蛋白质含量测定法(BCA法)标准操作规程SOP
蛋白质含量测定法（Bradford法）标准操作规程SOP
蛋⽩质含量测定法（Bradford法）标准操作规程SOP审批页⽬录1⽬的 (4)2范围 (4)3定义 (4)4环境、健康和安全 (4)5培训 (4)6职责 (4)7程序（内容） (4)7.1原理 (4)7.2实验材料 (4)7.3操作步骤 (5)7.4结果计算 (5)7.5判定标准 (6)7.6注意事项 (6)8相关⽂件 (6)9参考⽂献 (6)10流程图 (6)11附录 (6)蛋⽩质含量（Bradford法）测定记录 (1)蛋⽩质含量（Bradford法）测定记录(适⽤于多个样品) (1)1⽬的规范蛋⽩质含量检测（Bradford法）的操作过程。
2范围本规程适⽤于样品中蛋⽩质含量的检测（Bradford法）。
3定义————4环境、健康和安全————5培训5.1培训部门：分析研究部。
5.2培训对象：分析研究部相关⼈员。
5.3培训⽅式和时数：⾃学，1⼩时。
5.4考核⽅式：问答。
6职责6.1质量保证部：负责监督本⽂件的执⾏。
6.2分析研究部：负责严格执⾏本规程规定。
7程序（内容）7.1原理本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G250与蛋⽩质分⼦中的碱性氨基酸(精氨酸)和芳⾹族氨基酸结合形成蓝⾊复合物，该蓝⾊复合物在595nm处有最⼤吸收值，在⼀定浓度范围内其颜⾊深浅与蛋⽩质浓度呈正⽐，以蛋⽩质对照品溶液作标准曲线，采⽤⽐⾊法测定供试品中蛋⽩质的含量。
7.2实验材料7.2.1试药与试液7.2.1.1超纯⽔：电阻率不低于18.2MΩ·cm，本⽅法所有试液均⽤超纯⽔配制。
7.2.1.2酸性染⾊液：（1）⾃配：称取0.l0g考马斯亮蓝G250，加⼄醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加⽔稀释⾄1000ml，混匀。
滤过，取滤液，即得。
本试剂置棕⾊瓶内避光保存，如有沉淀产⽣，使⽤前再滤过，2～8℃保存6个⽉。
（2）购买商品化试剂：如Quick Start TM Bradford 1X Dye Reagent，Cat#500-0205，⼚家BIO-RAD。
普利莱基因技术微量蛋白质定量试剂盒 (BCA 法) 使用说明说明书
微量蛋白质定量试剂盒(BCA法)使用说明P1513描述：Bicinchoninic acid(BCA)法是近来广为应用的蛋白定量方法。
其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。
BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。
与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。
与Bradford 法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
组成与储存：(1)BCA Reagent100ml，室温保存；(2)Cu Reagent2.5ml，室温保存；(3)BSA standard4mg/ml1ml，−20ºC冻存。
1.5年有效。
可进行500次微板(microplate)测定或100次1ml比色杯测定。
所需设备：比色计、酶标仪、或微板比色仪，最佳工作波长562nm，可在540-590nm之间。
工作溶液(Working Reagent,WR)配制：将50体积BCA Reagent与1体积Cu Reagent混合即为WR工作试剂，呈嫩绿色，立即使用或者4℃保存不超过一天。
标准蛋白溶液配制：用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS、或与待测蛋白样品匹配之缓冲液进行倍比稀释,得到BSA标准溶液80、40、20、10、5、2.5、1.25µg/ml。
蛋白测定微量蛋白质浓度线性检测范围为1-100µg/ml。
标准测定用1cm光程玻璃或塑料比色皿，反应终体积1.2ml，用比色计测定。
微板测定用96孔板，反应终体积240µl，用酶标仪、微板比色仪测定。
1.标准测定：将0.2ml标准品或待测样本与1ml WR工作溶液混合。
微板测定：将40µl标准品或待测样本与200µl WR工作溶液混合。
蛋白质含量测定操作细则
蛋白质含量测定操作细则1．试剂与器材：1．1标准蛋白溶液（100μg/ml），经事先标定。
1．2酚试剂：酚试剂贮备液（购买国产或进口）经标准氢氧化钠液滴定，测定酸浓度，用注射用水稀释至1M，即为酚试剂。
1．3 2%酒石酸钠溶液：称取2克酒石酸钠，加注射用水溶解至100ml。
1．4 1%硫酸铜溶液：称取1克硫酸铜，加注射用水溶解至100ml。
1．5 4%碳酸钠溶液：称取4克碳酸钠，加注射用水溶解至100ml。
1．6 0.8%氢氧化钠溶液：称取0.8克氢氧化钠，加注射用水溶解至100ml。
1．7 碱性铜液（用时现配）取试剂1. 3、1. 4各0.5ml，试剂1. 5、1. 6各25ml，混匀。
1．8 分光光度计（有650nm波长）1．9 计算器：CASIO fx－3900 （能计算相关系数）1．10电子天平1．11试剂瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、洗耳球、滤纸等1．12吸管、移液管、中试管、试管架2．操作：2．1标准曲线：精确量取标准蛋白液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分别加入试管中，补加注射用水至1ml，加碱性铜液5ml，混匀，放置10分钟后，快速加入酚试剂0.5ml，混匀，室温放置30分钟，于650nm波长比色，测定其OD值，计算相关系数。
