基因工程原理-第5章重组基因导入受体细胞
28548基因工程课程考试说明
28548 基因工程课程考试说明一、课程使用教材、大纲基因工程课程使用的教材为《基因工程》，龙敏南等编著，科学出版社，2010年版。
二、本课程的试卷题型结构及试题难易度1.试卷题型结构表2．试卷按识记、领会、简单应用、综合应用四个认知层次命制试题，四个认知层次在试卷中所占的比例大致分别为：识记占20％、领会占25%、简单应用占35％、综合应用占20％。
3．试卷难易程度大致可分为“容易、中等偏易、中等偏难、难”。
根据课程的特点，每份试卷中，不同难易程度试题所占的分数比例大致依次为易占30分、中等偏易30分、中等偏难20分、难占20分。
三、各章内容分数的大致分布四、各章内容的重、难点五、各题型试题范例及解题要求1.单项选择题（每小题1分，共20分）解题要求：在下列每小题的四个备选答案中，选出一个正确答案，并将其字母标号填入题干的括号内。
范例：转化大肠杆菌的方法中，转化效率最高的是（）A.Ca2＋诱导大肠杆菌转化法B.电穿孔转化法C.三亲本杂交接合转化大肠杆菌D.转化效率相同解答：B2.填空题（每小题1分，共10分）解题要求：在下列每小题的空格中填入正确答案。
范例：DNA序列测定的方法主要有Sanger发明的DNA双脱氧链终止测序法和Maxam、Gilbert发明的两种。
解答：化学降解测序法3.名词解释（每小题3分，共15分）解题要求：直接写出相关术语的涵义，不要展开说明。
范例：亚克隆解答：将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆，（1分）一般将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后，将所得各片段分别重组到载体上，再转化宿主细胞，通过对转化细胞的表型鉴定或其他方法来确定基因所在的位置。
（2分）4.简答题（每小题5分，共35分）解题要求：简要回答相关问题要点，不用阐述。
范例：简述噬菌体表面展示技术。
解答：将外源DNA片段插入丝状噬菌体基因组的一个外被蛋白基因中，如果两者读码框结构保持一致，这个外源DNA片段所编码的，并显示在噬菌体的表面。
目的基因导入受体细胞
（6）利用遗传选择标记筛 选哺乳动物转基因细胞
• 在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移 酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基 因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。
• 常用的标记基因还有： • -- 胸腺核苷激酶基因（tk）、 • -- 二氢叶酸还原酶基因（dhfr） • -- 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因
斑点杂交法
狭缝式点样器
斑点及狭缝印迹杂交的特点
1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量
4、菌落（或噬菌斑）原位杂交
基本原理 直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上 溶菌、变性 DNA暴露并于滤膜原位结合
第六章 目的基因导入受体细胞
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程 中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必 须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选 出期待的克隆子。
• 概念
–克隆子 –转化子 –重组子
将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的 受体细胞统称为克隆子。
把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化 子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为 转化子 ），现在这两者有通用的趋向。
含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组 子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组 子。
经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得 所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。
一、遗传表型直接筛选法
• （一）根据载体选择标记初步筛选转化子
• 在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分 子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细 胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性， 作为筛选转化子的依据。
基因工程复习(含答案)
基因工程复习题一、名词解释：（10～20%）基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶得Star活性PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统原位杂交：将细胞或组织得核酸固定保持在原来得位置上，然后用探针与之杂交得一种核酸分子杂交技术，该方法可较好地反映目得基因在细胞或组织中得分布与表达变化。
