基因工程基本操作的四个步骤
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基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
请阅读P9第一和二两 1、目的基因段主要是指_编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因___
2、获取目的基因的常用方法有哪些?
（1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成
① 概念：PCR全称为_多__聚__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物_体__外_复制特__定__D_N_A_片__段__的核酸合成技术
②原理：_D_N_A_双__链__复__制
③条件：_已__知__基__因__的__核__苷__酸__序__列____、 _四__种__脱__氧__核__苷__酸__、__一__对__引__物___ (做启动子)、
四种脱氧核苷酸dNTP 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 一对引物 温度控制
④方式：以_指__数__方式扩增，即_2_n __（n为扩增循 环的次数）
⑤结果：
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑥过程：
a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板 在热作用下，_氢__键__断裂，形成__单__链__D_N_A___
__D_N_A_聚__合__酶__.前提条件：
④方式：以_指__数__方式扩增，即__2_n_（n为扩增循 环的次数）
⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
供体细胞中的DNA 限制酶
许多DNA片段
与载体连接载入
运载体 导入
受体细胞 外源DNA扩增
（基因组文库）
目的基因 分离
产生特定性状
2.基因文库的构建方法与目的基因的获得
目的基因的mRNA
②反转录法：
以目的基因转录成的 信使RNA为模板，反转 录成互补的单链DNA， 然后在酶的作用下合成双 链DNA，从而获得所需 的基因。
b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部___双__链___。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的__D_N_A_链___。
利用PCR技术扩增目的基因
(二)利用PCR技术扩增目的基因 选修1 P60
专一性最强
仅限于合成核苷酸 对较少的简单基因
思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物 体内提取不行吗?
PCR技术—聚合酶链式反应
概念：
是一项在生物体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术
原理：
DNA双链复制的基本原理
PCR扩增仪
前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列
条件： 模板DNA (含有目的基因)
蛋白质的氨基酸序列 推测
mRNA的核苷酸序列
推测 结构基因的核苷酸序列
化学合成 目的基因
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？
优点
缺点
鸟枪法
操作简便 广泛使用
工作量大，盲目， 分离出来的有时并 非一个基因
反转录法
操作过程麻烦， 专一性强 mRNA很不稳定，要
求的技术条件较高
根据已知氨基 酸合成DNA法
(一)从基因文库中获取目的基因
1.基Biblioteka Baidu文库
将含有某种生物不同基因的许多
DNA片断，导入到受体菌的群体中，各
个受体菌分别含有这种生物的不同基因，
称为基因文库
基因文库
基因组文库（某物 种全部基因 ）
部分基因文库 （如:cDNA文库）
(一)从基因文库中获取目的基因
2.基因文库的构建方法与目的基因的获得 ①鸟枪法： (直接分离法)
反转录酶
杂交双链
(单链RNA/单链DNA)
核酸酶H
单链DNA DNA聚合 酶
双链DNA(目的基因)
（cDNA文库）
2.基因文库的构建方法与目的基因的获得 ③根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
根据已知蛋白质 的氨基酸序列，推测 出相应的信使RNA序 列，然后按照碱基互 补配对原则，推测出 它的结构基因的核苷 酸序列，再通过化学 方法，以单核苷酸为 原料合成目的基因。
2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
请阅读P9第一和二两 1、目的基因段主要是指_编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因___
2、获取目的基因的常用方法有哪些?
（1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成
① 概念：PCR全称为_多__聚__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物_体__外_复制特__定__D_N_A_片__段__的核酸合成技术
②原理：_D_N_A_双__链__复__制
③条件：_已__知__基__因__的__核__苷__酸__序__列____、 _四__种__脱__氧__核__苷__酸__、__一__对__引__物___ (做启动子)、
四种脱氧核苷酸dNTP 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 一对引物 温度控制
④方式：以_指__数__方式扩增，即_2_n __（n为扩增循 环的次数）
⑤结果：
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
⑥过程：
a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板 在热作用下，_氢__键__断裂，形成__单__链__D_N_A___
__D_N_A_聚__合__酶__.前提条件：
④方式：以_指__数__方式扩增，即__2_n_（n为扩增循 环的次数）
⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
供体细胞中的DNA 限制酶
许多DNA片段
与载体连接载入
运载体 导入
受体细胞 外源DNA扩增
（基因组文库）
目的基因 分离
产生特定性状
2.基因文库的构建方法与目的基因的获得
目的基因的mRNA
②反转录法：
以目的基因转录成的 信使RNA为模板，反转 录成互补的单链DNA， 然后在酶的作用下合成双 链DNA，从而获得所需 的基因。
b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部___双__链___。
c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的__D_N_A_链___。
利用PCR技术扩增目的基因
(二)利用PCR技术扩增目的基因 选修1 P60
专一性最强
仅限于合成核苷酸 对较少的简单基因
思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物 体内提取不行吗?
PCR技术—聚合酶链式反应
概念：
是一项在生物体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术
原理：
DNA双链复制的基本原理
PCR扩增仪
前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列
条件： 模板DNA (含有目的基因)
蛋白质的氨基酸序列 推测
mRNA的核苷酸序列
推测 结构基因的核苷酸序列
化学合成 目的基因
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？
优点
缺点
鸟枪法
操作简便 广泛使用
工作量大，盲目， 分离出来的有时并 非一个基因
反转录法
操作过程麻烦， 专一性强 mRNA很不稳定，要
求的技术条件较高
根据已知氨基 酸合成DNA法
(一)从基因文库中获取目的基因
1.基Biblioteka Baidu文库
将含有某种生物不同基因的许多
DNA片断，导入到受体菌的群体中，各
个受体菌分别含有这种生物的不同基因，
称为基因文库
基因文库
基因组文库（某物 种全部基因 ）
部分基因文库 （如:cDNA文库）
(一)从基因文库中获取目的基因
2.基因文库的构建方法与目的基因的获得 ①鸟枪法： (直接分离法)
反转录酶
杂交双链
(单链RNA/单链DNA)
核酸酶H
单链DNA DNA聚合 酶
双链DNA(目的基因)
（cDNA文库）
2.基因文库的构建方法与目的基因的获得 ③根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
根据已知蛋白质 的氨基酸序列，推测 出相应的信使RNA序 列，然后按照碱基互 补配对原则，推测出 它的结构基因的核苷 酸序列，再通过化学 方法，以单核苷酸为 原料合成目的基因。