实验3_硝酸还原酶活性测定
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1）理解硝酸还原酶的特性； 2）掌握硝酸还原酶活性测定方法。
2. 实验原理
1）NR是诱导酶
在取样前一天外施50mM KNO3 或NaNO3溶 液、光照培养幼苗，诱导硝酸还原酶的产生。
2）NO2-产生
NO3 + NADH +
-
NR + H
NO2- + NAD+ + H2O
* 测定反应溶液中NO2- 含量的增加，即表现NR
3）试剂
• A液：
磷酸缓冲液：水： DNP溶液：蔗糖溶液＝5： 5： 1： 1
• B液： 磷酸缓冲液：KNO3： DNP溶液：蔗糖溶液＝ 5： 5： 1： 1 • 磺胺试剂 • α-萘胺试剂
4. 实验步骤
1） 水(ck)和 KNO3 （N）处理的小麦叶片各取2份
（新鲜叶片中段），用蒸馏水洗净、搽干，剪
• 硝酸盐的还原由硝酸还原酶(nitrate reductase) 催化。
硝酸还原酶
• 硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种底物诱导酶。
• 诱导酶(induced enzyme)
植物体本来不含有，但在特定的外来物质(如底物)
的影响下诱导形成的酶
NO3- 诱导的大麦根系和地上部分硝酸还原酶活性变化
1. 实验目的
表1 硝酸还原酶的活性
处理 H2O（ck）
A液 吸光度 ODB-ODA [ NO2- ](unit) NR活性(unit) B液
KNO3（N）
A液 B液
[ NO2- ] （µmol/ml）= 0.0026＋0.359 OD540
百度文库 注意事项
1）摇晃直至叶段沉于溶液中
2）磺胺试剂和 α-萘胺试剂（加入时注意顺序）
成1 cm小段，每份称取0.3克；将4份（ck、N） 叶段分别置于含有10 ml A、B（ KNO3）溶液 的两只试管中，即ckA、ckB、NA和NB四管； 2） 将四只试管放在真空干燥器中抽气30分钟，放 气后摇晃直至叶段沉于溶液中；
两种处理的小麦幼苗叶 片中段各取0.3g
水(ck)
A液 B液
KNO3 （N）
钟；
4）立即分别吸取1ml反应液，各加入2ml磺胺试
剂，摇匀，再加2ml α-萘胺试剂（注意顺序），
用漩涡仪混合摇匀，25 ℃温浴反应10分钟, 取 出后桌面静置15分钟； 5）取A液或B液1ml代替反应液，加入2ml磺胺试 剂和2ml α-萘胺试剂，作为对照管，在540 nm
测定样品的吸光值。
5. 实验结果记录
4）硝酸还原酶活性计算方法
NR酶活性
（ µmol NO2 /h•gfw）
-
=
[ NO2- ] × 5ml/1ml×10ml （鲜重g×0.5h）
3. 材料与方法
1）植物材料
两种处理的小麦幼苗
– 水（ck）
– KNO3 （20000Lux，24hr，记作N）
2）仪器设备
分光光度计；天平；恒温水浴锅；真空抽气 泵；剪刀；移液管；吸耳球；温箱；涡旋仪
活性的大小。
3）NO2- 含量测定— 磺胺比色法。
• NO2-与磺胺在酸性溶液中NO2-形成重氮盐，再与 α-萘胺偶联形成紫红色的偶氮染料，可以用分光
光度计测定OD540。
• 当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与
NO2-含量成直线关系。 NO2- 含量标准曲线：
[ NO2- ] （µmol / ml）= 0.0026＋0.359OD540
3）加入磺胺和α-萘胺后要混合摇匀，静置30分 钟 4）分光光度计的使用
思考题
1. 为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进 行？ 2. 公式中的0.5 h 指抽气时间还是暗藏保温时间？ 3. B液中的各种成分在本次实验中有什么作用？
实验五 叶绿素的提取、理化性质和含 量测定 （p130－136）
A液 B液 放气后摇晃直至叶 段沉于溶液中
10 ml
抽气30分钟 25～30℃温箱中黑暗保温30分钟 取A液或B液1ml 代替反应液作为 对照管
取1ml反应液+2ml磺胺试剂+2ml α-萘胺试剂 注意加液顺序 混匀 25 ℃温箱反应5分钟 取出后桌面静置15分钟 540 nm测定样品的吸光值
3）将4只试管置于25～30℃温箱中黑暗保温30分
实验三
硝酸还原酶活性测定 （p124-127）
一、标准曲线制作 二、硝酸还原酶活性测定
植物对氮素的吸收和利用
以无机氮为主： 硝态氮（NO3-）和铵态
氮（NH4+）
– 铵态氮（NH4+）可以直接被植物利用 – 硝态氮（NO3-）在植物体内还原成铵态 氮才能被利用
硝酸盐的还原