粘性末端：双链DNA被限制性内切酶切割后，形成得两条链错开几个碱基，而不就是平齐得末端。
Northern印迹杂交：将RNA进行变性电泳后，再转移到固相支持物上与探针杂交得一种核酸分子杂交技术，可用于检测目得基因得转录水平。
转位：一个或一组基因片段从基因组得一个位置转移到另一个位置得现象。
基因工程：在体外，用酶学方法将各种来源得DNA与载体DNA连接成为重组DNA，继而通过转化与筛选得到含有目得基因得宿主细胞，最后进行扩增得到大量相同重组DNA分子得过程称为基因工程，又称基因克隆、DNA克隆与重组DNA等。
目得基因：基因工程中，那些被感兴趣得、被选作研究对象得基因就叫作目得基因。
连接器：人工合成得一段含有某些酶切位点寡核苷酸片段，连接到目得基因得两端，便于基因重组中得切割与连接。
转化：受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变得过程。
停滞效应：PCR中后期，随着目得DNA扩展产物逐渐积累，酶得催化反应趋于饱与，DNA 扩增产物得增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。
逆转录PCR：以mRNA为原始模板进行得PCR反应。
PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板，引物，4种dNTP与耐热DNA聚合酶存在得条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间得DNA区段地酶促合成反应。
α-互补（α-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中，插入了lac启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸得核苷酸序列（又称α-肽），该序列不能产生有活性得β-半乳糖苷酶。
动物基因工程—目的基因导入受体细胞
目的基因导入受体细胞
二、基因导入方法
（1）显微注射法 利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化
方法。 一般是微管吸取供体DNA溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将
DNA注入进去。此法常用于转基因动物的基因转移。
将外源基因用微玻璃管在显微镜下注射入受精卵细胞核中
目的基因导入受体细胞
一、受体细胞（receptor cell）
作为基因工程的宿主细胞必须具备的条件： 便于重组DNA分子导入；能使重组DNA分子稳定 存在；便于便于重组体的筛选；遗传稳定性高，易于扩 大培养；安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生 物污染；利于外源基因蛋白产物高效表达。
目的基因导入受体细胞
入的外源基因进行遗传分析。
目的基因导入受体细胞
一、受体细胞（receptor cell）
原核生物受体细胞缺点
原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基 因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。
原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质 的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。
二、基因导入方法
（4）基因枪法
又称微弹轰击法，是利用高速运行的金属颗粒（微弹，1um）轰击细胞时能进入细胞内的 现象，将包裹在金属颗粒（钨或金颗粒）表面的外源DNA分子随之带入细胞进行表达的基 因转化方法。
基本做法：先将外源DNA溶液与钨或金颗粒（直径0.5-um）共同保温，使DNA吸附于金 属颗粒表面，然后放电加速金属颗粒，使之以400m/s的速度直接喷射受体细胞，外源 DNA随金属颗粒进入细胞内部。
具有趋化性的农杆菌移向这类植物受伤细胞，并将其Ti质粒上的T-DNA转移至细 胞内部。根据这一性质，将待转移的目的基因组入Ti质粒载体，通过农杆菌介导进入 植物细胞，与染色体DNA整合，得以稳定维持或表达。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。
4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。
②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。
③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。
5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。
大学《基因工程学》教学大纲
《基因工程学》课程教学大纲（Genetic Engineering）一、课程说明课程编码：02200200课程总学时（理论总学时/实践总学时）：48（48/0）周学时（理论学时/实践学时）：4（4/0）学分：31．课程性质：专业必修课。
2．适用专业与学时分配：适用生物技术专业。
教学内容与学时分配3．课程教学目的与要求：本课程的授课对象是生物技术专业的本科生。
课程简介：《基因工程》是生物技术专业的专业必修课程。
其以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。
基因工程兴起于20世纪70年代初，它的问世带动了生物技术的兴起和发展，是现代生物技术的核心内容。
基因工程课程的主要内容包括基因的分离、基因的克隆、基因的表达、植物基因工程、动物基因工程、药物基因工程和基因治疗等。
