分子发光分析
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分子发光分析法
3.检测器 3.检测器
荧光计采用光电管作检测器 荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器 电感耦合器件（charge couple device, CCD)
四、荧光分析方法与应用
1. 特点： 特点： （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级
？
光度法 A = lg I0/I = KC 荧光法 I= KC
(c) 刚性平面结构：可减少分子振动，减少与溶剂的相互作用 刚性平面结构：
(d) 取代基效应 取代基效应：给电子取代基使荧光增强；吸电子取代基使荧光减弱 如苯胺和苯酚荧光较强，而硝基苯为非荧光物质 （e）重原子效应 ）重原子效应：卤素取代基随原子序数的增加，荧光减弱，而磷光增强
（3)荧光螯合物 荧光螯合物
I p = 2 . 3ϕ p I o c
式中：Ip 为磷光效率，Io 为激发光的强度人为磷光物质的摩尔吸收系数，b为 试样池的光程。在一定的条件下，ϕ 、I p、 、b均为常数，因此上式可写成： κ
I p = Kc
根据上式可以用磷光强度对磷光物质浓度制作定量分析的标准曲线
2. 温度对磷光强度的影响：随着温度的降低，磷光逐渐增强 温度对磷光强度的影响： 3.重原子效应： 3.重原子效应：重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易引 重原子效应 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1→ T1的体系间窜跃 概率增大，有利于增大磷光效率。 4.室温磷光 4.室温磷光 （1）固体基质：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重 态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。 （2）胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光 体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提 高三重态的稳定性。 （3）敏化磷光: 激发三重态将能量转移于另一易发磷光的受体，让其法磷光
分子发光分析法
只有在极稀的溶液中，当 b c <0.02时才成立，对于浓度较 高的溶液，由于自猝灭和自吸收等原因，使荧光强度和荧光 物质浓度不呈线性关系。
3 .荧光的产生与分子结构的关系
• 分子产生荧光必须具备两个条件： • 物质分子必须具有能吸收一定频率紫外可见辐射
的特征结构，分子必须具有吸光的结构 • 吸光后被激发的分子还必须具有高的荧光量子产
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320
380 440醇溶液荧（磷）光光谱
7-1 概述
• 分子发光分析法包括荧光分析法、磷光分析法和化学发光 分析法。这三种都是通过测量被激发的分子回到基态时所 发射的光辐射来进行分析的，不同之处在于光谱产生的机 制。
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ：
•
If = Ia
•
由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- b c )
•
If = I0(1-10- b c ) = I0(1-e-2.3 b c )
• 浓度很低时，将括号项近似处理后：
•
If = 2.3 I0 b c = Kc
② 荧光 (或磷光)发射光谱
• 固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或 磷光强度)与发射光波长关系曲线。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260 320
380 440 500 560 620
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
③ 激发光谱与发射光谱的关系
（1） Stokes(斯托克斯)位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 （2） 荧光光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如l2
第七章 分子发光分析
22:50
如8-巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况
溶剂 介电常数 四氯化碳 2.24 氯仿 5.2 丙酮 21.5 乙腈 38.8
荧光峰λ/nm 荧光效率
390
0.002
398
0.041
405
0.055
410
0.064
22:50
③ 溶液pH值对荧光强度的影响 不同的pH值，化合物所处状态不同，不同的 化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有 所不同。 对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物， 一方面pH会影响鏊合物的形成，另一方面还会 影响鏊合物的组成，因而影响它们的荧光性质。 如：苯酚在酸性溶液中呈现荧光，但在碱性 溶液中，无荧光。
浓度范围为：10-5μg/ml～100μg/ml 。对于较 浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光 强度和浓度不呈线性关系,将向浓度轴偏离。
22:50
（2）影响荧光强度的因素 ① 溶剂对荧光强度的影响 一般来说，随着溶剂介电常数的增大，荧光 峰的波长越大，荧光效率也越大。 ② 温度对荧光强度的影响 温度上升使荧光强度下降。
22:50
① 碰撞猝灭 处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰 撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方 式回到基态，产生猝灭作用。 。