• NO3－中的N为高度氧化态，而细胞组分中的N均 呈高度还原态，被吸收的NO3- 需经过还原后才能 被利用
2. 实验原理
1）NR是诱导酶
在取样前一天外施50mM KNO3 或NaNO3溶 液、光照培养幼苗，诱导硝酸还原酶的产生。
2）NO2-产生
NO3 + NADH +
-
NR + H
NO2- + NAD+ + H2O
* 测定反应溶液中NO2- 含量的增加，即表现NR
3）试剂
• A液：
磷酸缓冲液：水： DNP溶液：蔗糖溶液＝5： 5： 1： 1
• B液： 磷酸缓冲液：KNO3： DNP溶液：蔗糖溶液＝ 5： 5： 1： 1 • 磺胺试剂 • α-萘胺试剂
4. 实验步骤
1） 水(ck)和 KNO3 （N）处理的小麦叶片各取2份
（新鲜叶片中段），用蒸馏水洗净、搽干，剪
• 硝酸盐的还原由硝酸还原酶(nitrate reductase) 催化。
硝酸还原酶
• 硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种底物诱导酶。
• 诱导酶(induced enzyme)
植物体本来不含有，但在特定的外来物质(如底物)
的影响下诱导形成的酶
NO3- 诱导的大麦根系和地上部分硝酸还原酶活性变化
1. 实验目的
表1 硝酸还原酶的活性
处理 H2O（ck）
A液 吸光度 ODB-ODA [ NO2- ](unit) NR活性(unit) B液
KNO3（N）
A液 B液
[ NO2- ] （µmol/ml）= 0.0026＋0.359 OD540
百度文库 注意事项
1）摇晃直至叶段沉于溶液中
2）磺胺试剂和 α-萘胺试剂（加入时注意顺序）
成1 cm小段，每份称取0.3克；将4份（ck、N） 叶段分别置于含有10 ml A、B（ KNO3）溶液 的两只试管中，即ckA、ckB、NA和NB四管； 2） 将四只试管放在真空干燥器中抽气30分钟，放 气后摇晃直至叶段沉于溶液中；
两种处理的小麦幼苗叶 片中段各取0.3g
水(ck)
A液 B液
KNO3 （N）
钟；
4）立即分别吸取1ml反应液，各加入2ml磺胺试
剂，摇匀，再加2ml α-萘胺试剂（注意顺序），
用漩涡仪混合摇匀，25 ℃温浴反应10分钟, 取 出后桌面静置15分钟； 5）取A液或B液1ml代替反应液，加入2ml磺胺试 剂和2ml α-萘胺试剂，作为对照管，在540 nm
测定样品的吸光值。
5. 实验结果记录
4）硝酸还原酶活性计算方法
NR酶活性
（ µmol NO2 /h•gfw）
-
=
[ NO2- ] × 5ml/1ml×10ml （鲜重g×0.5h）
3. 材料与方法
1）植物材料
两种处理的小麦幼苗
– 水（ck）
– KNO3 （20000Lux，24hr，记作N）
2）仪器设备
分光光度计；天平；恒温水浴锅；真空抽气 泵；剪刀；移液管；吸耳球；温箱；涡旋仪
活性的大小。
3）NO2- 含量测定— 磺胺比色法。
• NO2-与磺胺在酸性溶液中NO2-形成重氮盐，再与 α-萘胺偶联形成紫红色的偶氮染料，可以用分光
光度计测定OD540。
• 当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与
NO2-含量成直线关系。 NO2- 含量标准曲线：
[ NO2- ] （µmol / ml）= 0.0026＋0.359OD540
3）加入磺胺和α-萘胺后要混合摇匀，静置30分 钟 4）分光光度计的使用
思考题
1. 为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进 行？ 2. 公式中的0.5 h 指抽气时间还是暗藏保温时间？ 3. B液中的各种成分在本次实验中有什么作用？
实验五 叶绿素的提取、理化性质和含 量测定 （p130－136）
A液 B液 放气后摇晃直至叶 段沉于溶液中
10 ml
抽气30分钟 25～30℃温箱中黑暗保温30分钟 取A液或B液1ml 代替反应液作为 对照管
取1ml反应液+2ml磺胺试剂+2ml α-萘胺试剂 注意加液顺序 混匀 25 ℃温箱反应5分钟 取出后桌面静置15分钟 540 nm测定样品的吸光值
3）将4只试管置于25～30℃温箱中黑暗保温30分
实验三
硝酸还原酶活性测定 （p124-127）
一、标准曲线制作 二、硝酸还原酶活性测定
植物对氮素的吸收和利用
以无机氮为主： 硝态氮（NO3-）和铵态
氮（NH4+）
– 铵态氮（NH4+）可以直接被植物利用 – 硝态氮（NO3-）在植物体内还原成铵态 氮才能被利用
硝酸盐的还原
• NO3－中的N为高度氧化态，而细胞组分中的N均 呈高度还原态，被吸收的NO3- 需经过还原后才能 被利用