2．2样品测定：精确量取适量样品（蛋白约为50μg）于试管内，补加注射用水至1ml，加碱性铜液5ml，混匀，放置10分钟后，快速加入酚试剂0.5ml，混匀，室温放置30分钟，于650nm 波长比色，测定其OD值，（显色后，若浑浊，经3000rpm离心后再比色）。
3．结果计算：3．1坐标法以蛋白浓度为横坐标，测定的OD值为纵坐标，作一标准曲线，根据样品的OD值从标准曲线上查出相应的结果（μg），进行计算。
查出的结果×稀释倍数蛋白含量（μg/ml）=取样量查出的结果×稀释倍数蛋白含量（μg/ml）=取样量×10×固总3．2计算器法：3．2．1按AC键，打开计算器开关。
蛋白质测定 SOP
蛋白质含量的测定1 范围本文件适用于使用分光光度计对食品中蛋白质进行测定2原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。
在波长400 nm下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。
3试剂和材料除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。
3.1硫酸铜（CuSO4²5H2O）。
10.2硫酸钾（K2SO4）。
3.3硫酸（H2SO4密度为1.84g/L）：优级纯。
3.4氢氧化钠（NaOH）。
3.5对硝基苯酚（C6H5NO3）。
3.6乙酸钠（CH3COONa²3H2O）。
3.7无水乙酸钠（CH3COONa）。
3.8乙酸（CH3COOH）：优级纯。
3.937% 甲醛（HCHO）。
3.10 乙酰丙酮（C5H8O2）。
3.11 氢氧化钠溶液（300 g/L）：称取30 g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100 mL。
3.12 对硝基苯酚指示剂溶液（1 g/L）：称取0.1 g对硝基苯酚指示剂溶于20 mL 95%乙醇中，加水稀释至100 mL。
3.13 乙酸溶液（1 mol/L）：量取5.8 mL乙酸（3.8），加水稀释至100 mL。
3.14 乙酸钠溶液（1 mol/L）：称取41 g无水乙酸钠（3.7）或68 g乙酸钠（3.6），加水溶解后并稀释至500 mL。
3.15 乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取60 mL乙酸钠溶液（3.14）与40 mL乙酸溶液（3.13）混合，该溶液pH4.8。
3.16 显色剂：15 mL 甲醛（3.9）与7.8mL乙酰丙酮（3.10）混合，加水稀释至100 mL，剧烈振摇混匀（室温下放置稳定3d）。
3.17 氨氮标准储备溶液（以氮计）（1.0 g/L）：称取105 ℃干燥2 h的硫酸铵0.4720 g加水溶解后移于100 mL容量瓶中，并稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1.0 mg氮。
(2021年整理)考马斯亮蓝法测蛋白质含量
（完整）考马斯亮蓝法测蛋白质含量编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（（完整）考马斯亮蓝法测蛋白质含量）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为（完整）考马斯亮蓝法测蛋白质含量的全部内容。
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95％乙醇，加入100ml 85％ H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤.最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7％（W/V)乙醇，8。
5％（W/V）H3PO4。
2、标准蛋白质溶液:纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液.（二)、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（)。
2、移液管使用（）。
（三）、标准曲线制作:1、2、以A595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm=a×X（）+6一般相关系数应过0。
BCA蛋白质检测试剂
BCA Protein AssayBCA 蛋白质定量货号Cat ： 包装规格 微孔检测 WB051试剂A 25 ml 试剂B 1.0 ml BSA （1mg/ml ） 5ml125次WB052试剂A 100ml 试剂B 2.5 ml BSA （1mg/ml ） 25ml500次贮存：蛋白标准-20℃保存（其他4℃，有效期一年）。
产品特点：1.准确灵敏：BCA 试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/ml,采用加强方法可检测到5μg/ml。
2.快速：45分钟内完成测定。
3.可在微孔板中进行。
4.相对于其他方法干扰因素较少。
5.不同蛋白质分子的变异系数远小于Bradford。
6.不受低浓度的EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵、脂类的干扰7.标准曲线接近直线，可以单点定标。
注意：1.在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37℃温育使溶解, 如发现细菌污染则应丢弃。
2.高浓度EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵、脂类会影响检测结果，改用Bradford 法测定。
3. 试剂A 与试剂B 用应密闭保存。