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧 光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液 吸收光谱的改变。
22:50
③ 氧的猝灭作用 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三 重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们 在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭 效应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的 荧光物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子 和三重态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
如8-巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况
溶剂 介电常数 四氯化碳 2.24 氯仿 5.2 丙酮 21.5 乙腈 38.8
荧光峰λ/nm 荧光效率
390
0.002
398
0.041
405
0.055
410
0.064
22:50
③ 溶液pH值对荧光强度的影响 不同的pH值，化合物所处状态不同，不同的 化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有 所不同。 对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物， 一方面pH会影响鏊合物的形成，另一方面还会 影响鏊合物的组成，因而影响它们的荧光性质。 如：苯酚在酸性溶液中呈现荧光，但在碱性 溶液中，无荧光。
浓度范围为：10-5μg/ml～100μg/ml 。对于较 浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光 强度和浓度不呈线性关系,将向浓度轴偏离。
22:50
（2）影响荧光强度的因素 ① 溶剂对荧光强度的影响 一般来说，随着溶剂介电常数的增大，荧光 峰的波长越大，荧光效率也越大。 ② 温度对荧光强度的影响 温度上升使荧光强度下降。
22:50
① 碰撞猝灭 处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰 撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方 式回到基态，产生猝灭作用。 。
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧 光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液 吸收光谱的改变。
22:50
③ 氧的猝灭作用 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三 重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们 在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭 效应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的 荧光物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子 和三重态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
三章分子发光分析法
If = fIa= f ( Io-I )
If : 荧光强度 Io : 所吸收的辐射强度； f ：荧光效率
(一)、荧光强度与浓度
将指数展开：
如果吸光度A < 0.05, 方括号中其他各项与第一项相比均可忽略：
f I0
b
由于A=bc：故在实验条件固定时， 荧光强度与浓度成正比,即：
(二)、荧光熄灭
=
奎宁在0.1M的硫酸中荧光量子产率的绝对值为0.55。
荧光分析的缺点——散射光影响
磷光分析的仪器
光源
检测器
贝克勒耳圆盘
低温磷光分析 固体基质室温磷光分析 保护流体室温磷光分析 无保护流体室温磷光分析
磷光分析的缺点——仪器复杂，需要固体基质或保护
化学发光分析的仪器
记录器
四 荧光、磷光和化学发光分析法 （Fluorescence，phosphorescence and chemiluminescence analysis）
化学发光效率φCL
化学发光效率等于激发态分子的产率φCe和激发态分子的发光效率φem之乘积.
化学发光的强度与反应物浓度间的关系
根据化学发光发生和消失时间的长短，通常分为快发光和慢发光两种.快发光在反应进行1秒之内即可达到发光峰值，在5秒之内峰值衰减90％，慢发光的发生和衰减时间相对要长一些.不论是快发光还是慢发光，化学发光的相对强度ICL决定于化学发光反应的转化速率，而后者常用单位时间内反应物或产物浓度的变化表示.
灵敏度和检出限
化学发光分析法的灵敏度通常不是由仪器可检测的最低浓度决定的，因为许多化学发光法都是高灵敏的，仪器检测光的能量不是主要问题，而环境污染和其它低浓度的干扰因素及排除显得特别重要，它们往往决定方法的灵敏度. 一般把所产生的化学发光相对强度等于空白信号标准偏差S0三倍时的被测物浓度作为它的检测下限，简称检出限（detection limit, DL）.
If : 荧光强度 Io : 所吸收的辐射强度； f ：荧光效率
(一)、荧光强度与浓度
将指数展开：
如果吸光度A < 0.05, 方括号中其他各项与第一项相比均可忽略：
f I0
b
由于A=bc：故在实验条件固定时， 荧光强度与浓度成正比,即：
(二)、荧光熄灭
=
奎宁在0.1M的硫酸中荧光量子产率的绝对值为0.55。
荧光分析的缺点——散射光影响
磷光分析的仪器
光源
检测器
贝克勒耳圆盘
低温磷光分析 固体基质室温磷光分析 保护流体室温磷光分析 无保护流体室温磷光分析
磷光分析的缺点——仪器复杂，需要固体基质或保护
化学发光分析的仪器
记录器
四 荧光、磷光和化学发光分析法 （Fluorescence，phosphorescence and chemiluminescence analysis）
化学发光效率φCL
化学发光效率等于激发态分子的产率φCe和激发态分子的发光效率φem之乘积.
