植物细胞与原生质体培养

（4）培养：26℃置暗处培养21天。低倍显微镜 观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置板效 率（也称植板率）。
植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分 数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个 能长出细胞团）。

每个平板上形成的细胞团数
植板效率= 该平板上接种的细胞数
平板培养注意事项：
（1）培养基：无论是否条件培养基，必须是能够 在低的初始植板密度下使细胞生长。
静止期：生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极 少，甚至开始死亡。
培
养
细
胞
5
数 目
4
3 2 1
培养时间
1 滞后期
2 对数生长期 3 直线生长期 4 缓慢期 5 静止期
继代
•继代方法： 用注射器或移管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培 养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。
（2） 连续培养(Continuous culture):
（2）细胞：选用处在分裂旺盛时期的细胞才有最 高的植板率。
（3）在固体培养基中适宜的初始植板密度因植物 种类而不同。如：烟草细胞适宜的为5-10×10³ 个/mL,若低于此数则植板率显著下降。
（4）接种时培养基的温度要控制，一般不超过35 ℃。
2.看护培养的含义及用途 含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个
一、单细胞培养（通常以叶片为材料） （一）单细胞的分离 1、机械法（用刀片刮叶、叶片研碎离心）
2、酶解法
刀片刮叶
撕去下表皮 露出叶肉细胞 用解剖刀刮下细胞
叶片研碎、离心
加研磨介质 研碎成粉
过滤、离心
酶解法
Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量 的叶肉细胞
加果胶酶
过滤、离心
迅速注入培养皿 中，制成平板，
厚度 1mm 培养
平板培养的基本技术 (1)培养基配制 1.4%琼脂基本培养基+等量细胞培养 液=0.7 % 琼脂条件培养基。 (2)悬浮细胞密度的调制 平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为 1×10 ³~ 100×10 ³个/mL。 初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮
是利用培养罐等装置进行细胞大量培养的 一种方式。在半连续培养时，当培养容器内细 胞增殖到一定数量后，倒出一半细胞悬浮液于 另一培养罐等容器，再分别加入新鲜培养基继 续培养。半连续培养能够重复获得大量均一的 培养细胞供进一步利用。
3、悬浮培养中细胞生长量的计算
① 细胞计数：5％铬酸或0.25％果胶酶使悬浮细胞 团分散用血球计数板进行。
第三节 植物原生质体培养及细胞融合
一、植物原生质体培养 通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露
的植物细胞，即为原生质体(Protoplast)。游离的 原生质体像正常的植物细胞那样具有全能性，在 一定条件下培养可以重新再生出完整植株。
（一） 原生质体培养的目的：
1、利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移 植和外源物的摄取，原生质体之间可以进行融合而产生 杂种细胞(即体细胞杂交）。
呈S增长；必须适当搅拌 。
细胞生长各个时期的特点：
滞后期（延迟期）：细胞很少分裂，其长短与接种量 大小和继代时原种细胞所处的生长期有关； 对数生长期：细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长 速率保持不变； 直线生长期：细胞生长和发育最明显的时期；
缓慢期：生长逐渐缓慢，培养液消耗将尽，有毒代 谢物质增多，氧气减少；
悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
2、悬浮培养类型：
（1）分批培养(Batch culture)：在一个封闭的系统 中进行细胞培养，当培养物增加到一定量时，需 继代培养，即取出少量培养物转接于新鲜培养液 中。
特点：培养基体积固定； 培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，
相差显微术法
观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正常、核 存在表明有活力；
TTC法（2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑）
在活细胞中，TTC被还原成红色甲鐟，提取分光光 度计检测。
FDA法（荧光素双醋酸酯法） 伊凡蓝法
互补
活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则不能， 凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞
液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。
若悬浮液与培养基以1:4混合， 则应把悬浮液的细胞密度调到 5×10³-500×10³个/mL。
调制方法：若悬浮液中细胞密度高，则加培养 液稀释；若悬浮液中细胞密度过低，则通过离 心使细胞沉淀后，取一定量的上清液使其达到
所要求的密度。
（3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35 ℃ ） 条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板， 盖上培养皿盖。用封口膜封严培养皿。