它是生命科学学院生物技术专业本科生的主干专业课程之一，它是生物工程（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程）中最重要的课程，其它三大工程是建立在基因工程基础之上的，同时也为生物技术制药等后继学科奠定了重要的理论基础。
课程目标：设置本课程是为了让生物技术专业的学生理解和掌握基因工程的技术原理，通过本课程学习，掌握基因操作的工具酶，基因克隆常用载体，目的基因的分离与合成，重组体的构建，重组体向宿主细胞的导入，重组体克隆的筛选与鉴定以及克隆基因的表达，同时了解基因工程在生物学领域中的应用与发展前景。
对学生达到毕业要求贡献如下：1）了解基因工程学的历史、发展和前沿知识。
2）掌握基因工程学的基础理论、基本知识和基本技能；教学要求：学完基因工程学后，学生将具备以下能力：1）具有良好的自学能力；2）综合运用所掌握的基因工程学理论知识和技能、从事生物科学及其相关领域科学研究的能力。
4．本门课程与其它课程关系：先修课程为生物化学、微生物学、分子生物学、细胞学等，具备基础理论知识及实验能力是基因工程学课程的基础。
基因工程 第五章目的基因的获取
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
基因重组
发生 时间 及原 因 条件
意义
发生 可能
思维拓展 不同生物的可遗传变异来源： 病毒—— 基因突变 原核生物—— 基因突变
真核生物—— 基因突变、基因重组、 染色体变异
最新款的摩托车
谁能告诉我这是ＷＨＡＴ？
谁能告诉我这是ＷＨＡＴ？
第2节 基因工程及其应用
基因工程：即 基因拼接技术或DNA重组技术 。
1、常用的受体细胞： 大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、动植 物细胞等 2、常用微生物作受体细胞的原因： 微生物增殖快、代谢快、目的产物多
第四步:
目的基因的检测和表达
一般检测： 标记基因是否表达
1、基因工程与作物育种
抗虫转基因植物
生长快、肉质好的转基因 鱼(中国)
乳汁中含有人生长激素的 转基因牛(阿根廷)
通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某 种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种 定向 地改造生物的 遗传性状 。 生物的细胞里，
原 理： 基因重组 操作水平：DNA分子水平 结 果：定向地改造生物的遗传性状， 获得人类所需要的品种。
1、基因工程的
“ ”
来源:
指“
限制性核酸内切酶 ”
主要存在于微生物
转鱼抗寒基 因的番茄
转黄瓜抗青枯病基因的甜椒
2、基因工程与药物研制
许多药品的生产 是从生物组织中提取 的。受材料来源限制 产量有限，其价格往 往十分昂贵。
我国生产的部分基因 工程疫苗和药物
微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工 业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导 入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但 能解决产量问题，还能大大降低生产成本。
转基因食品
安全吗?!
用转基因的植物生产药物
智慧树答案基因工程原理知到课后答案章节测试2022年
第一章1.基因工程发展过程中技术上的三个重大发现（）。
答案:限制性内切酶和DNA连接酶的发现;载体的使用;逆转录酶及抗性标记的发现2.世界上第一个成功的基因工程实验是使用的是什么的DNA（）。
答案:λ噬菌体的DNA;猿猴病毒SV40DNA3.成功导入外源基因就意味着基因工程实验的成功。
（）答案:错4.基因工程的两个基本特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达。
( )答案:对5.孟德尔是现代遗传学的奠基人，他发现了基因的连锁和互换定律。
（）答案:错第二章1.PCR在循环几次时才会出现两个引物之间的目的片段（）。
答案:3;2.PCR反应中，所设计的引物长度一般为（）。
答案:16-30bp3.RACE技术可用于（）。
答案:扩增基因末端序列4.DNA提取时，使DNA沉淀的物质是（）。
答案:酒精5.为了防止RNA降解，所用的枪头管子等均需用（）处理。
答案:DEPC水第三章1.Klenow酶于DNA聚合酶相比前者丧失了（）。
答案:5’–3’ 外切酶活性2.下列对逆转录酶描述正确的是（）。
答案:RNA指导的DNA聚合酶3.Ⅱ型限制性核酸内切酶有内切酶和甲基化酶两种酶活性且经常识别回文序列。
（）答案:错4.为了防止DNA的自我环化可用碱性磷酸酶除去DNA分子中的5’-磷酸集团。
（）答案:对5.大多数大肠杆菌中存在的三种位点特异性的DNA甲基化酶（）。
答案:DNA胞嘧啶甲基化酶;EcoK I甲基化酶;DNA腺嘌呤甲基化酶dam第四章1.下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大（）。
答案:酵母人工染色体YAC2.噬菌体载体能承载较大的外源DNA的片段，甚至大于自身大小的DNA片段。
（）答案:对3.柯斯质粒进入受体细胞后，可引起溶源化反应。
（）答案:错4.根据质粒在宿主细胞中的拷贝数的多少可以分为严紧控制型质粒和松弛控制性质粒。
（）答案:对5.在利用LacZ失活得到显色反应筛选法中，IPTG的作用是（）。
答案:诱导宿主α肽的合成第五章1.在cDNA技术中，所形成的发夹环可用（）去除。
基因工程的原理和技术
2、形成重组DNA分子
限制性核酸 ①用一定的_________切割 内切酶 质粒，使其出现一个切 粘性末端 口，露出____________ 。 同一种限制性核酸内切酶 ②用_____________切割 含目的基因的DNA ，使其产生_____ 相同 的粘性末端 ____________。