化学发光的强度与反应物浓度间的关系
根据化学发光发生和消失时间的长短，通常分为快发光和慢发光两种.快发光在反应进行1秒之内即可达到发光峰值，在5秒之内峰值衰减90％，慢发光的发生和衰减时间相对要长一些.不论是快发光还是慢发光，化学发光的相对强度ICL决定于化学发光反应的转化速率，而后者常用单位时间内反应物或产物浓度的变化表示.
灵敏度和检出限
化学发光分析法的灵敏度通常不是由仪器可检测的最低浓度决定的，因为许多化学发光法都是高灵敏的，仪器检测光的能量不是主要问题，而环境污染和其它低浓度的干扰因素及排除显得特别重要，它们往往决定方法的灵敏度. 一般把所产生的化学发光相对强度等于空白信号标准偏差S0三倍时的被测物浓度作为它的检测下限，简称检出限（detection limit, DL）.
第六章分子发光分析法
ph（CH=CH）3ph 0.68 ph（CH=CH）2ph 0.28
化合物 苯 萘
蒽
f 0.11 0.29
0.46
丁省
0.60
戊省
0.52
• 3）刚性结构：
• 多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。
• 原因：这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其 它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能 性。
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜跃
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0 l1
l2
l 2
l3
分子内的光物理过程
1.2 激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。
光致发光 化学发光 生物发光
荧光 磷光
按光子能量分类： 荧光
斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem 反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem 共振荧光(Resonance)：λex=λem
第一节 分子发光的基本原理
• 一、 分子荧光及磷光光谱的产生 • 1.1荧光及磷光的产生
电
蒽的激发光谱和荧光光谱
二、荧光与分子结构的关系
• 1 荧光量子产率
• 分子产生荧光必须具备的条件：
• i） 分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；
• ii）吸收特征频率的光后，具一定光量子产率的荧光。
• 即荧光量子产率（荧光效率或量子效率） 足够大.
化合物 苯 萘
蒽
f 0.11 0.29
0.46
丁省
0.60
戊省
0.52
• 3）刚性结构：
• 多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。
• 原因：这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其 它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能 性。
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜跃
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0 l1
l2
l 2
l3
分子内的光物理过程
1.2 激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。
光致发光 化学发光 生物发光
荧光 磷光
按光子能量分类： 荧光
斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem 反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem 共振荧光(Resonance)：λex=λem
第一节 分子发光的基本原理
• 一、 分子荧光及磷光光谱的产生 • 1.1荧光及磷光的产生
电
蒽的激发光谱和荧光光谱
二、荧光与分子结构的关系
• 1 荧光量子产率
• 分子产生荧光必须具备的条件：
• i） 分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；
• ii）吸收特征频率的光后，具一定光量子产率的荧光。
• 即荧光量子产率（荧光效率或量子效率） 足够大.