2、是植物基因工程的理想受体，用外源遗传物质对植 物原生质体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化再生 出能育的完整基因工程植株。
3、也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系 变异和植物病理学研究的有用工具。
(二) 原生质体的制备： 1、材料来源与预处理： （1）材料来源：
可以用各种组织和器官，但多应用叶片、 愈伤组织及悬浮培养细胞。
是用一定容积的非密闭系统进行细胞培养的方 法，在培养过程中不断注入新鲜培养基，而使营养 物连续得到补充，细胞生长和增殖连续进行，同时 有等体积的培养物排除系统。
分为封闭型和开放型连续培养两种。
连续培养（Continuous culture） 加入培养基
二者体积相等 排出培养基及其培养物 分：开放式连续培养（Open C.C） 封闭式连续培养（Closed C.C）
用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞 团的过程。
微室培养特点：
在培养过程中可以连续进行显微观察，将一个细胞 的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。
微室培养要求： （1）微室内不能有气泡。
（2）最好微室的厚度不要超过20微米，盖玻片的 厚度要在0.17~0.18毫米左右。
（3）观察时要保持温度和培养时的一致。
（3）将分离出的单个细胞接种到培养基的滤纸上。 （4）恒温培养。
注意事项：
（1）看护愈伤组织处于活跃生长状态； （2）要得到单细胞系必须保证接种材料是真正的单 细胞。
（3）愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个物种 也可以不同。
离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养 下则分裂，为什么？
3.微室培养法：悬浮单细胞接种于凹玻片或玻璃环与 盖玻片组成的微室内的固体培养基中的培养方法。
二、细胞的悬浮培养(cell suspension culture)
特点：细胞可以不断增殖，形成高密度的 细胞群体，适于大规模培养；能够提供大 量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、 分化创造方法和条件。
1、起始悬浮液的制备
转速30-150rpm 2-3cm冲程
防细胞破裂
愈伤组织
液体培养基
摇床振荡
FDA法的原理
FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出 入细胞膜。
在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极性的荧 光素。
荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。
荧光素在死细胞中不能积累。
在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧光。
第二节 植物细胞培养的应用
1、细胞培养产生次生代谢产物：生产天然的 植物成分（药品、香料、染料、糖类等）； 生物转化得到中间产物；细胞的工厂化生产。
第 七 章 植物细胞及原生质体培养
第一 节 植物细胞培养 第二节 植物细胞培养的应用 第三节 植物原生质体培养及细胞融合
第一 节 植物细胞培养
植物细胞培养（plant cell culture）：
指对植物器官或愈伤组织上分离出来的 单细胞(或小细胞团)进行培养，形成单细无 性系或再生植物的技术。
（2）预处理：
低温处理（4℃、黑暗1～2天） 等渗溶液处理。
2. 制备原生质体的酶类：
A. 纤维素酶，如Onozuka R-10及RS，国内常用的为GA3-867， 其中含少量果胶酶，使用浓度0.5-2.0%；
B. 果胶酶，如Macerozyme R-10 又叫离析酶，主要含果胶酶， 活力较高，其含杂酶较多，用量不超过2％，作用时间长有毒害作 用；此外亦用Pectalyase Y-23，也叫离析软化酶，活力极高， 叶法和酶解法比较
机械法
细胞不受到酶的伤害； 不用质壁分离； 细胞产量低； 细胞易破。
酶解法
细胞受到酶的伤害； 要质壁分离； 细胞产量高； 细胞不易破。
（二）单细胞培养培养
培养方法：平板培养、看护培养、 微室培养、条件培养基培养法。
1.平板培养法： •定义：分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的 培养皿内的培养过程称为平板培养法。
C. 崩溃酶（Driselase)，为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶 酶活性；
D. 半纤维素酶，如Rhozyme HP150，用于悬浮细胞、豆科根 瘤、幼苗子叶及根细胞原生质体的分离使用浓度0.1-0.5%;
E 蜗牛酶，主要用于体细胞原生质体分离。
酶液配制：
需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫 酸酯、CaCl2·2H20(0. 1mmol/L-10mo1/L)及KH2PO4 (0. 75mmol/L)等渗透稳定剂，以维持原生质体完整性。
酶液pH值相当重要，纤维素酶及果胶酶单独使用 时，其pH分别以5.4及5.8为宜；混合使用时pH5.4pH5.6为宜，降至4.8以下则原生质体破裂。酶液配制 后需以0.45 um微孔膜过滤除菌，而不可采用加热灭 菌法。
3．原生质体分离及纯化
② 细胞密实体积（PCV）：将体积已知、均匀分 散的悬浮液放入一个 15mL 的离心管中，2000 转下离心，用每mL培养液中细胞总体积的mL 数表示。
③ 细胞鲜重：细胞培养物过滤，洗去培养基，真 空抽虑，称重。