美天旎细胞治疗全线-130723

美天旎GMP级细胞因子
MACS GMP Recombinant Human interleukin 1β（人白介素1β） MACS GMP Recombinant Human IL-2（人白介素2） MACS GMP Recombinant Human IL-3 （人白介素3） MACS GMP Recombinant Human IL-4 （人白介素4） MACS GMP Recombinant Human IL-6（人白介素6） MACS GMP Recombinant Human IL-7 （人白介素7） MACS GMP Recombinant Human IL-15 （人白介素15） MACS GMP Recombinant Human IL-21 （人白介素21） MACS GMP Recombinant Human GM-CSF （人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子） MACS GMP Recombinant Human TNF-α （人肿瘤坏死因子α ） MACS GMP Recombinant Human EGF-2 （人上皮生长因子2） MACS GMP Recombinant Human FGF-2 (人纤维母细胞生长因子2) MACS GMP Recombinant Human FLT3-ligand * （人 Fms相关酪氨酸激酶3的配体） MACS GMP Recombinant Human IFN-γ* （人γ干扰素） MACS GMP Recombinant Human SCF*(人干细胞因子)
对肿瘤干细胞拥有专一性的细胞毒性杀伤作用
美天旎NK细胞培养方案
NK Cell Isolation Kit， human NK Cell Activation/Expansion Kit, human
Anti-Biotห้องสมุดไป่ตู้n MACSiBead™ Particles biotinylated antibodies against human CD335 (NKp46) and CD2
▪ CIK细胞体外激活用到GMP级 细胞因子。这些细胞因子包括 IFN-γ，OKT3，IL-2 ，OKT28
▪ 有些医院会用到： IL-1α、IL7 、IL-12 、 IL-15
实验材料
培养基 TexMACS GMP Medium
细胞因子 Human IFN-γ
OKT3 OKT28 Human IL-1α Human IL-2 Human GM-CSF Human IL-4 Human TNF-α 耗材 细胞分化袋 细胞扩增袋
Rettinger et al. (2012) – CIK + IL-15
IL-15 results in enhancement of cytotoxic activity
E Rettinger, V Meyer, H Kreyenberg, A Volk, S Kuci, A Willasch, E Koscielniak, S Fulda, WS Wels, H Boenig, T Klingebiel, and P Bader (2012) Cytotoxic Capacity of IL-15-Stimulated Cytokine-Induced Killer Cells Against Human Acute Myeloid Leukemia and Rhabdomyosarcoma in Humanized Preclinical Mouse Models. Front Oncol, 2: 32.
100ng/mL OKT3
▪第一天:
▪ 500 U/ml IL-2
▪第四天:
▪ 调整细胞浓度到 1x106 cells/mL，加入 500 U/mL IL-2 或 50 ng/mL IL-15
▪每隔三天
▪ 加入新鲜的培养基，加入500 U/mL IL-2 或 50 ng/mL IL-15
▪培养十天
E Rettinger, S Kuci, I Naumann, P Becker, H Kreyenberg, M Anzaghe, A Willasch, U Koehl, G Bug, M Ruthardt, T Klingebiel, S Fulda, and P Bader (2012) The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells. Cytotherapy, 14(1): 91-103.