分子发光分析法与分子吸收分光光度
分子发光分析法与分子吸收分光光度
分子发光分析法和分子吸收分光光度法（MMS）是物理化学中测定物质含量和生物物质含
量的两种常用方法。
它们之间有共同点和不同之处，本文主要就这二者的原理和方法进行
介绍。
分子发光分析法（MALS）是用物质中的激发态分子把紫外线能量转换为可见光，用以表征
物质的测定方法。
该方法工作原理为紫外线照射激发态分子，激发态分子把紫外线能量转
变为可见光，然后通过光电器件检测发出的可见光，最终得出物质的测定结果。
MALS技术的优点在于检测结果准确，具有快速性，还可以检测生物样本中物质含量。
而分子吸收分光光度（MMS）是通过测量物质吸收入射光的程度，来表征物质的检测方法。
这种技术工作原理是将光源照射在样本上，样本中的物质会吸收一部分入射的紫外线，而
剩下的光经过反射和透射而到达检测器，最终通过计算获得物质的测定数值。
比较MMS和MALS，MMS技术具有更高的灵敏度，可以进行更细小物质的检测，而且不受多种物质的干扰，也可以检测生物样本中的物质含量。
总之，MALS和MMS都是通过激发态分子转换紫外线能量为可见光，然后通过光电器件检测可见光，来判断物质的含量的两种常用技术，它们的优点和特点主要是MALS检测结果准确，具有快速性，而MMS则具有更高的灵敏度，可以进行更细小物质的检测，也可以检测
生物样本中的物质含量。
第六章荧光法
CH3
CH3
CH3 CH3
维生素E： 激发波长295nm 发射波长324nm
硫色素荧光法
K 3 Fe(CN ) 6 NaOH 维生素B1
溶解后 （铁氰化钾）氧化
酸 正丁醇 荧光消失 硫色素 蓝色荧光 碱
激发λ=365nm； 发射λ=435nm
N H3C N
4.猝灭剂（quencher）的影响 荧光猝灭：是指荧光物质分子与溶剂或其它 溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消 失或荧光强度与浓度不呈现线性关系的现象。
引起荧光猝灭的物质，称为猝灭剂，如 卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合 物、重氮化合物、羰基化合物等吸电子极性 物质。
荧光猝灭的主要原因是碰撞猝灭。 碰撞猝灭：处于激发单重态的荧光分子 与猝灭剂碰撞后，使激发态分子以无辐 射跃迁回到基态，产生猝灭。
CH 2 NH 2 HCl
N S
CH 3 C 2 H 4 OH
硫胺素
N H3C N N
N S
CH 3 C 2H 4OH
硫色素
四、环境对荧光的影响
1.温度的影响 一般说来，大多数荧光物质的溶液随 着温度的降低，荧光效率和荧光强度将增 加，相反，温度升高荧光效率将下降。 如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10 ℃，荧光效率增加3%，冷至-80℃时，荧光 效率为100%。
荧光
延迟荧光
磷光
系间串越 内转换
外转换
振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大。 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态。 磷光：10-4～10s，第一激发三重态的最低振动能级→基态。
辐射跃迁: 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振 动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-9 ~ 10 -7s。 由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度快。 磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态 所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的 改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4 ~10s。
分子发光分析法
第五章 分子发光分析法: 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。
第一节 荧光分析法一、概 述 :分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。
二、荧光产生的基本原理（一）分子荧光的产生（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率2.荧光与分子结构的关系（1）产生荧光的条件①必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大， 电子的离域性越强，越容易被激发产生荧光；大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。
②分子的刚性平面结构有利于荧光的产生③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响 给电子基团：-OH 、-NH2、-NR2和-OR 等可使共轭体系增大，导致荧光增强。
吸电子基团：-COOH 、-NO 和-NO2等使荧光减弱。
随着卤素取代基中卤原子序数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。
3.环境因素对荧光强度的影响（1）溶剂极性对荧光强度的影响: 一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。
溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大. 奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。