操作步骤：1. 配制工作液: 根据标准品和样品数量，试剂A 与试剂B 按50:1配制适量BCA工作液，充分混匀。
BCA 工作液室温24小时内稳定。
2. 标准曲线制备与操作。
编号 1 2 3 4 5 6 去离子水µl 107.5 5 2.5 0 蛋白标准µl 0 2.5 5 7.5 10 样品µl10 BCA工作液µl200200200 200200200混匀，37℃放置30分钟，冷却到室温，测定A562的吸光度（540-595nm之间也可接受），根据标准曲线计算出蛋白浓度注：样品和试剂比可以按比例放大或缩小。
微孔检测时，可以按比例缩小，但总体积不小于100ul 。
附表：以下是不干扰本方法测定的物质浓度：注意：试剂有腐蚀性，如接触皮肤眼睛等，请用大量水清洗，或就医。
蛋白质的定量分析：BCA法
C=
——
M
V
×250
实验结果记录
管号
空白管
1
2
3
4
5
测定管
M(ug)
吸光 值(A)
0
30 60
90
120
150
？
测定三次求平均值
四.注意事项
1、实验分组，两人一组 2、试剂盘的摆放：专管专用，防止污染 3、准确量取试剂，正确使用吸量管 4、正确操作722型分光光度计，此次由于溶 液体积较少，比色皿不需要待测溶液润洗 5、正确绘制标准曲线，标明名称、仪器、 作图人、时间等 6、实验原始记录书写规范，三线表
较快 肽键和碱性Cu2＋形成
紫色络合物
BCA法广泛用于科研工作，其特点： 1、操作简便，快速 2、准确灵敏，试剂稳定性好 3、经济适用 4、抗试剂干扰能力较强，不受绝大部分样 品中的去污剂、尿素等化学物质的影响
思考
1、该实验设计及实验操作过程中，有没 有可改进的方法，如果有请说出你的想法？ 2、比较各种蛋白质定量分析方法的优缺 点，并思考各种方法的适用条件。
实验二
蛋白质定量分析：BCA法
主要内容
一.实验目的 二.实验原理
三.实验操作 四.注意事项 五.蛋白质定量分析方法
一.实验目的
1、学习BCA法测定蛋白质浓度的原理及操 作； 2、掌握722型分光光度计、移液管的正确 使用、试剂盘的正确摆放以及用标准曲线法 计算蛋白质的浓度；
3、了解蛋白质含量测定的多种方法。
五.蛋白质定量分析方法
一
紫外吸收特性
二
凯氏定氮法
蛋白质元素组成特点
紫外线（UV）吸收法 双缩脲法 Folin-酚试剂法 考马斯亮蓝结合法 BCA法
BCA测蛋白的具体操作步骤
For personal use only in study and research; not for commercial use一. 原理BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用蛋白浓度检测方法之一BCA法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。
检测浓度下限达到25 微克/毫升，最小检测蛋白量达到0.5微克，待测样品体积为1～20微升。
二. 试剂盒组份组份Cat: KGPBCA （250 assay酶标板/50assay 1mL比色杯）蛋白标准溶液（0. 5 μg/μL ）5 mL BCA试剂A 25 mL×2 BCA试剂B 1mL三. 操作步骤A．酶标板操作1. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂孔号0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液（μL）0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水（μL）20 19 18 16 12 8 4 0 对应蛋白含量（μg）0 0.5作液，充分混匀；3. 各孔加入200μL BCA工作液；4. 把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。
以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；5. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，加入BCA工作液200μL，充分混匀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。
B．分光光度计测定1. 标准曲线的绘制：各管按照下表加入试剂孔号0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液（μL）0 5 10 20 40 60 80 100 去离子水（μL）100 95 90 80 60 40 20 0 对应蛋白含量（μg）02.5 5.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.02. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；3. 各管加入1000μL BCA工作液；4. 各管充分混匀，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。
BCA法测蛋白
BCA法测定蛋白质含量
⑴根据样品量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B （50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀（室温24小时内使用），各孔加入200ul BCA工作液。
⑵室温溶解蛋白标准品，取10ul用PBS稀释至100ul，使标准品蛋白浓度为0.5mg/ml。
⑶将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ml加到96孔板，体积不足20ul 的以PBS溶液补足到20ul。