CIK
CD8+T 特异性T细胞疗法
CD4+T自体辅助性T细胞疗法
ACTL： ACTL靶向性抗肿瘤细胞免疫技术，是将无致病性的腺相关病毒(AAV) 通过基因重组技术改建为携带特定肿瘤相关抗原决定簇基因的重组腺相关病 毒( rAAV)，感染患者的外周血单核细胞 ，经细胞因子诱导，单核细胞转化为 具有强大抗原提呈功能的树突状细胞。 获得的DC可刺激产生有效杀伤肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。所产 生的CTL具有肿瘤抗原特异性，即靶向性。经rAAV感染的DC刺激产生的CTL 仅针对某种或数种肿瘤相关抗原阳性的肿瘤细胞具有杀伤作用，对抗原阴性 的细胞无作用。ACTL无明显毒副作用，并可逆转肿瘤细胞对抗激素和生物靶 向药物治疗产生的耐药性，这是该技术的显著特点。
The cell growth multiple in the 14th day GT: 14.76 multiple GMP: 31.2 multiple GT+HSP: 31.2 multiple GMP+HSP: 33.6 multiple
CIK治疗适应症与禁忌症
对高抗原表达的癌症疗效最好，如：髓性白血病、黑色素瘤、肾细胞癌、 转移性肾癌、非何杰金氏淋巴瘤等。其它癌症如肺癌、结肠癌、乳腺癌、 肝癌、胃癌、大肠癌等
NK治疗简介 NK（Natural Killer）来源尚不清楚，体外实验
表明，胸腺细胞在体外IL-2、 IL-12、IL-15、 IFN-α、TNF-α等细胞因子存在条件下培养也可 诱导出NK细胞。
NK细胞表面标记物为：CD3- CD56+
NK 细胞杀死肿瘤细胞特点
广泛识别肿瘤细胞，自然杀伤活性无MHC限制 分泌穿孔素及肿瘤坏死因子 起效快、杀伤能力强
细胞治疗概述
生物治疗
造血系统 再生医疗
干细胞移植
移植物处理
免疫治疗
干细胞分选
自体
异体
去除肿瘤细胞
去T、B
被动去T、B
活化Ｔ,Ｂ 的去除
T去除
CD6 T 去除 （BMT）
Treg(CD4/CD25) 去除
T细胞 （CD3）去除
B细胞（CD19） 去除
TCR α/β去除
CD45RA（naïve T 细胞去除）
TIL：肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），它是一种新型的抗肿瘤效应细胞， 具有高效、特异、副作用小等优点。经测试TIL细胞的抗肿瘤效果是 LAK的50~100倍，TIL中绝大多数细胞CD3+
CD3AK：LAK细胞的培养液中加入CD3单克隆抗体可以将这些细胞的 肿瘤杀伤活性提高十几倍，扩增的数量也大幅提高。
CIK治疗介绍 CIK（Cytokine-induced Killer）是一种用外周
血单个核细胞（PBMC）在体外经过多种细胞 因子培养激活后获得的非MHC限制性的对肿瘤 细胞具有高效溶解毒性的T细胞，也叫NK样T细 胞。
主要效应细胞为：CD3+ CD56+
CIK应用：肿瘤微小残留病灶的清除；
CIK细胞治疗技术
其中需要每周取样做流式鉴定表型（CD3,CD4,CD8,CD56,CD25），细菌真菌检测 ，内毒素检测，回输前需要做细胞活性检测。
▪起始日:
TexMACSTM GMP Medium CIK Therapy + IL-2 / IL-15
▪ 获得人类外周血单个核细胞 ▪ 完全培养基悬浮这些非粘附细胞， 调整细胞浓度到3x106 cells/mL ，加入 1,000 U/ml IFN- +
重悬NK细胞 ，调整 浓度2×10e6
过夜培养(1000 U/ml IL-2)。用 5% HSA溶液洗
涤两次，重悬浮 细胞
NK细胞终产品 ，调整 细胞浓度2×10e7，回输人 体, 注射Hi-Cy/Flu，连续14
天注射IL-21 （1.75*10e6 IU/m2）
流式鉴定表型（CD3,CD4,CD8,CD56，CD25）
细菌真菌检测，内毒素检测，回 输前需要做细胞活性检测。
NK治疗适应症
NK细胞疗法可用于多种癌症，尤其对血液肿瘤，肺癌、淋巴癌、 食道癌、乳癌、肝癌等血流旺盛且血管较密集的癌症有很好的疗效 NK细胞用于治疗各种肿瘤，对低表达MHC-I、II类分子的肿瘤和恶 性血液疾病效果更好
DC治疗简介 DC（Dendritic Cell）即抗原提呈细胞，能摄取、
CIK治疗
NK治疗 DC治疗
Ag 特异性 T细胞
病毒感染 Treg治疗
CTL：细胞毒性T淋巴细胞，白细胞的亚群，为一种特异T细胞，专门 分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质 具有杀伤作用。淋巴细胞在体外通过靶细胞抗原和淋巴因子的诱导， 分化扩增成具有强大杀伤力的CTL细胞