（2）温度荧光强度的影响: 一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。
对大多数的荧光物质而言，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。
由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光的影响比荧光更大。
（3）pH 对荧光强度的影响:共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。
另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。
分子发光分析法与分子吸收分光光度法
分子发光分析法与分子吸收分光光度法
分子发光分析法与分子吸收分光光度法
分子发光分析法和分子吸收分光光度法是两种常用的分子光学技术。
它们都是利用自由基反应的原理测定物质的技术。
分子发光分析法是基于激发分子发射光，从而测定物质浓度的技术。
它使用一种特殊的分子发射剂与被测物质反应，当被测物质与分子发
射剂反应后，分子发射剂会被激发发射出特定波长的光，而这些发射
出的光则可以用来测定被测物质的浓度。
分子吸收分光光度法是基于激发分子吸收光来测定物质浓度的技术。
它使用一种特殊的分子发射剂，它能把一种特定的波长的光吸收，而
这种光则能够激发被测物质。
当被测物质激发后，它会吸收一定波长
的光，而这些被吸收的光则可以用来测定被测物质的浓度。
通过对比可以看出，分子发光分析法和分子吸收分光光度法各有优劣，它们都可以用来测定物质的浓度，但都存在一些使用上的限制，比如
分子发光分析法在测定低浓度物质时会有一定的误差，而分子吸收分
光光度法则受到测量物质种类的限制。
因此，在选择物质浓度检测的
技术时，应根据具体情况选择适合的技术，以得到更准确的测定结果。
90350-仪器分析-第八章 分子发光分析法
禁阻跃迁． • 磷光发射过程：由第一激发单重态的最低振动能级，
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫 转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。
3、荧光/磷光光谱曲线
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
• 激发光谱曲线-荧光强度与激
发光波长的关系
• 固定测量波长为荧光/磷光的最 大发射波长，改变激发波长， 测量荧光或磷光强度；
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
• 荧光或磷光光谱曲线-荧光
或磷光强度与发射光波长的关 系
• 固定激发光波长为其最大激发 波长，测量发射不同波长的荧 光或磷光强度．
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
4. 荧光、磷光与分子结构的关系
荧光激发光谱荧光发射光谱
200 蒽25的0 激30发0光3谱50和4荧00光4光50n谱m500
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量
子产率( f）的关系 ：
If = Ia
由朗伯-比耳定律：
A=lg（I0/ It）， Ia= I0- It
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
9. 影响分子发光的环境因素
a.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
b.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
c. 溶液pH
酸碱化合物受溶液pH的影响较大，需要严格控制.
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫 转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。
3、荧光/磷光光谱曲线
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
• 激发光谱曲线-荧光强度与激
发光波长的关系
• 固定测量波长为荧光/磷光的最 大发射波长，改变激发波长， 测量荧光或磷光强度；
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
• 荧光或磷光光谱曲线-荧光
或磷光强度与发射光波长的关 系
• 固定激发光波长为其最大激发 波长，测量发射不同波长的荧 光或磷光强度．
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
4. 荧光、磷光与分子结构的关系
荧光激发光谱荧光发射光谱
200 蒽25的0 激30发0光3谱50和4荧00光4光50n谱m500
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量
子产率( f）的关系 ：
If = Ia
由朗伯-比耳定律：
A=lg（I0/ It）， Ia= I0- It
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
9. 影响分子发光的环境因素
a.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
b.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
c. 溶液pH
酸碱化合物受溶液pH的影响较大，需要严格控制.
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
分析化学-分子发光分析法
3. 流式细胞术（FCM） 对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测
