细胞爬片免疫组化步骤
细胞爬片染色步骤
免疫组化法：
1 胰酶消化细胞，收集至离心管；调整样本细胞数为1×106/ml；
2 将单细胞悬液滴加至平皿内无菌载玻片表面，置于37℃ 5%的加湿CO2孵箱中过夜，使细胞爬片。
3 吸弃平皿内培养上清，加入新鲜培养基，用无菌培养基洗3次；
4 PBS冲洗相应方案的载玻片3次；
5 将载玻片置于95%乙醇中固定约1h；
6 倒置相差显微镜下观察，并划定载玻片上细胞爬片密集区；
7 在相应区域滴加按一定比例稀释后一抗，4℃冰箱内过夜湿孵。
阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。
8 先暂复温30min，后PBS冲洗载玻片3次；
9 滴加二抗，室温湿孵30min；后PBS冲洗载玻片3次；
10 DAB显色：将配置好的DAB溶液滴加至载玻片上，室温下孵育3min至载玻片略显黄色；
11 清水充分冲洗载玻片，苏木素复染核3-5min，清水冲洗，盐酸酒精分化20s，清水冲洗，氨水返蓝3min，清水冲洗，后置于75%-80%-95%-无水酒精中脱水，每步骤约2min；
12 将载玻片置于1、2、3道二甲苯中，各约15min，中性树脂封片，置于阴凉通风处风干。
超详细的免疫组化步骤
超详细的免疫组化步骤免疫组化步骤操作步骤取出细胞-------PBS冲洗3次，每次5分钟-------用预冷的丙酮或甲醇溶液固定10分钟----PBS 冲洗3次，每次5分钟-----每张爬片加50ul非免疫性动物血清（封闭液）室温下10分钟---甩掉封闭液-----加一抗50ul，37℃培养箱孵育60分钟，或4℃过夜--------PBS冲洗3次，每次5分钟----每张爬片加二抗50ul,37℃或室温30--60分钟---PBS冲洗3次，每次5分钟----显色，酶标二抗加酶的底物（如DBA）染色，显微镜下观察3--10分钟，控制染色情况---自来水冲洗，苏木素复染，中性胶固定-------金标记或荧光标记在显微镜下直接观察。
结果判读：根据阳性对照和阴性对照，判断免疫染色是否成功。
阳性细胞定位是否明确，是胞膜，胞浆还是胞核阳性，间质是否清晰，无背景着色，同时阳性细胞达5%以上，方为阳性。
注意：浓缩型抗体应根据厂家提供的抗体效价，进行分装，按50ul或100ul分装，放入-20---70℃冰箱保存1--5年。
用PBS稀释抗体在4℃可放1--3天。
使用时必须按不同免疫染色方法找出抗体最佳稀释度。
即用型抗体可直接使用，无需稀释阴性对照可以使用PBS或10%的正常非免疫动物血清。
（用PBS 或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致，排除有无一抗外的非特异性染色。
）阳性对照可使用自己收集或购买的阳性切片。
假阳性：抗体的稀释度不正确，浓度太高；部分多克隆抗体的特异性问题。
假阴性：抗体和检测试剂盒配对不合理。
如单克隆抗体（多为鼠）试剂盒应为鼠用试剂盒；多克隆抗体（多为兔）试剂盒应为兔用试剂盒。
抗体浓度太低；孵育时间太短(SP法一抗孵育时间为1小时，二抗，三抗为10分钟；PAP 法或ABC法一抗为1小时或过夜，二抗，三抗为30分钟)；染色步骤错误；染色过程爬片过分干燥。
封闭液：封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
细胞爬片固定及免疫荧光的操作步骤
细胞爬片固定及免疫荧光的操作步骤细胞爬片：1.埋板准备：准备含有合适培养基的细胞培养板或培养皿。
将培养基预热至适宜的温度。
2.细胞处理：将需要爬片的细胞株从库存中取出，用PBS（磷酸盐缓冲液）或无酶胰蛋白酶溶解细胞外基质粘附，用培养基洗涤细胞。
3.细胞计数：用血细胞计数板或细胞计数仪计数细胞浓度，然后根据需要调整到合适的细胞密度。
4.接种细胞：将适量的细胞接种到埋板中，根据实验要求可以采用单细胞克隆或稀释传代法。
5.培养细胞：将埋板放入细胞培养箱的适当环境中，通常为37°C、5%CO2的培养箱。
根据实验需要，培养时间可以从几小时到几天不等。
固定：1.筛选固定剂：选择适合的固定剂，常用的固定剂包括乙醛和甲醛等。
2.固定细胞：使用适当的浓度的固定剂，将培养的细胞浸泡在固定剂中，通常需要15-30分钟的固定时间。
3.洗涤细胞：使用PBS等缓冲溶液洗涤固定的细胞，去除多余的固定剂。
免疫荧光：1.孔板准备：将需要进行免疫荧光染色的细胞或组织培养在培养皿或孔板中。
2.阻断非特异性结合：用0.1-5%BSA或牛血清等蛋白质溶液阻断非特异性结合位点，减少假阳性信号。
3.一抗染色：加入适当浓度的一抗（具体浓度由厂家确定）到需要染色的细胞上，对于细胞表面的抗原，可以直接在细胞外孔板中加入一抗。
4.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤一抗残余的溶液。
5.二抗染色：加入与一抗同种小鼠或兔子抗体的特异性抗体（如荧光素、奥林染色试剂等）到孔板中，适当的浓度需根据实验所需，与一抗使用的缓冲液一致。
6.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤二抗残余的溶液。
7.成图：用荧光显微镜观察样品，利用相应的激发波长和荧光滤镜观察和拍摄免疫染色的图像。
细胞爬片、固定和免疫荧光技术的步骤可以根据具体实验的要求进行调整和优化。
