成高效液相色谱仪的组成一般包括进样器、色谱柱、泵、检测器和处理系统等部分。
进样器将样品喷射到柱口，色谱柱用于灌流梳理样品，其中固定填料用于分离和分析所需的化合物。
泵用于将流动相推动柱中的样品，检测器观察所需分析的化合物是否沿着柱流动。
高效液相色谱不仅提供精确且迅速的色谱分离，而且对各种检测器兼容，可选择性地检测各种目标物。
三、高效液相色谱常见模式高效液相色谱常见的模式有反相、离子交换、正相等。
其中，反相色谱在所有柱中应用最广，其固定相通常是羟基烷基硅胶（C18）。
反相色谱的原理在于样品溶解于亲水性较低的溶剂中排出；在色谱柱中遇到亲水性较高的固定相时，由于样品亲水性性质，样品在固定相上发生反相互相作用来获得分离。
离子交换色谱是通过离子交换基团分离化合物中的阴阳离子的；正相色谱固定相仅仅地与正离子发生斥力作用，使分离物在某些环境下进行发生分离和净化，通常情况下正相色谱的相相反色谱。
不过在实际操作过程中，某些离子需要离子交换色谱柱才能实现的很好地分离。
四、样品制备高效液相色谱之前样品制备可能是个需要重视的选项，由于HPLC是在溶液环境中进行的，所以所需的样品必须适合在液相中溶解。
当涉及到样品之前显微技巧之后有必要进行物质氨基酸或肽的酸性或碱性水解，用于小分子化合物的样品溶剂通常为方法文献所标示的洗涤剂和/或过滤剂; 在使用纯度高的离子液体进行样品溶解和/或抑制和保护剂。
高效液相色谱简介及操作
三、高效液相色谱基本操作步骤
（1）检查电源线连接是否正确后打开电源开关 （2）泵体及流路内的气泡排除
（3）正确连接色谱柱 注意流向标志，切勿反接
（4）系统平衡
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第一步：先用甲醇或乙腈冲洗流路约 20分钟，平衡活化色 谱柱，并赶走管路中的杂质和水分。 第二步：平衡色谱柱 方法一：若流动相为有机相与水相的混合物，则第一 步完成后，按照分析样品的需要调节有机相与水相的比例 后冲洗流路约30分钟后，待基线走平后即可进样。 方法二：若流动相中含有缓冲盐溶液、有机/无机酸， 则第一步完成后，先用95%的去离子水冲洗流路约20分钟 后，再按照分析样品的需要调节流动相的比例，冲洗流路 约30分钟，待基线走平后即可进样。
b. 示差折光检测器 (RID) 凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示 差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使 用此检测系统。 原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差 来测量试样浓度。 特点： 通用性检测器； 对温度变化比较敏感，要保持在±0.001℃； 灵敏度低(10-6g)； 对溶剂变化敏感，不适用于梯度洗脱。
输液泵应具备如下性能：
①流量稳定； ②流量范围宽； ③输出压力高； ④液缸容积小； ⑤密封性能好，耐腐蚀。
高压泵的分类
恒压泵
分类
恒流泵
螺旋注射泵 柱塞往复泵 隔膜往复泵
往复式柱塞泵
2 进样系统
进样方式：注射器进样、阀进样、自动进样。 早期使用注射器进样，现在大都使用耐高压的六通阀进 样或自动进样。
1.色谱的演化
• 色谱：由于不同的组分与固定相作用强弱不同， 在一定的推动力下，它们在固定相中滞留的时间 长短不一，从而使它们按一定顺序从色谱柱中先 后流出。
HPLC原理和操作详解
HPLC原理和操作详解HPLC (High Performance Liquid Chromatography) 是一种高效液相色谱分析仪器，也是一种广泛应用于分析和制备化学领域的色谱技术。
它通过溶液的流动将混合物中的分子分离和纯化，然后通过检测器检测和定量各个组分。
下面将详细介绍HPLC的原理和操作。
HPLC的原理是基于色谱技术的理论基础，即溶液与固体（固定相）表面之间会发生物理和化学吸附等相互作用，从而使溶液中的化合物被分离。
HPLC的主要组成部分包括溶液输送系统、色谱柱、检测器和数据处理系统。
HPLC的操作步骤如下：1.样品制备：将待分析的样品溶解在适当的溶剂中，并通过滤器过滤，去除杂质和颗粒物。
2.系统预冲洗：在运行之前，先用纯溶剂进行系统预冲洗，以去除柱子内的杂质。
3.色谱柱选择：根据需要分离的化合物性质选择适当的色谱柱。
常见的色谱柱包括反相柱、离子交换柱和凝胶渗透柱等。
4.流动相选择：根据样品性质选择合适的流动相，可以是单一溶剂或者混合溶剂。
流动相的选择对分离效果有很大影响。
5.色谱条件设定：设置合适的色谱条件，包括流速、柱温、检测器的参数等。
这些参数的选择要根据样品的特性和分析目的进行优化。
6.进样：将经过预处理的样品注入HPLC系统中。
可以选择自动进样或者手动进样的方式。
7.分离：通过调节色谱柱中的移动相流动速度和梯度等参数，使样品中的组分逐渐被分离。
分离的程度取决于色谱柱、流动相和样品的性质。
8.检测：通过检测器对分离出的化合物进行检测和定量。
常见的检测器包括紫外-可见吸收检测器、荧光检测器和质谱检测器等。
9.数据处理：将检测到的信号转换为荧光检测器和质谱检测器等。
HPLC的操作常见问题和注意事项：1.质控：在实验过程中需要进行质控，包括对流速、柱温和检测器的参数进行定期检查和校准。
2.柱寿命：色谱柱使用一段时间后会失效，需要定期更换。
柱的选择要根据样品的特性和分离目的进行优化。
高效液相色谱的原理及操作规程
打开软件
在桌面双击打开“Instrument Online”软件，会弹出基线窗口，最小化后可看 到操作界面，选择好实验条件后点击“On”按钮，此时便开始淋洗，直至基线 走平且提示“Ready”后，便可开始测试（注：若基线走平后并不是在0位置， 可以打开基线窗口，点击“Balance”使其调0）
高效液相色谱仪的操作过程
HPLC的图形分析
色谱图(Chromatogram) : 色谱柱流出物通过检测器时所 产生的响应信号对时间的曲线 图,其纵坐标为信号强度,横坐标 为时间
←色谱峰 响 应 值 峰宽 基线 ↓ 时间（分） 峰 高
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色谱概述
分离是个物理过程
固定相（Stationary Phase） 流动相（Mobile Phase） 进样（Injection） 洗脱（Elution） 相互作用（Interaction）
色谱概述
用液体作为流动相的色谱称为液相色谱（LC） 与气相色谱法相比，高效液相色谱法具有很多优点：
1.高效液相色谱柱所用的固定相粒度很小（10µm以下），因此它的分离 效率很高。 2.高效液相色谱中的流动相可以选择不同极性的液体，由于它与固定相 都能对组分产生一定的亲和力，从而提高了分离效率。 3.高效液相色谱法可以应用于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的化合 物的分离分析中。 4.高效液相色谱可以在室温条件下进行分析，而气相色谱一般都要在较 高温度下进行
高效液相色谱的原理 及操作规程
色谱概述
色谱法的原理：
是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸 附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分 在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离 两相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase),有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase),流 动相又叫洗脱剂,溶剂
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高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论 (3)一、液相色谱理论发展简况 (3)二、HPLC的特点和优点 (4)三、色谱法分类 (5)四、色谱分离原理 (5)II．基本概念和理论 (10)一、基本概念和术语 (10)二、塔板理论 (17)三、速率理论（又称随机模型理论） (19)III．HPLC系统 (22)一、输液泵 (23)二、进样器 (27)三、色谱柱 (29)四、检测器 (35)五、数据处理和计算机控制系统 (41)六、恒温装置 (42)IV．固定相和流动相 (43)一、基质（担体） (43)二、化学键合固定相 (46)三、流动相 (49)1．流动相的性质要求 (49)2．流动相的选择 (50)3．流动相的pH值 (51)4．流动相的脱气 (52)5．流动相的滤过 (53)6．流动相的贮存 (54)7．卤代有机溶剂应特别注意的问题 (54)8．HPLC用水 (55)V．HPLC应用 (56)一、样品测定 (56)二、方法研究 (58)附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 (58)一、对起草单位的要求： (58)二、对复核单位的要求： (59)I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压——压力可达150~300 Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0 ml/min。