切口 处， ③将切下的目的基因片段插入质粒的______ DNA连接酶 ，形成了一个重组 再加入适量___________ DNA分子（重组质粒）
农杆菌转化法
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，农杆 菌中细胞中含有Ti质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过 侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物染色体 中。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农 杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后 通过植物组织培养技术，再生出转基因植株。
5、目的基因的表达
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 检测 方法—— DNA分子杂交（DNA探针） （分子水平） ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交 个体水平 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
程的叙述中，错误的是 （ A ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性核酸内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶
2．有关基因工程的叙述正确的是
(
D
)
A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可以作为运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
第一章
第二节
基因工程
基因工程的原理和技术
目的基因导入受体细胞及重组子的筛选
活化菌种，扩大培养，使其 处于对数生长后期 （OD600=0.4）
3-4 ml菌液冰水浴中10 分钟，4 ℃离心集菌
转 入 37 ℃ 水 浴 上5 min， 加入 1 ml不含选择性 药 物 的 LB 培 养 基
转入42 ℃水浴 上 2 min ， 使 感受态细胞吸 收重组DNA。
0.2 ml新制备好 的感受细胞中加 入缓冲液溶解的 重 组 DNA ， 置 于冰水浴中1 h 以上，期间轻摇 几次
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受 体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能 进入受体细胞。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含 有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或 一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所 致。因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中 筛选出来。 ■转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转 化子。 ■重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。 具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
3.各种类型受体细胞的优缺点
（1）原核细胞 ■优点 大 部 分 原 核 细 胞 没 有 纤 维 素 组 成 的 坚 硬 细 胞 壁 ， 便 于 外 源 DNA的进入。 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA 与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 基因组简单，不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外 源基因进行遗传分析。 原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料， 并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。
基因工程知识点全
基因⼯程知识点全基因⼯程概述1.什么是基因⼯程，基因⼯程的基本流程？基因⼯程（Geneticengineering）原称遗传⼯程。
从狭义上讲，基因⼯程是指将⼀种或多种⽣物体（供体）的基因与载体在体外进⾏拼接重组，然后转⼊另⼀种⽣物体（受体）内，使之按照⼈们的意愿遗传并表达出新的性状。
因此，供体、受体和载体称为基因⼯程的三⼤要素。
1.分离⽬的基因2.限制酶切⽬的基因与载体3.⽬的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分⼦转⼊合适的宿主细胞,进⾏扩增培养5.选择、筛选含⽬的基因的克隆6.培养、观察⽬的基因的表达基因⼯程的载体和⼯具酶1.基因⼯程载体必须满⾜哪些基本条件？具有对受体细胞的可转移性或亲和性。
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
具有多种单⼀的核酸内切酶识别切割位点。
具有合适的筛选标记。
分⼦量⼩，拷贝数多。
具有安全性。