这些操作步骤在细胞和分子生物学研究中非常重要，可以用于检测和观察各种细胞结构和分子的表达和分布。
整个过程需要细心和耐心，并且需要严格控制各个步骤的条件以确保实验结果的准确性和可重复性。
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。
4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。
2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。
蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。
5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。
PBS洗三次，每次5分钟。
6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。
9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。
10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。
12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。
稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。
淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。
苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。
盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。
我没用淡氨水溶液。
若为悬浮细胞则需涂片，20µl即可。
细胞免疫组织化学实验流程及注意事项
九、细胞免疫组化实验
1. 细胞爬片的制作
(1) 细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2-5×10^5ml ；
(2) 在无菌培养皿中铺上3 块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠；
(3) 取细胞悬液分别滴到圆片或载玻片上，注意不要滴到片外，让细胞贴片30min 左右;
(4) 30min后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢)
2. 组化前处理
(1) 取出培养皿，用PBS 漂洗3 次×2min （PBS 可以不灭菌）；
(2) 4%多聚甲醛处理（室温）10-30min ；
(3) PBS 漂洗，3 次×2min ；
(4) 0.2%Txiton X-100 处理（室温）10-15min ；
(5) PBS 漂洗，3×2min；
(6) 3%H2 O2 处理（室温）10min ，以消除过氧化物酶；
(7) PBS 漂洗，3 次×2min ；
3. 组化（同免疫组化）。
贴壁细胞需要做免疫组化时，可以在培养皿里放入盖玻片，让细胞长在上面后，在取出来进行实验。
需要注意的是：取出培养好细胞的盖玻片后，PBS洗两次后，室温晾干用PFA或丙酮室温或4度固定都可以，10～15分钟。
之后可按组化常规方法进行。
封片时将有细胞的面向下盖在载玻片上即可。
另外，用丙酮固定细胞的同时即对细胞膜进行了打孔的步骤，如果用PFA进行固定，则需要再使用打孔剂打孔（细胞内表达）。
使用过氧化氢去除内源性过氧化物酶时，细胞要比石蜡切片的组织反应强烈，偶尔会掉片。
细胞免疫组化
细胞免疫组化细胞爬片的免疫组化1.细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色定。
2.PBS清洗标本3次各1min。
3.冰丙酮固定15min(或4%多聚甲醛固定30min)。
4.5.PBS7.PBS9.DPBS10.11.12.PBS13.14.PBS15.试剂D（湿盒）37℃30min。
16、PBS清洗标本3次各5min。
17、DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min。
18、蒸馏水洗2次1min。
19、苏木素复染0.5~1min。
20、自来水洗返蓝。
21.梯度酒精脱水75，85，95，100%各3min。
22.二甲苯透明2次3min。
23、中性树胶封片。
注意事项：1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须ab2、可用345、细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做？1.如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些，但是做的时候要防止脱落。
如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在24孔，或6孔板里做才可以。
中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看细胞本身的荧光。
