固相萃取基本基础原理与操作技巧

一、固相萃取基本原理与操作

1、固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理

固相萃取主要通过目标物与吸附剂之间的以下作用力来保留/吸附的1）疏水作用力：如C18、C8、Silica、苯基柱等

2）离子交换作用：SAX, SCX，COOH、NH2等

3）物理吸附：Florsil、Alumina等

2、p H值对固相萃取的影响

pH值可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度。对于强阳/阴离子交换柱来讲，因为吸附剂本身是完全离子化的状态，目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留。而目标物的离子化程度则与pH值有关。如对于弱碱性化合物来讲，其pH值必须小于其pKa值两个单位才可以保证目标物完全离子化，而对于弱酸性化合物，其pH值必须大于其pKa值两个单位才能保证其完全离子化。对于弱阴/阳离子交换柱来讲，必须要保证吸附剂完全离子化才保证目标物的完全吸附，而溶液的pH值必须满足一定的条件才能保证其完全离子化。

3、固相萃取操作步骤及注意事项

针对填料保留机理的不同（填料保留目标化合物或保留杂质），操作稍

有不同。

1）填料保留目标化合物

固相萃取操作一般有四步（见图1）：

Ø 活化---- 除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境。（注意整个过程不要使小柱干涸）

Ø 上样---- 将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。（注意流速不要过快，以1ml/min为宜，最大不超过5ml/min）

Ø 淋洗---- 最大程度除去干扰物。（建议此过程结束后把小柱完全抽干）

Ø 洗脱---- 用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。（注意流速不要过快，以1ml/min为宜）

如下图1:

2）填料保留杂质

固相萃取操作一般有三步（见图2）：

Ø 活化--除去柱子内的杂质并创造一定的溶剂环境。（注意整个过程不要使小柱干涸）

Ø 上样--将样品转移入柱，此时大部分目标化合物会随样品基液流出，杂质被保留在柱上，故此步骤要开始收集（注意流速不要过快）

Ø 洗脱---用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集，合并收集液。（注意流速不要过快）

此种情况多用于食品或农残分析中去除色素。

如下图2：

二、固相萃取方法的建立与优化

固相萃取技术使用起来虽然比液液萃取简单，但建立一个固相萃取的方法并无快捷方式可走。建立固相萃取方法必须考虑与萃取过程相关的多种因素，归纳起来可通过下图来了解：方法建立如下图片1.jpg：

方法建立如下图片2.jpg：

1、初步固相萃取方法的建立

建立初步的萃取方法要考虑:

·选择合适的SPE柱

·选择合适的固相萃取方法

·方法的优化

2、固相萃取柱的选择<

1）柱填料的选择

首选根据目标化合物与干扰物的差异，如极性，分子量，pka值等，选择合适的填料。固相萃取柱的选择如下图片.jpg：

2）固相萃取柱规格的选择对于反相、正相和吸附型固相萃取柱来说，被萃取样品的质量不超SPE柱填料的5%（参考值，同一种SPE柱对不同的目标物选择性不同，吸附容量不同）；

离子交换型的固相萃取柱，必须考虑离子交换的容量。不同厂家的小柱离子交换容量稍有差异。下表附SPE小柱的容量和洗脱参数

SPE柱上样容量和洗脱体积的选择

规格最大上样量最小洗脱体积

100mg/1mL5mg250µL

200mg/3mL10mg500µL

500mg/6mL25mg 1.2mL

1g/6mL50mg 2.4mL

3、选择合适的固相萃取方法

固相萃取的保留机制可分为两种：

·吸附剂（填料）保留目标化合物：绝大多数化合物应用此机制，填料保留其目标组分及少量杂质，通过淋洗步骤去除吸附在柱上的少量杂质，最后选择合适的（洗脱）溶剂把目标组分洗脱下来。

根据吸附剂的保留机理可进一步分为：

（1）反相（C18,C8,CN,Phenyl,C4,C1）

·分析物：非极性至中等极性

·基质：水溶性

·方法：

a.活化：通常用水溶性有机溶剂如甲醇活化，然后用水平衡

b.淋洗：含0-50%极性溶剂的缓冲溶液淋洗杂质

c.洗脱：极性或非极性溶剂洗脱目标物

（2）正相（Silica, Florisil,Diol,NH2）

·分析物：中等极性到强极性

·基质：非极性至中等极性

·方法：

a.活化：非极性有机溶剂

b.洗脱：非极性有机溶剂

如下图片：

（3）阳离子交换（SCX,PRS,COOH）

u 分析物：阳离子（碱性）化合物

u 方法：

1.活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂过柱后，然后用水平衡，最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。

2.上样：样品溶液pH值要小于其pKa两个单位（以保证其带电荷）

3.洗脱：洗脱溶液pH值要大于其pKa两个单位（中和分析物的电荷）

（4）阴离子交换（SAX,PSA,NH2，PAX/MAX ）

u 分析物：阴离子（酸性）化合物

u 方法：

1.活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂活化后，然后用水平衡，最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。

2.上样：样品溶液pH值要大于其pKa两个单位（以保证其带电荷）。

3.洗脱：洗脱溶液pH值要小于其pKa两个单位（中和分析物的电荷）。

u 吸附剂（填料）保留杂质：

食品中色素等杂质的去除多用此机制。填料保留杂质而不保留或只保留极少量的目标组分，所以上样后即开始收集目标组分，最后用目标物所在的溶剂进一步洗脱。合并两部分收集液。

（1）活化：以样品所在的有机溶剂进化活化，1-2柱管体积

（2）上样：提取液转移至柱内，并收集流出液

（3）洗脱：用样品所在的有机溶剂进一步洗脱，收集流出液。合并上样和洗脱流出液。

4、固相萃取方法的优化

1）影响萃取效率的因素

（1）填料（固定相）----- 核心

选择合适的SPE柱是保证理想结果的前提。

（2）洗脱溶剂的强度：

Ø 采用正相固定相时，溶剂强度随其极性增强而增加；

Ø 采用反相固定相时，溶剂强度随极性减弱而增强。

（3）pH值：

离子交换固定相、被分析物和干扰物质的pKa各不相同。通过调节pH大小，可以使固定相带电荷，被分析物带相反电荷，而使干扰物质不带电荷；或者反过来，使固定相带电荷，干扰物质带相反电荷，而使被分析物不带电荷。

（4）操作：控制合适的流速、活化的时不要让柱干涸等

2）常见问题及解决方法

·分析物回收率低

·萃取重现性差