⑷取1ul蛋白上清液样品加入到96孔板，每孔加PBS溶液19ul，混匀，加样完毕37℃放置30min。
⑸测定波长530nm的OD值。
根据各蛋白标准孔的蛋白浓度用Excel软件画出标准曲线，并计算出各蛋白杨品的蛋白浓度。
⑹按3:1比例在蛋白样品中加入适量的4xSDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。
100℃水浴加热10min，以充分变形蛋白。
蛋白质含量测定法（BCA法）标准操作规程SOP
蛋白质含量测定法（BCA法）标准操作规程SOP蛋白质含量测定法（BCA法）标准操作规程文件编码：SOPXXXX目录1. 目的 (1)2. 范围 (1)3. 职责 (1)4. 依据 (1)5. 定义 (1)6. 内容 (1)6.1. 原理 (1)6.2. 实验材料 (1)6.3. 操作步骤 (2)6.4. 结果计算 (3)6.5. 判定标准 (4)6.6. 注意事项 (4)7. 相关文件 (5)8. 附件 (5)9. 变更历史 (5)1.目的1.1.规范蛋白质含量检测（BCA法）的操作过程。
2.范围2.1.本规程适用于BF02及其它适合于BCA法的样品（原液或成品）的蛋白质含量测定。
3.职责3.1.方法学研究员负责严格执行本规程规定；3.2.方法学研究室负责人负责本规程的培训并监督本规程的执行。
4.依据4.1.《中国药典》2015年版，通则0731“蛋白质含量测定法”，第四法2,2，-联喹啉-4,4，-二羧酸法（BCA法）5.定义5.1.BCA：2,2，-联喹啉-4,4，-二羧酸法5.2.BSA：牛血清白蛋白5.3.TCA：三氯乙酸5.4.EDTA：乙二胺四乙酸5.5.EGTA：乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸5.6.DTT：二硫苏糖醇6.内容6.1.原理依据蛋白分子在碱性溶液中将Cu2+还原为Cu+，2,2，-联喹啉-4,4，-二羧酸（BCA）与Cu+结合形成紫色复合物，该复合物在562nm处有最大吸收值。
在一定浓度范围内，其溶液颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液（BSA）作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
6.2.实验材料6.2.1. 试药与试液6.2.1.1. 超纯水：电阻率不低于18.2MΩ·cm ，本方法所有试液均用超纯水配制。
6.2.1.2. 铜-BCA 试液：取2, 2'-联喹啉-4，4'-二羧酸钠l.0g ，无水碳酸钠2.0g ，酒石酸钠0. 16g ，氢氧化钠0. 4 g 与碳酸氢钠0.95g ，加水使溶解成100ml ，调节pH 值至11.25,作为甲液，甲液室温保存不超过6个月；另取4 % 硫酸铜溶液作为乙液，乙液室温保存不超过6个月，临用前取甲液、乙液，按体积比（甲液：乙液=50:1）进行混匀后使用。
蛋白含量测定及western步骤
蛋白含量测定及w e s t e r n步骤 SANY GROUP system office room 【SANYUA16H-蛋白的提取和定量肺组织用预冷1×TBS洗净后，加入含PMSF的RIPAbuffer（冰上操作，310ul,决定未来的蛋白浓度和蛋白液体积）,50-60mg肺组织砸碎放入1.5ml离心管，冰上孵育1h，10000转4℃离心10min，转上清至新管。
裂解液分装后保存于-70℃蛋白质定量：BCA蛋白测定法①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。
BCA工作液室温24小时内稳定。
②完全溶解蛋白标准品(BCA试剂盒中，BSA原浓度2mg/mL),稀释到1mg/mL。
③将标准品按0，2，5，10，15，20，25ul标准品孔中，加蒸馏水稀释标准品④加样品2uL加到96孔板的样品孔中，加蒸馏水23微升。
⑤各孔加入200微升BCA工作液，37o C放置30分钟。
同时打开酶标仪预热。
注：也可以室温放置2小时，或60o C放置30分钟。
BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。
并且显色反应会因温度升高而加快。
如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。
⑥测定A570的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
⑦计算调蛋白时所需TBS和RSB的体积（调所有样品浓度至3-5ug/ul）：总体积=蛋白体积*蛋白浓度/3（ul）RSB=1/5*总体积（ul）TBS=总体积-RSB-蛋白体积（ul）先加RSB（对蛋白有保护作用），后加TBS。
最后放于-70℃保存。
WesternBlotSDS-PAGE1.玻璃板：注意对齐、夹紧，防止漏出，短板朝前。
灌至距绿线1cm左右，用dd水封顶，放置30－40min。
状况好时往往能观察到水与胶的界限。
4.分离胶凝固后，配制浓缩胶。
将水倒掉，灌好浓缩胶，立刻插入梳子，等待40min。
蛋白含量测定及western步骤
蛋白的提取和定量肺组织用预冷1×TBS洗净后，加入含PMSF的RIPA buffer（冰上操作，310ul,决定未来的蛋白浓度和蛋白液体积）,50-60mg肺组织砸碎放入1.5ml离心管，冰上孵育1h，10000转4℃离心10min，转上清至新管。
裂解液分装后保存于-70℃蛋白质定量：BCA蛋白测定法①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA 工作液，充分混匀。
BCA工作液室温24小时内稳定。
②完全溶解蛋白标准品(BCA试剂盒中，BSA原浓度2mg/mL),稀释到1mg/mL。