LAK：淋巴因子激活的杀伤细胞。将外周血淋巴细胞在体外经高剂量 淋巴因子IL-2激活3～5天而扩增为具有广谱抗瘤作用的杀伤细胞
GMP级别无血清培养基竞争：高性能的优势，无需加血清
Group: 1, Takara GT Serum-free media: 5×106/well × 6 wells 2, our GMP Serum-free media: 5×106/well × 6 wells 3, GT Serum-free media with 3% HSP : 5×106/well × 6 wells 4, our GMP Serum-free media with 3% HSP : 5×106/well × 6 wells
▪ CIK细胞 (Cytokine-Induced Killer) ，即细胞因子诱导的杀伤细胞， 它是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗 CD3McAb、 CD28McAb 、IL-2、IFN-γ、IL-1α）共同培养一段时
间后获得的一群异质细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性 和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。
Main components of the CliniMACS® System
CliniMACS Plus® 仪器
(含各种不同分选 程序的软件)
细胞特异性的免 疫磁性标记试剂
管道
使用CliniMACS Plus仪器实现NK细胞治疗
MNCs（清血法，非动源） CD3 去除 CD56 富集
NK细胞 2×10e9
细胞特异性的免 疫磁性标记试剂
管道
Mo-DC culture
5~7 ds
2 ds
美天旎DC细胞治疗方案
GM-CSF 1000 IU/mL IL-4 1000 IU/mL
流式细胞检测CD11c， CD40 ，CD80，CD83，CD86
IL-6 1000 IU/mL TNFα 1100 IU/mL IL-1β 1900 IU/mL PGE2 1 µg/mL
加工及呈递抗原，启动T细胞介导的免疫反应。
DC细胞表面标记物为： CD14+（MoDCs） CD1C+（MDCs） CD304（PDCs）
DC 细胞的作用
细胞毒性 淋巴细胞
Main components of the CliniMACS® System
CliniMACS Plus® 仪器
(含各种不同分选 程序的软件)
某些不适合手术、不能耐受放化疗的中晚期癌症
非T细胞相关的白血病和淋巴瘤
乙型肝炎，丙型肝炎，慢性寄生虫感染等
对于手术、放化疗或造血干细胞移植后患者体内微小残留病灶的清除， 防止癌细胞扩散和复发
T细胞相关淋巴瘤和白血病；器官移植后，长期使用免疫抑制药物或正 在使用免疫抑制药物的患者；自身免疫病患者
美天旎产品在CIK细胞治疗中的应用
▪ CIK细胞疗法是将人体自身的免疫细胞在体外进行多因子诱导、激 活、培养扩增，然后再输回到体内杀伤癌细胞。
▪ CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。CIK 细胞 被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。
▪ 国内外大量动物试验和临床应用研究表明： CIK细胞疗法无严重 不良反应，无任何近期和长期毒副作用。
TexMACSTM GMP Medium CIK Therapy
CIK 细胞杀死肿瘤细胞模式图
美天旎CIK细胞培养方案
一：从病人抽取30-50ml外周血，用ficoll提取液进行PBMC的提取 ，获得约3~5×107个单个核细胞 二：将细胞悬浮于30ml TexMACS GMP培养液，调整细胞浓度为约 1.5~2.0×106/ml 三：加入1000 U/mL IFN-γ , 置于37℃，5％CO2培养箱条件下培 养。 四：培养第2天，加入50ng/ml OKT3，500 U/mI IL-2培养 五：从第3~4天开始，每两天加入500 U/mI IL-2，40ng/ml IL7,40ng/ml IL-15添加新鲜TexMACS GMP培养基进行培养，扩增到第 18~21 天 收 细 胞 ， 使 用 1% 白 蛋 白 的 生 理 盐 水 重 悬 细 胞 ， 约 100~200ml，静脉回输病人