高效——可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。
三、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。
气相色谱法适用于分离挥发性化合物。
GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。
液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。
LC 同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。
此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。
按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。
（此外还有电泳。
）按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。
四、色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。
分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。
常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。
适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。
常用于分离同分异构体。
2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。
分离过程是一个分配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。
由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。
现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。
正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
适用于分离非极性和极性较弱的化合物。
RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC 应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。
为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。
但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。
有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。
正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高～中中～低流动相极性低～中中～高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。
3．离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。
被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。
缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。
被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。
pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。
流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。
离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。
它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。
主要用于分析离子强度大的酸碱物质。
分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。
另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。
分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。
离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。
被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH 值、离子强度有关。
5．排阻色谱法固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。
小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。
它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。
常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。
II．基本概念和理论一、基本概念和术语1．色谱图和峰参数➢色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。
➢基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
➢噪音(noise)——基线信号的波动。
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
➢漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
➢色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。
流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。
不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。
前者少见。
➢拖尾因子(tailing factor，T)——T＝，用以衡量色谱峰的对称性。
也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。
《中国药典》规定T应为0.95~1.05。
T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。
➢峰底——基线上峰的起点至终点的距离。
➢峰高(peak height，h)——峰的最高点至峰底的距离。
➢峰宽(peak width，W)——峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。
W＝4σ➢半峰宽(peak width at half-height，W h/2)——峰高一半处的峰宽。
W h/2＝2.355σ➢标准偏差(standard deviation，σ)——正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。
正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。