③将标准品按0，2，5，10，15，20，25 ul标准品孔中，加蒸馏水稀释标准品的溶液④加样品2uL加到96孔板的样品孔中，加蒸馏水23微升。
⑤各孔加入200微升BCA工作液，37o C放置30分钟。
同时打开酶标仪预热。
注：也可以室温放置2小时，或60o C放置30分钟。
BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。
并且显色反应会因温度升高而加快。
如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。
⑥测定A570的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
⑦计算调蛋白时所需TBS和RSB的体积（调所有样品浓度至3-5ug/ul）：总体积=蛋白体积*蛋白浓度/3（ul）RSB=1/5*总体积（ul）TBS=总体积-RSB-蛋白体积（ul）先加RSB（对蛋白有保护作用），后加TBS。
最后放于-70℃保存。
Western BlotSDS-PAGE1. 玻璃板：注意对齐、夹紧，防止漏出，短板朝前。
距绿线1cm左右，用dd水封顶，放置30－40min。
状况好时往往能观察到水与胶的界限。
4. 分离胶凝固后，配制浓缩胶。
将水倒掉，灌好浓缩胶，立刻插入梳子，等待40min。
在此期间，打开水浴锅（100℃）注：此步后可停止，将胶连同梳子放入4℃保存一夜，若保存时间较长，为防止水分流失，可加盖湿润的滤纸和保鲜膜。
BCA蛋白浓度测定(整理版)
BCA蛋白浓度测定Pierce? BCA Protein Assay Kit(试剂盒室温保存)1. 准备BSA标准品按Table 1配制一系列的蛋白标准品.原液(stock):取出一个ample(内含2mg/mL的白蛋白标准品 (此量足够3个replication)2.准备BCA工作液(Working Reagent,WR)(1)用公式计算总工作液量(标准品数+待测样品数)*(复制数)*(每个工作液的量)=总的需要的工作液的量例子:3个待测样品,每个样品2个复制所需的工作液量(9个标准品+3个待测样品)*(2个复制数)*(2ml)=48ml工作液Note:试管法:每个试管需2ml工作液微孔板:每个孔需200ul工作液(例子中需共4.8ml)(2)BCA试剂A:B=50:1配制适量BCA工作液，充分混匀。
对于上面的例子,试管法需要50ml BCA A液+1ml BCA B液,微孔板法需5ml A液和1mlB液.B液加到A液中时,迅速浑浊,但是通过混匀立即变成清澈绿色的工作液.工作液在密闭室温下可以保存数天.3.微孔板步骤(样品与工作液比例=1:8)(1).标准液和样品各25ul加入微孔板中Note:若样品有限,可各加10ul(样品与工作液比例=1:20)(2).每孔加200ul的工作液并且充分震荡30s。
(3).在37度孵育样品30min，或室温2h。
(4).冷却至室温。
(5).在酶标仪中测量562nm时的吸光值(6).绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。
Note:540-590nm的波长均可Figure 1: Typical color response curves for BSA and BGG using the Standard Test Tube Protocol (37°C/30-minute incubation).仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途。
For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur für den persönlichen für Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l 'étude et la recherche uniquement à des fins personnelles; pas à des fins commerciales.толькодля людей, которые используются для обучения, исследований и не должны использоваться в коммерческих целях.以下无正文。
Western blot步骤
Western blot操作步骤(一)BCA法测定蛋白质含量1.按照BCA方法，利用酶标仪建立蛋白标准曲线；2.测试样品蛋白含量，以计算出合理的上样量。
(二)SDS-PAGE凝胶电泳1.按装模具：取两块玻璃板（1.5 mm厚度），洗净风干后，安装玻璃板，确保下端对齐，不漏液。
2.制备分离胶，分离胶浓度依据所测蛋白分子量来确定。
3.分离胶的灌注：凝胶混匀后，灌入已安装好的玻璃板中，至玻璃板上缘约2cm左右止，缓缓加入超纯水，覆盖在分离胶顶部，防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应，室温聚合。
4.配制浓缩胶，待分离胶聚合后，倒去超纯水，并用滤纸吸干残留的液体，灌制浓缩胶。
5.浓缩胶灌到已聚合的分离胶之上，保持短玻璃板齐平，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，在此过程中应避免气泡的产生，室温聚合。
6.浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳子，凝胶玻璃板固定于电泳装置上，放入电泳槽内。
在内外槽内加入1×SDS电泳缓冲液，使电泳装置底部的电极丝完全浸入缓冲液中。
7.样品准备：样品中加相应的上样缓冲液，放入沸水中加热3-5min，然后上样。