标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量 分析和分选的技术。
§4 化学发光分析法
Chemiluminescence Analysis
基本原理 化学发光反应类型 化学发光测量仪器 化学发光分析法的应用
一、基本原理
化学发光是由于化学反应而导致的光发射。 发生于生命体系的化学发光称为生物发光。 生物发光均有酶（荧光素酶）参加。
最大化学发光强度与发光物质浓度成正 比： Icl max = Kc
化学发光的积分值与发光物质浓度成正 比： Icl = Kc
二、化学发光反应的类型
直接化学发光
A 十 B C＊ ， C＊ C 十 hν
间接（敏化）化学发光 A 十 B C＊ + D ， C＊+ F C 十 F＊
F＊ F 十 hν
三、New technique of fluorescence analysis
1. 激光荧光分析 F 与 I0 成正比，激光的强度大，可提高
荧光法的灵敏度。
2.时间分辨荧光分析
由于不同分子的荧光寿命不同，在激发 和检测之间延缓一段时间，使不同荧光寿命 的物质达到分别检测的目的。
时间分辨荧光免疫法 将稀土元素的螯合物标记抗体，与体液中 的抗原结合。当加入一种增效剂时，稀土 元素被释放出来，形成新的螯合物，能产生 长寿命的 荧光（10 ~1000 μs)。待样品中 蛋白质等物质所发荧光完全衰减后进行测定， 可有效消除背景干扰。 已用于测定甲胎蛋白、促性腺绒毛激素、 皮质醇等体内微量物质的测定。
2.化学发光免疫分析仪
化学发光免疫分析是将化学发光分析和 免疫分析相结合而建立的一种超微量分析 技术。兼具发光分析的高灵敏性和抗原抗 体反应的高特异性的特点。
新编仪器分析第四版第三章分子发光分析法
a. 化学反应必须产生足够的化学能，且被发光物质
吸收形成电子激发态。
在紫外可见光区观察化学发光，160~420kJ· mol-1激发能。 化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。
b. 处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回基态
45
2.化学发光效率
化学发光效率CL
激发态分子的产率
发射的光子数 CL Ce em 参加反应的分子数 激发态分子数 发射的光子数 参加反应的分子数 激发态分子数
第三章 分子发光分析法
1
第一节 概述 分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来 的分析方法很为非自发光分析法。
hγ
M+ 能量 →M＊
M
2
分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。
620
17
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱
18
（1）激发光谱的绘制
固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度
的变化。Fλ—纵坐标， λex(激发波长)—横坐标
光源 第一单色器 或滤光片
激发
Fλ
记录仪 荧光
固定em 荧光波长
第二单色器 或滤光片
22
镜像关系?
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3
固定ex=290nm (MAX)
1→4 1→3 1→2
4 3 2 1
S1
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
吸收形成电子激发态。
在紫外可见光区观察化学发光，160~420kJ· mol-1激发能。 化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。
b. 处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回基态
45
2.化学发光效率
化学发光效率CL
激发态分子的产率
发射的光子数 CL Ce em 参加反应的分子数 激发态分子数 发射的光子数 参加反应的分子数 激发态分子数
第三章 分子发光分析法
1
第一节 概述 分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来 的分析方法很为非自发光分析法。
hγ
M+ 能量 →M＊
M
2
分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。
620
17
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱
18
（1）激发光谱的绘制
固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度
的变化。Fλ—纵坐标， λex(激发波长)—横坐标
光源 第一单色器 或滤光片
激发
Fλ
记录仪 荧光
固定em 荧光波长
第二单色器 或滤光片
22
镜像关系?
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3
固定ex=290nm (MAX)
1→4 1→3 1→2
4 3 2 1
S1
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
分子发光分析
荧光强度和荧光光谱不同
26
27
3、荧光猝灭
定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子
的相互作用引起荧光强度降低的现象 碰撞猝灭荧激光发分单子重以态无的辐荧射光跃分迁子的与方猝式灭回剂到分基子态相碰撞
静态猝灭 荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光
的络合物
类型 转入三重态的猝灭 溶解氧与荧光物质 发生电子转移反应的猝灭 猝灭剂与荧光物质