2.质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？1、⾃主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3.质粒的构建（1）删除不必要的DNA区域，尽量缩⼩质粒的分⼦量，以提⾼外源DNA⽚段的装载量。
⼀般来说，⼤于20Kb的质粒很难导⼊受体细胞，⽽且极不稳定。
（2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证DNA重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产⽣负调控效应的基因，提⾼质粒的拷贝数（3）加⼊易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。
（4）在选择性标记基因内引⼊具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单⼀化，以便环状质粒分⼦经酶处理后，只在⼀处断裂，保证外源基因的准确插⼊。
（5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。
基因工程原理
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基因工程原理
基因工程(gene engineering)常和 以下名称混用
• 遗传工程(genetic engineering); • 基因克隆(gene cloning); • 分子克隆(molecular cloning); • 基因操作(gene manipulation); • 重组DNA技术(recombination DNA technique)
义指II型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌
系编号、分离顺序。 例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称 H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型； “Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新 的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
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基因工程原理
三、基因工程技术及其应用
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基因工程原理
转基因植物
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基因工程原理
转基因动 物作为生 物发生器
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基因工程原理
基因本身也是一个产业
Байду номын сангаас
５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-Ｏ
Ｈ
2. 末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA
G-3’
3’-GACGTC-5’ 3’-G
基因工程导入受体细胞的方法
基因工程导入受体细胞的方法1. 引言嘿，大家好！今天我们聊聊一个非常酷的话题——基因工程。
没错，就是那些让小鼠发光、让植物抗虫的技术，听起来就像是科幻电影里的情节吧？其实，基因工程就是通过各种方法把外来的基因导入到细胞里，让它们学会新的“技能”。
那么，具体怎么做呢？下面就带大家一起看看这其中的门道，保证你会觉得“哦，原来如此！”2. 导入方法2.1 物理方法好，首先，我们得说说物理方法。
这一类的技术就像是强行把一个新成员拖进团队。
最常见的方式就是“微注射”。
想象一下，就像给小细胞打疫苗一样，科学家用极细的针头把DNA直接注入到细胞里面。
这个过程可得小心翼翼，不然细胞可就会“抗拒”，拒绝接受你给它的礼物。
除了微注射，还有一种叫“电穿孔”的方法。
听起来很高大上，其实就是利用电流让细胞膜打开一个小缝，像是给细胞开了一个小门。
然后，外面的基因就能顺利地走进去。
这个过程就像给细胞来个“电击”，瞬间让它的反应能力提升，超有趣的！2.2 化学方法说完物理方法，咱们再聊聊化学方法。
这些方法就像是用“温柔”的方式来诱惑细胞，想让它们自愿接受新的基因。
比如，利用一些特定的化合物，把DNA包裹起来，形成小球，称为“脂质体”。
然后把这些小球送到细胞旁边，细胞一看这么可爱，二话不说就把它们给吞了，真是一举两得！还有一种常见的化学方法叫“转化”，常用在细菌细胞里。
简单说，就是用某些化学药剂把细胞膜的通透性增强，随后将DNA送进去。
这种方法的效率很高，尤其是在大规模生产的时候，简直就是细胞界的“搬运工”！3. 选择合适的受体细胞3.1 细胞类型不过，大家可能会问，基因导入用什么细胞好呢？这可不是随便选的。
不同的细胞对基因的接受能力差别很大。
有些细胞就像个“乖宝宝”，一看就知道乐意接纳新的基因；而有些细胞则特别挑剔，像是在找对象一样。
比如，哺乳动物细胞、植物细胞，甚至是细菌细胞，都是常用的“受体”。
选择合适的细胞就像选伴侣，得看个性、得看合不合适。
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转化率＝
转化子 DNA分子数
＝
Ca2+诱导大肠杆菌转化法
① 低温下使磷质层形成液晶结构， Ca2+： 使膜间核酸酶分离 ② 与DNA结合，抗DNase
（1）感受态的制备