8.电泳：上样完成后，接通电源。
浓缩胶部分保持恒压80 V，分离胶保持120V，电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部时停止。
(三)Western blot (免疫印迹法检)1.电泳结束后，从电泳装置上卸下玻璃板，取出凝胶。
去除上层的浓缩胶，将凝胶置于转移缓冲液中浸泡30 min；2.准备与胶同样形状、大小的PVDF膜和2张滤纸，将膜和滤纸置于转移缓冲液中浸泡20 min。
(PVDF膜必须先在甲醇溶液中浸泡激发)；3.湿转：将凝胶、PVDF膜、滤纸、棉垫在转移缓冲液中充分浸泡后进行三明治叠板（由负极到正极依次为，棉垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-棉垫）；4.接通电源，所转膜蛋白的分子量设置电压，开始转膜（转膜过程在冰浴环境中）。
(四)免疫检测1.将转好的PVDF膜放入培养皿中，加入适量的封闭液，在4℃冰箱中过夜（或室温封闭2 h）；2.按抗体的效价用5%的BSA（或封闭液）稀释抗靶蛋白特异性抗体(一抗)。
BCA法测定蛋白质含量
三.实验步骤
取7支试管按下表编号并操作：（平行加样、准确量取）
管号
空白管 1
2
3
4
试剂/ml）
蒸馏水
— 0.1 0.2 0.3 0.4
3.0 2.9 2.8 2.7 2.6
待测样品 (小牛血清， —
—
—
—
—
已经稀释了500倍)
5 测定管
0.5 —
2.5 2.5
— 0.5
实验
蛋白质定量分析：BCA法
分光光度计的基本原理
分光光度计的基本原理是基于 物质对不同波长的光的选择性 吸收，不同的物质都有各自的 吸收光谱。当白光通过某一溶 液时，其中某些波长的光会被 溶液吸收。
光吸收程度达到最大值的波长，为最大吸收波长，用λmax示。
Lambert－Beer定律
A=KCL
BCA法广泛用于科研工作，其特点：
1、操作简便，快速
2、准确灵敏，试剂稳定性好 3、经济适用
BCA试剂盒
4、抗试剂干扰能力较强，不受绝大部分样
品中的去污剂、尿素等化学物质的影响
各种方法比较
方法
紫外线吸 收法
灵敏度 较低
时间 快速
原理
酪氨酸和色氨酸在 280nm的光吸收
干扰物 核苷酸
改良凯氏 低 费时 将蛋白氮转化为氨，用
什么是蛋白质？ 其元素组成？基本组成单位？分子结构？结构 与功能的关系？理化性质？如何分离纯化？
BCA法是根据蛋白质什么性质？ 呈色反应
A=KCL，标准管法或者标准曲线法计算
一.实验目的
1、掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理及操 作；
2、掌握722型分光光度计、移液管的正确 使用、试剂盘的正确摆放以及用标准曲线法 计算蛋白质的浓度；
BCA蛋白检测方法
BCA蛋白检测方法BCA蛋白检测方法是一种常用的蛋白定量方法，可用于测定溶液中的蛋白质浓度。
BCA是铜离子与蛋白质中的蛋白胆红素结合形成的蓝色化合物的缩写。
BCA法比传统的Lowry方法更准确、更灵敏、更稳定，并且适用于多种类型的蛋白质。
BCA蛋白检测方法的基本原理是：在碱性条件下，一些蛋白质会与铜离子形成配合物，进而产生可见光吸收的化合物。
这个化合物的颜色强度与溶液中蛋白质的浓度成正比。
通过比较待测样品与已知浓度的标准曲线上的吸光度值，可以确定样品中蛋白质的浓度。
1.制备标准曲线：准备一系列已知浓度的蛋白质标准溶液。
常用的标准蛋白质包括卵清蛋白、BGG和牛血清蛋白等。
将标准溶液分别稀释成不同浓度，并将其与BCA试剂反应，得到一系列不同浓度蛋白质的吸光度值。
2.准备待测样品：取待测样品，如细胞提取物或液态培养基，用适当的缓冲液稀释，以使其蛋白质浓度在标准曲线范围之内。
3.反应体系：取相应的试管或微孔板，在每个孔中加入适量的待测样品和BCA试剂，并混匀。
BCA试剂由两个核心试剂组成：A溶液和B溶液。
A溶液中含有碱式铜离子和蛋白胆红素，B溶液中含有琼脂糖和氢氧化钠。
4.反应：将试管或微孔板放入恒温水浴中，在37℃下反应30分钟。
在反应过程中，铜离子和蛋白质中的蛋白胆红素形成可见光吸收的蓝色化合物。
5. 吸光度测定：将吸光度计调至562nm波长，校准零点。
然后，使用吸光度计测量标准曲线中各浓度标准溶液和待测样品中吸光度的值。
吸光度与样品中蛋白质的浓度成正比。
6.构建标准曲线：将吸光度值绘制在纵轴上，将蛋白质标准溶液的浓度绘制在横轴上，通过拟合曲线，得到标准曲线。
7.计算待测样品中的蛋白质浓度：根据待测样品的吸光度值，利用标准曲线，可以确定样品中蛋白质的浓度。
蛋白质的定量分析 BCA法
蛋白质定量分析：BCA法
2020/3/3
主要内容
一.实验目的 二.实验原理 三.实验操作 四.注意事项 五.蛋白质定量分析方法
2020/3/3
一.实验目的
1、学习BCA法测定蛋白质浓度的原理及操 作； 2、掌握722型分光光度计、移液管的正确 使用、试剂盘的正确摆放以及用标准曲线法 计算蛋白质的浓度； 3、了解蛋白质含量测定的多种方法。
2020/3/3
五.蛋白质定量分析方法
紫外吸收特性
一
蛋白质元素组成特点
凯氏定氮法
二 紫外线（UV）吸收法
呈色反应
三 双缩脲法 四 Folin-酚试剂法 五 考马斯亮蓝结合法 六 BCA法
2020/3/3
2020/3/3
BCA法广泛用于科研工作，其特点： 1、操作简便，快速 2、准确灵敏，试剂稳定性好 3、经济适用 4、抗试剂干扰能力较强，不受绝大部分样 品中的去污剂、尿素等化学物质的影响
2020/3/3
2020/3/3
一、蛋白质的相关理论知识
1、元素组成（主要有C、H、O、N、S ）
16% 蛋白质的平均含氮量
样品中蛋白质的含量=样品中氮含量 ÷16%（或×6.25）
凯氏定氮法
将蛋白质转化为氨，用酸吸收后滴定
2020/3/3
共轭双键
2、蛋白质的紫外吸收
蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸的特征性吸收峰
原始记录 【实验结果】 【实验讨论】
2020/3/3
• 每个小组(2个人)写一份结果和讨论
• 格式如下:
•
组员
•
名称
• 原始记录
• 实验结果
• 讨论
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2020/3/3
BCA法蛋白定量
BCA法蛋白定量1 取干净的96孔板，在每个孔中加入20μL的蛋白标准品或蛋白样品。
2 每个孔中加入100μL BCA工作试剂，轻微震荡混匀30s，用不干胶纸覆盖该96孔板。
3 37℃温育30min。
4 取出96孔板，放冷至室温。
5 上酶标仪检测上OD562nm的读数。
6 制作标准曲线，根据标准曲线进行蛋白样品浓度的计算。
预处理：电泳前，计算好上样量，上样体积。
样品加入1×SDS loading buffer。
并于干式恒温加热器100℃，煮沸10min。
还原型5×SDS上样缓冲液（0.25mol/L Tris·HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油）配方如下：0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5mL二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）0.39gSDS 0.5g溴酚蓝0.025甘油 2.5mL混匀后，分装于1.5mL离心管中，4℃保存。
3.11.3 SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳开始实验前，先根据待检测抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。
装好架子，按照下面配方配制10％的分离胶。
在胶上面加入一层无水乙醇，促进胶更好的凝集。
待分离胶凝集后，配制4％的浓缩胶，插入预先准备好的1mm梳子。
10％分离胶和4％浓缩胶配方如下：10％分离胶（两块胶，10mL）4％浓缩胶（两块胶，5mL）超纯水 4.85mL 3.16mL 40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5mL 0.5mL1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）2.5mL －0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8）－ 1.26mL10％SDS 100 μl 50 μl 10%AP（过硫酸胺）50 μl 25 μl TEMED 5 μl 5 μl待胶凝集后，上样，电泳。
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蛋白质含量测定法（BCA法）标准操作规程
文件编码：SOPXXXX
目录
1. 目的 (1)
2. 范围 (1)
3. 职责 (1)
4. 依据 (1)
5. 定义 (1)
6. 内容 (1)
6.1. 原理 (1)
6.2. 实验材料 (1)
6.3. 操作步骤 (2)
6.4. 结果计算 (3)
6.5. 判定标准 (4)
6.6. 注意事项 (4)
7. 相关文件 (5)
8. 附件 (5)
9. 变更历史 (5)
1.目的
1.1.规范蛋白质含量检测（BCA法）的操作过程。
2.范围
2.1.本规程适用于BF02及其它适合于BCA法的样品（原液或成品）的蛋白质含
量测定。
3.职责
3.1.方法学研究员负责严格执行本规程规定；
3.2.方法学研究室负责人负责本规程的培训并监督本规程的执行。
4.依据
4.1.《中国药典》2015年版，通则0731“蛋白质含量测定法”，第四法2,2，-联
喹啉-4,4，-二羧酸法（BCA法）
5.定义
5.1.BCA：2,2，-联喹啉-4,4，-二羧酸法
5.2.BSA：牛血清白蛋白
5.3.TCA：三氯乙酸
5.4.EDTA：乙二胺四乙酸
5.5.EGTA：乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸
5.6.DTT：二硫苏糖醇
6.内容
6.1.原理
依据蛋白分子在碱性溶液中将Cu2+还原为Cu+，2,2，-联喹啉-4,4，-二羧酸（BCA）与Cu+结合形成紫色复合物，该复合物在562nm处有最大吸收值。
在一定浓度范围内，其溶液颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液（BSA）作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
6.2.实验材料
6.2.1. 试药与试液
6.2.1.1. 超纯水：电阻率不低于18.2MΩ·cm ，本方法所有试液均用超纯水配制。
6.2.1.2. 铜-BCA 试液：取2, 2'-联喹啉-4，4'-二羧酸钠l.0g ，无水碳酸钠2.0g ，酒
石酸钠0. 16g ，氢氧化钠0. 4 g 与碳酸氢钠0.95g ，加水使溶解成100ml ，调节pH 值至11.25,作为甲液，甲液室温保存不超过6个月；另取4 % 硫酸铜溶液作为乙液，乙液室温保存不超过6个月，临用前取甲液、乙液，按体积比（甲液：乙液=50:1）进行混匀后使用。
也可购买市售BCA 蛋白质定量试剂盒（Pierce BCA Protein Assay Kit ），货号：23225，厂家：Thermo ，内含Reagent A （即甲液）和Reagent B （即乙液），临用前取Reagent A 、Reagent B ，按体积比（Reagent A ：Reagent B=50:1）进行混匀后使用.