2.孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。
细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能，只有开始就让细胞贴在玻片上爬片。
3.我没有在多孔板里做过，其实把细胞爬在盖玻片上也不是很麻烦，偶这样做很少掉片。
1..多谢!!0.04--0.08%议对于细胞爬片，还是尽量快的进行处理，以防不必要的问题!2.louischenwrote:但我的细胞爬片经过4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后直接就放在了-20度，还能用于免疫组化吗?!3.mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定,固定液需加DEPC水。
其它建议用甲醇固定。
-20度保存4.如果是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保存两周没问题。
时间再长就没试过了。
5.丙酮中固定5-10分钟，然后风干，放置4度保存过夜应该是没有问题。
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取岀来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发岀一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
细胞载玻片爬片培养法进行免疫组化染色方法介绍 - 天津灏洋
细胞载玻片爬片培养法进行免疫组化染色方法介绍天津市灏洋生物制品科技有限责任公司郑斌徐彬传统的细胞爬片中使用24孔板或96孔板，因为是塑料材质不利于抗原热修复，而盖玻片较薄，易碎不容易取出，二者均存在一定的缺点。
本实验采用体外细胞载玻片爬片培养法，便于做热修复，同时操作较方便、简单、实用。
1 材料1．1 载玻片的处理：用肥皂水将载玻片洗净，自来水冲洗，晾干，再将载玻片浸泡在洗液中2~3小时，取出后再用自来水冲净，蒸馏水冲洗三遍，用干净的纱布将载玻片擦干，放在饭盒中，置170℃干烤5小时消毒灭菌。
1．2 人乳腺癌细胞系T47-D、人骨肉瘤细胞系U2OS。
1．3 仪器倒置显微镜、光学显微镜、二氧化碳培养箱、隔水式电热恒温培养箱等。
1．4 试剂胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、免疫组化试剂盒、无水乙醇、抗葡萄糖转移酶（Glut-1）多克隆抗体、抗脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（APE1）单克隆抗体、抗血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体、PBS(含0.01M 磷酸盐缓冲液，0.85%NaCl，pH 7.2~7.4) 、0.1 M枸橼酸缓冲液（pH 6.2~6.4）、分化液（10%乙醇、0.5%盐酸）、二甲基联苯胺（DAB）等。
2 方法2．1 细胞爬片培养取人乳腺癌细胞系T47-D细胞及人骨肉瘤细胞系U2OS细胞各一瓶，用吸管吸除培养瓶内旧培养液，向培养瓶内加入2ml 0.25%胰蛋白酶,覆满瓶底。
室温放置5分钟后镜下观察，发现细胞变圆、细胞间隙增大后，立即终止消化，翻转培养瓶，使瓶底向上。
将胰蛋白酶吸去，加入约2ml含10%胎牛血清的DMEM培养基，将细胞从瓶壁上吹打下来，制成细胞悬液，滴于已处理好的载玻片上，每张片子1~2滴，注意:滴于载玻片后1/3的位置，且不能有汽泡。
放在37℃ 5%CO2培养箱中继续培养过夜。
2．2 细胞的固定培养箱取出，用PBS将培养液洗去，放 将已培养过夜的细胞爬片从5%CO2在冷乙醇中室温固定30分钟后，取出爬片放置在切片盒内-20℃储存，待免疫组化染色。
爬片和组化的实验步骤
爬片和组化的实验步骤实验九组织切片与细胞爬片/涂片的HE染色【实验目的】1．掌握细胞涂片的HE染色方法2．熟悉细胞涂片及爬片的制备方法【实验原理】苏木素-伊红染色又称HE染色，是目前应用最广泛的染色方法。
苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
HE染色主要用于显示各种组织的正常成分和病变组织的一般形态结构，各种组织或细胞的一般形态、结构特点和病变的发生、发展及修复的全过程，在质量较佳的HE染色切片上，基本上都可以观察到，从而进行判定或研究。
HE 染色适用于各种固定、包埋方法制作的石蜡切片、冰冻切片和细胞涂片，且切片不易褪色，可以长期保存。
HE染色在病理诊断、教学和科研中具有重要的价值。
【实验方法】1．细胞爬片的制备（1）将灭菌的载玻片放入培养板内。
（2）将培养好的贴壁细胞消化后离心，计数，按照一定的细胞密度加入孔板中，根据实验目的选择培养基或加入药物。
（3）将孔板放入37℃二氧化碳孵箱中孵育数小时或过夜，待细胞的贴壁密度符合实验要求时，吸去孔板内的培养基或药物，用37℃预温的0.1mol/LPBS漂洗一次。
（4）吸去孔板内的PBS液，加入4%多聚甲醛室温固定15～30min。
（5）吸去4%多聚甲醛，用PBS漂洗3次，每次间隔3min。