2. 荧光与有机化合物结构的关系 （1）跃迁类型
实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历 激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射 跃迁，再发生 跃迁而得到荧光。 （2）共轭效应 实验证明，容易实现激发 的芳香族化合物 容易发生荧光，增加体系的共轭度荧光效率一般 也将增大，主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光 系数，有利于产生更多的激发态分子
4
2．分子内的光物理过程
其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态
T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。
V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。
5
非辐射能量传递过程；
S1
S2
T1
S0 吸光1
吸光2
振动弛豫:
在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的
1．如何获得较强的磷光
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级
→基态， T1 → S0跃迁；
电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
增加试样的刚性:
低温冷冻
固体磷光法：
吸附于固相载体（滤纸）
分子缔合物的形成：
加入表面活性剂等
重原子效应：
加入含重原子的物质，如银盐等
分子发光分析法与分子
分子发光分析法与分子
分子发光分析法是一种分子生物学分析技术，该技术利用激发和荧光等光学原理，可准确、灵敏地检测某一特定识别序列的DNA或RNA，根据检测结果用于病原
体的鉴定、对感染过程的追踪及毒素的检测等方面的实验。
首先，分子发光分析是一种特殊的酶联免疫吸附实验，通过向样品中添加放射
性标记的双链DNA探针，由特定酶解离双链，探针与核酸结合，可以检测出特定序列的DNA或RNA。
使用这一技术，可以追踪影响基因表达和变异的基因或基因产物。
其次，分子发光分析法还可以用于检测DNA片段和品种变异，从而便于理解特
定基因之间的关系，以及定义物种在进化过程中的节点。
通过研究其他物种的变化，可以让科学家更好地了解人类的进化和免疫过程。
综上所述，分子发光分析法在病原体鉴定、追踪感染过程、毒素检测和基因变
异检测等科学研究中发挥着重要作用。
同时，由于分子发光分析法检测精准、信息丰富，已经成为全球多学科研究的重要手段之一。
分子发光分析法概况课件
分子发光分析法的优缺点
优点
高灵敏度
分子发光分析法通常具 有很高的灵敏度，能够 检测出低浓度的目标物
。
选择性
某些发光分子可以与目 标物发生特异性反应， 从而提高分析的选择性
。
操作简便
分子发光分析法通常操 作简单，所需仪器设备 相对简单，便于现场快
速检测。
缺点
背景干扰
发光分析法容易受到环 境背景光的影响，如日 光、荧光等，导致检测
01
02
研发能够延长发光分子寿命 的技术，以减少检测过程中
的误差和不确定性。
03
04
克服背景干扰
研究和发展能够有效排除背 景光干扰的技术和方法，以 提高检测的稳定性和准确性
。
拓展应用领域
进一步探索发光分析法在环 境监测、生物医药、食品安 全等领域的应用，以满足更
广泛的需求。
06 结论
总结分子发光分析法的概况与重要性
结果不稳定。
发光衰减
某些发光分子的发光强 度会随时间衰减，影响 检测的准确性和稳定性
。
成本较高
某些高灵敏度的发光分 子和仪器设备成本较高 ，限制了其在某些领域
的应用。
未来发展方向与挑战
提高灵敏度和选择性
延长发光寿命
进一步研发具有更高灵敏度 和选择性的发光分子，以满 足更低检测限和更高准确性
的需求。
新型的分子发光分析方法和技术不断 涌现，如荧光免疫分析、荧光偏振免 疫分析、时间分辨荧光免疫分析等。
02
分子发光分析法的基本原理
分子发光的过程与机制
01
分子发光是指分子吸收能量后，由基态跃迁至激发态，再由激 发态回到基态时释放光子的过程。
02
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① △L=±1，②△S=0，③△J=0，±1，但当
J=0 时，△J=0 的跃迁是不允许的。
不符合光谱选择定则的跃迁叫禁戒跃迁。若
两光谱项之间为禁戒跃迁，处于较高能级的原子
具有较长的寿命，原子的这种状态称为亚稳态。
三重态能级低于单重 态(Hund规则)
激发单重态：分子吸收能 量，电子自旋仍然配对， 为单重态，称为激发单 重态，以S1，S2…表示
激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三 重态，以T1，T2….表示。
基态：电子自旋配对， 多重度=2s+1=1，为单 重态，以S0表示。
图6.1 分子内的光物理过程
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或
无辐射跃迁方式再回到基态。辐射跃迁主要涉及
到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则
第6章 分子发光分析法
(Molecular Luminescence Analysis)
第6章 红外吸收光谱法
6.1 荧光分析法
Molecular Fluorescence Analysis
6.2 磷光分析法
Molecular phosphorescence Analysis
6.3化学发光分析法
分子发光：处于基态的分子吸收能量 (电、热、化学和光能等)被激发至激发态， 然后从不稳定的激发态返回至基态并发射 出光子，此种现象称为发光。 发光分析包括荧光、磷光、化学发光、