对数生长后期的菌体 5x107个/毫升
冰浴10分钟
含CaCl2缓冲液 15分钟 含CaCl2缓 冲液
（3）筛选转化子。
（2）DNA分子转化感受态细胞
菌间接合转移的有关基因
tra。
（Vir 区）
（Con区）
出毒性。占Ti质粒 1/3。
Ori区 ——复制起始区。
外源基因
Ti质粒载体
限制性酶 切开
（1）叶盘法转化植物细胞
（2）整体植株接种转化法
人为地在整体植株上造
成创伤部位，然后把农杆菌
接种在创伤表面，使农杆菌 按照天然的感染过程在植株
体内进行侵染。获得转化的
CHO，猴肾细胞等
• 受体动物：鼠、牛、羊、鱼等
第二节 重组基因导入受体细胞
一、重组基因导入原核受体细胞
接受DNA片段
（一）转化
1928年英国学者F·Griffth在肺炎双球菌中发现的，证
明了遗传的物质基础是DNA。
转化（transformation）——重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受 体细胞稳定维持和表达的过程，转化后的受 体菌，称转化子。 转化子 细胞数
（二）植物病毒介导基因转移 DNA病毒20%
植物病毒
RNA病毒80%
花椰菜花叶病毒：双链DNA病毒
（三）化学诱导DNA直接转化 （1）多聚物介导法 聚乙二醇 多聚赖氨酸 多聚鸟苷酸
（2）脂质体介导基因转化
脂质体
（四）物理方法介导DNA直接转化 （1）基因枪转化
（2）超声波介导转化 （3）激光微束穿孔转化
立的一种DNA转化方法。
二、重组基因导入植物受体细胞 （一）土壤农杆菌介导的Ti质粒转化 将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆 菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后
通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
外植体：植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。 在继代培养时，将培养的组织切段移入新的培养基时，这 种切段也称外植体。
基因工程原理
Principle of Gene Engineering
第五章
第五章
基因工程原理
• DNA重组（限制性内切酶）
• 运输工具——基因克隆载体 • 目的基因的制备 • 目的基因导入受体细胞 • 外源基因的表达 • 基因工程的应用
第五章 重组基因导入受体细胞
第一节 受体细胞
受体细胞（receptor cell），又称宿主细胞或寄主细胞，是能
地高辛：异羟基洋地黄毒苷，强心素，拉诺辛，Cardiox，Cardoxin，Cedoxin
连接臂
地高辛
dUTP
（3） 萦光素标记探针：用萦光素标记核酸、抗生物素蛋白
或抗地高辛抗体。
萦光物质异硫氰酸萦光素（黄绿色）
罗丹明（红色）
羟基香豆素（兰色）
3. 标记探针的方法
（1） 切口平移标记法
（2） 随机引物标记法
（二） 免疫沉淀测定法（Immunoprecipitation, IP）
（三） 转译筛选法
五、PCR筛选法
一、遗传表型直接筛选
（一）利用载体选择性标记筛选转化子
1. 抗药性标记 氨苄青霉素 氯霉素 卡那霉素 四环素 链霉素
2. 插入失活筛选
3. 插入表达筛选
载体的选择性标记基因前链接一段附调控序列，插入式祸福调控序列后，其 下游的筛选标记基因才能表达
4. α－互补法（蓝白斑筛选法）
乳糖操纵子：
。
IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
α-互补：是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵
基因区段的 β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。
IPTG
IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷
显色剂：X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，在β-半乳
分子杂交：生物大分子之间通过相互作用结合在一起：核酸之间通过碱基 互补配对；蛋白质之间通过抗原、抗体反应；核酸、蛋白质之间通过疏水
作用，氢键进行相互作用。
常见的分子杂交：
待测分子 探针
Southern blotting： DNA，
Northern blotting： RNA，
DNA/RNA
DNA/RNA
（二）转导
是指通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞将外源DNA
分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
E突变
D突变
诱导溶菌生长 溶源菌培养 39℃ 45℃ 2-3h 15min
λ噬菌体DNA
噬菌体颗粒转导
（三）转染
是采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，将重组λ
噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程。
RNA分子和蛋白质。
1. 放射性探针：32P、3H、35S、14C、125I
2. 非放射性探针
（1） 生物素（biotin）标记探针：生物素与dUTP中尿嘧啶的5位C相连，在 聚合酶作用参入DNA
连接臂
Biotin (维生素H， VH)
dUTP
（藻红素 ） （链霉亲和素 ） （生物素 ）
（2） 地高辛标记探针：地高辛与UTP中尿嘧啶的C5相连
（3） 末端标记法
（4） PCR标记法
（5） 光敏标记法：
光敏基团
（6） 化学衍生结合标记法：
（7）交叉相连标记法：
1.