（6）取出细胞爬片，晾干后存放于-20℃或直接进行染色。
2．细胞爬片的制备备选方法将培养好的贴壁细胞消化后离心，计数，按照一定的细胞密度加入孔板中（24孔），根据实验目的选择培养基或加入药物，培养到预定时间点。
取出培养板，1000rpm离心5min后，弃上清。
每孔加入PBS2ml,1000rpm离心5min，弃上清；重复1次，共进行2次洗涤。
3．细胞涂片的制备收集处理的细胞，PBS洗2次后，调细胞密度为0.3～0.5某106/ml,按照每片0.1ml，用涂片离心机制备涂片；或者调细胞密度为0.3～0.5某107/ml,取0.005ml涂于载玻片上。
细胞免疫组化实验步骤
细胞免疫组化实验步骤细胞免疫组化实验步骤：1）脱蜡与水化：将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。
而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接对着切片冲洗）。
PBS洗3次，3 min/次。
2）细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片30min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3次，3 min/次。
3）抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新“满血复活”。
这里常用微波修复，pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复2次，每次补足液体以免干片。
（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。
PBS洗3次，3 min/次。
4）血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。
此时可用“祖传”的油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。
5）孵育一抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的一抗20ul，4℃过夜或者37℃1-2h。
PBS洗3次，3 min/次。
（一般4℃过夜后，需要将切片放置37℃复温45min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）6）孵育二抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的二抗20ul，37℃1-2h，PBS洗3次，3 min/次。
7）切片显色：用DAB-H2O2显色10min，显色液最好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10min内即可用蒸馏水终止显色。
8）复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用Mayer苏木素染色30s，水洗，盐酸酒精分化2s，流水浸入15min。
免疫组化实验步骤
免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
细胞爬片的免疫组化
细胞爬片的免疫组化（05-9-25）
实验目的：
1、通过免疫组化的方法观察C6细胞GFAP和MAP2的表达情况；
2、进一步熟悉和完善免疫组化的方法；
3、进一步检测现有一抗是否起作用。
实验准备：
1、接种两天、生长状态良好的细胞爬片；
2、免疫组化/荧光公共实验平台；
3、一抗，SP试剂盒，DAB显色剂等。
主要过程：
1、爬片弃废液，PBS洗3min×3遍；
2、4％PFA室温固定10min；
3、PBS洗3min×3遍；
4、加SP试剂盒中的A（过氧化物酶阻断剂），室温作用10min；
5、PBS洗3min×3遍；
6、加B（正常非免疫动物血清封闭液），室温作用10min；
7、加一抗：mouse anti GFAP 1：50，MAP2 1：50各50μl对照加等量PBS，4℃
保湿8h；
8、PBS洗3min×遍；
9、加C（生物素化二抗），室温作用10min；
10、PBS洗3min×3遍；
11、加D，室温作用10min；
12、PBS洗3min×3遍；
13、新鲜配制的DAB显色，显微镜下观察，适时终止（5min左右，PBS洗
掉）；
14、PBS洗3min×3遍；
15、苏木素复染胞核1min，自来水小心冲洗至玻片呈蓝色；
16、梯度酒精脱水（70％、80％、90％、95％、100％）各5min；
17、二甲苯/无水乙醇1：1 10min；
18、二甲苯透明：15min×2；
中性树胶封片，观察、拍照。
免疫细胞化学步骤及说明
1. 细胞爬片制备盖玻片在75%酒精浸泡24h以上，超净台内酒精灯上烤干。
六孔板内分别滴入一滴培养液，盖上盖玻片。
分别加入等量细胞，常规培养至细胞70%左右融合。
关于盖玻片的准备，有很多种说法，但我的做法比较简单，这样做不会脱片，也不影响观察。
2. 细胞固定6孔板置冰上冷却，吸尽培养液。
4℃PBS，洗5min×3次。
吸去残留PBS，空气干燥，细胞面微潮湿时，加入预冷95%酒精固定液，浸没细胞面，更换预冷95%酒精2次，第三次在-20℃静置20min。