应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具 普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧
光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。
紫外可见分光光度法的特点
(一) 灵敏度高
吸光光度法测定物质的浓度下限(最 低浓度)一般可达1~10-3 %的微量组分。 对固体试样一般可测到10-4 ~10-5%的痕 量组分。如果对被测组分事先加以富集，
是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛 豫(VR)、内部转移(IR)、系间窜跃(IX)及外部转
移(EC)等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，
与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环
境等因素有关。
（二） 去活化过程(Deactivation) 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射 跃迁等去活化过程返回至基态。这些过程包括：
S1
S2
内转移
T1
S0
吸光1
吸光2
荧光、磷光 能级图
3)荧光发射
处于第一激发单重态(S1)的电子跃迁至
基态各振动能级(S0)时，将得到最大波长为 3的荧光。 注意： 基态中也有振动驰豫跃迁。很明显， 3的波长较激发波长1或2都长，而且不论 电子开始被激发至什么高能级，最终将只 发射出波长为3的荧光。荧光的产生在10-7 -10-9s内完成。
S1
系间窜跃
S2 T1
S0
吸光1
吸光2 荧光3
荧光、磷光 能级图Fra bibliotek5)外转换 (External Conversion，EC)
S1
S2
T1
S0
吸光1
吸光2 荧光
荧光3
荧光、磷光 能级图
4)系间窜跃 指不同多重态间的无辐射跃迁， 例如S1→T1就是一种系间窜跃。通常， 发生系间窜跃时，电子由S1的较低振
动能级转移至T1的较高振动能级处。
有时，通过热激发，有可能发生
T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生
延迟荧光的机理。
磷光由单重激发态先过渡到三重激发态，然
后由三重激发态向基态跃迁向基态跃迁产生。 化学发光是化学反应物或反应产物受反应释 放的化学能激发而产生的光辐射。
光谱项与光谱支项
当n, L, S三个量子数确定之后，原子能级 就基本确定了。
用n、L、S三个量子数描述原子能级的光
谱项（n2S+1L）。 L与S相互作用，可产生2S+1个能级稍微 不同的分裂，是产生光谱多重线的原因。 M=2S+1叫做谱线的多重性。
生物发光等。物质吸收光能后所产生的光
辐射称之为荧光和磷光。
6.1 荧光分法
Molecular Fluorescence Analysis
一、概述
分子荧光分析法是根据物
质的分子荧光光谱进行定性，
以荧光强度进行定量的一种分
析方法。
分子发光光谱
分子发光光谱包括荧光光谱、磷光光谱和
化学发光光谱。
荧光和磷光为光致发光，是物质的基态分子 吸收一定波长范围的光辐射激发至单重激发态， 当其由激发态回到基态时产生的二次辐射。 荧光由单重激发态向基态跃迁产生。
习惯上将多重性为1、2、3的光谱项分别
称为单重态、双重态、三重态。
荧光分析的特点：
灵敏度高：视不同物质，检测下限在
0.10.001g/mL 之间。比 UV-Vis 的灵敏度高得
多。 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱
定性。
结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、
光强、荧光量子效率、荧光寿命等。
1)振动弛豫
(Vibrational Relaxation，VR)
在液相或压力足够高的气相中，
处于激发态的分子因碰撞将能量以热 的形式传递给周围的分子，从而从高
振动能层失活至低振动能层的过程，
称为振动弛豫。
S1
S2
振动弛豫
T1
在同一 电子能级中， 电子由高振 动能级转至 低振动能级，
S0
吸光1
吸光2
荧光、磷光 能级图 → 振动弛豫
而将多余的 能量以热 的形式发出。
2)内转化
( Internal Conversion，IC ) 对于具有相同多重度的分子，若 较高电子能级的低振动能层与较低电子 能级的高振动能层相重叠时，则电子可
在重叠的能层之间通过振动耦合产生无
辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。
灵敏度还可以提高1-2个数量级。
二、基本原理
(一) 分子荧光的产生 处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，
当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重
态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃 迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道 上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区别在于电子 自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子
具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s; 而三重态 分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4~1s以上(通 常用S和T分别表示单重态和三重态)。
光谱选择定则
根据量子力学的原理，电子的跃迁不能在任 意两个能级之间进行，而必须遵循一定的“选择 定则”，这个定则是