6.2.1.3. BSA 标准品溶液：取牛血清白蛋白标准品，按标示含量加水溶解并制成适
宜浓度（建议配制为1.0~2.0mg/ml ）。
分装后于-16℃至-24℃保存，保质期为12个月。
6.2.2. 标准物质
BSA （牛血清白蛋白）标准品，来源：购自中国食品药品检定研究院。
6.2.3. 仪器与用具
紫外-可见分光光度计、玻璃比色皿、移液器（5.0ml 、1000μl 、200μl 、100μl ）、涡旋混合仪、超级恒温水槽、具塞试管、计时器。
6.3. 操作步骤
6.3.1. 供试品溶液浓度预估
6.3.1.1. 原液：若样品无预估浓度，取样品用稀释液适当稀释后进行紫外光谱扫描
（扫描波长范围400nm~240nm ），确认紫外最大吸收波长（λmax ）及该波长下的吸光度值（A λmax ），据此估算待测供试品溶液的蛋白质含量，A λmax 宜控制在0.5 1.5之间，预估浓度（mg/ml ）= A λmax ×稀释倍数。
若样品提供方已有预估浓度，可不再进行紫外确认。
6.3.1.2.成品：供试品溶液预估浓度按标示含量稀释后的理论浓度计。
无需进行紫
外光谱扫描及吸光度确认。
6.3.2.供试品溶液的制备
6.3.2.1.原液：取供试品溶液适量，根据预估浓度，用稀释液将供试品溶液的蛋白
质浓度稀释至标准曲线浓度范围内（以0.2～0.3mg/ml为宜），每个供试品
做一个平行样。
6.3.2.2.成品：取供试品2瓶，按标示蛋白质含量，用规定体积的溶剂（见各品种
项下规定）将供试品复溶，同时用稀释液将复溶后供试品溶液的蛋白质浓
度稀释至标准曲线浓度范围内（以0.2～0.3mg/ml为宜）。
6.3.3.标准曲线制作：取牛血清白蛋白标准品溶液，用水稀释至0.5mg/ml。
按下
表稀释方法制作标准曲线。
标准品溶液均直接稀释至具塞试管内。
6.3.4.分别取稀释后待测样品溶液各500μl置具塞试管内，并做好标记。
6.3.5.配制BCA工作液（WR）：计算本次实验所需工作液的用量，取甲液、乙液
按体积比（甲液：乙液=50:1）进行混匀，混匀后为绿色溶液。
6.3.6.分别向标准品管及样品管逐管加入5.0ml工作液，立即混匀，置37°C水浴
中保温30分钟，取出至室温放置10分钟。
6.3.
7.照紫外-可见分光光度法，立即在562nm波长处测定标准品溶液和供试品溶
液的OD值；同时以0号管作为空白对照。
6.4.结果计算
6.4.1.计算标准品溶液在562nm处测量的OD值，以标准品溶液的浓度为X轴，
OD值为Y轴，作直线回归曲线，求得回归方程和线性相关系数。
线性相关系数R2应≥0.99，则数据有效。
6.4.2.将供试品溶液OD值分别代入标准曲线公式计算待测样品的蛋白质含量：6.4.2.1.供试品为原液：依据以下公式计算：C(x) = [A(x)-b]÷a×n
式中C(x)为供试品的蛋白质含量平均值（mg/ml）
A(x)为供试品的OD
b为标准曲线的截距
a为标准曲线的斜率
n为供试品总稀释倍数
6.4.2.2.供试品为成品：依据以下公式计算：C(x) = [A(x)-b]÷a×n×v
式中C(x)为供试品的蛋白质含量平均值（mg/瓶）
A(x)为待测样品的OD
b为标准曲线的截距
a为标准曲线的斜率
n为供试品总稀释倍数
v为供试品复溶体积（ml/瓶）
6.5.判定标准
见各品种项下标准规定。
6.6.注意事项
6.6.1.购买的BCA蛋白质定量试剂盒中，已经带有BSA标准溶液，浓度为2.0mg/ml，
建议在实际操作中使用自行配制的相应浓度的BSA标准品溶液。
6.6.2.由于不同次实验中，工作液的配置会有一定偏差，实验室温度也不会完全保
持一致，所以每次样品测定时均需要重新制作标准曲线。
6.6.3.供试品溶液稀释时，为保证稀释准确，最大稀释倍数不要超过12倍，最小
取样体积不要低于50μl。
6.6.4.为保证实验结果的准确性，严格控制对照品溶液与供试品溶液的反应时间，
使其保持一致。
6.6.5.样品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵、脂质，会影响检测结果，高
浓度的去垢剂也会影响实验结果，可用TCA沉淀去除干扰物质。
7.相关文件
8.附件
9.变更历史。