对重组体克隆进行筛选和鉴定的方法之一是利用核酸杂交法进行筛选， 它包括Southern印记杂交法、Northern印记杂交、斑点印记杂交和（菌落
原位杂交）杂交。
2. 各种杂交中需要对探针进行标记，其中对探针进行非放射性标记的常见 标记物有（荧光素）、（生物素）、（地高辛）。
5.
α-互补筛选属于下列哪种筛选方法：(B) C.原位杂交法
（1）胸苷激酶（TK）基因： 胸苷（T）转换成TMP的基因 （2）二氢叶酸还原酶（DHFR）基因 催化二氢叶酸还原成四氢叶酸
（3）黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（ XGPRT）基因：
催化GMP生成
（四） 营养缺陷型检测法
（五） 形成噬菌斑筛选法
二、依赖于重组子结构特征分析筛选
（一） 快速裂解菌落鉴定分子大小：琼脂糖电泳，分析 DNA分子大小
（二） 利用报告基因筛选植物转化细胞
（三） 利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞
（四） 营养缺陷型检测法
（五） 形成噬菌斑筛选法
二、依赖于重组子结构特征分析筛选
三、核酸杂交分析
（一）分子探针：放射性探针、非放射性探针、标记探针的方法 （二）核酸探针杂交分析 四、免疫化学分析检测 （一） 抗体检测法
③ 基因组简单，不含线粒体、质体
④ 多为单细胞，容易获得一致性材料，易于扩大培 养或发酵生长
常用细菌：大肠杆菌。
大肠杆菌。
• 特点：G-,单个细胞，0.5 μm * (1~3) μm，周身鞭毛、 能运动、无芽孢 。 • 例：胰岛素、生长素、干扰素、RE……
•
•
优点：完善成熟的受体系统。
缺点：毒素等，折叠加工问题
3.
标记探针的方法（切口平移标记法）、（随机引物标记法）、（末端标
记法）、（PCR标记法）、（光敏标记法）、化学衍生结合标记法以及 交叉相连标记法。
4.
在利用lacZ失活的显色反应筛选法中，IPTG的作用是( a )
(a)诱导宿主的α肽的合成 (c)作为酶的作用底物 (b)诱导宿主的ω肽的合成
(d)作为显色反应的指示剂
够摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。受体细胞的选择应 符合以下原则：
①便于重组DNA分子的导入
②能使重组DNA分子稳定存在于细胞中
③便于重组体的筛选 ④遗传稳定性高
⑤安全性高
⑥内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低 ⑦遗传密码无明显偏倚性
⑧具有较好的转移后加工机制
1.原核受体细胞
较为理想的受体细胞： ① ② 大部分没有细胞壁，便于外源DNA进入 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质
糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。
（二） 利用报告基因筛选植物转化细胞
报告基因 (reporter gene)——是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也
就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基 因表达调节序列相融合形成嵌合基标定目的基因的表达调控， 筛选得到转化体。 （1）新霉素磷酸转移酶（NPT Ⅱ）基因
目的基因，又称为阳性克隆子或期望重组子。
克隆子的筛选：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞 后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选
（Screening）或选择(Selection)。
一、遗传表型直接筛选 （一）利用载体选择性标记筛选转化子 1. 2. 3. 4. 抗药性标 插入失活筛选 插入表达筛选 α－互补法（蓝白斑筛选法）
• •
长度25kb，占Ti质粒1/10 主要功能是转移DNA，随机插入植物染色体中。 ——天然的质粒克隆载体。
•
含有2类基因：
（1）编码冠瘿碱合成酶（ocs、nos）及分解代谢的基因。 （2）诱发肿瘤基因（Onc）
Con区——调控Ti质粒在农杆 菌之间的转移，含有与细
Vir区：激活T-DNA 转移，使农杆菌表现
（4）显微注射
三、重组基因导入动物受体细胞
（一）转染法
（二）脂质体介导转化
（三）动物病毒介导转导法
第三节 重组子筛选
只有少数受体细胞能被导入重组DNA分子 例：大肠杆菌 108个大肠杆菌，转化效率10-6 只有100个细胞被转化