这一步用4%多聚甲醛可能更省时省事。
3. SP法免疫组化染色步骤(1)细胞爬片蒸馏水洗5min×1次，PBS浸泡5min。
固定之后的细胞一般不会脱落，可以放在摇床上洗。
(2)滴加3%H2O2去离子水，室温孵育30min。
PBS洗5min×3次。
(3)滴加0.3%Triton X-100（全液用蒸馏水稀释）通透30min。
PBS洗5min×3次。
细胞通透很重要，因为蛋白在胞内，我第一次做时没有通透，结果什么都没有。
(4)BSA封闭，室温10min。
倾去，勿洗。
(5)滴加一抗(a-actin l:300)，4℃过夜。
PBS洗5min×3次。
抗体的浓度是自己摸索出来的，还有听说4℃过夜是比较合适的做法。
(6)滴加二抗(聚合HRP标记抗小鼠IgG)，室温30min。
PBS洗5min×3次。
(7)按1mL蒸馏水+A、B、C（DAB试剂盒，要按顺序滴加）各一滴，混匀，镜下显色观察，注意避光。
蒸馏水充分冲洗。
(8)苏木素染2min。
自来水充分冲洗。
(9)依次在75%→85%→95%→100%浓度酒精中浸泡2min脱水。
封片之前常规有二甲苯透明的，但我滴加了二甲苯之后，片子变得很脏，不知什么原因。
后来就不加了，直接脱水后封片，现在看来片子还不错啊。
而且二甲苯太呛人了。
(10)中性树胶封片。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2.水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7."2―7."4）：NaC137mmol/L，KCl2."7mmol/L ,Na2HPO44."3mmol/L, KH2PO41."4mmol/L.2．"0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6."0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0."4g。
3．0."5mol/L EDTA缓冲液（ph8."0）：700ml水中溶解186."1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph 8."0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8."0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH 8."0,加水1000ml。
5.酶消化液：a.0."1%胰蛋白酶:用0."1%CaCl 12(ph7."8)配制。
b.0."4%胃蛋白酶液：用0."1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a.甘油和0."5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9."0–9."5）等量混合b油和TBS(PBS)配制8．"TBS/PBS PH9."0–9."5,适用于荧光纤维镜标本;ph7."0-7."4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。
4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。
2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。
蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。
5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。
PBS洗三次，每次5分钟。
6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。
9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。
10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。
12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。
稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。
淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。
苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。
盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。
我没用淡氨水溶液。
若为悬浮细胞则需涂片，20µl即可。
细胞贴片免疫组化染色步骤
葡萄球菌A蛋白（staphylococal protein A，SPA）
一、特性：
1、多肽单链蛋白，对热和变性剂十分稳定 ； 2、 能与某些哺乳动物IgG的Fc段特异性结合； 3、可以被各种标记物所结合，形成SPA标记物 。
二、应用
SPA主要在免疫组织化学中替代连接抗体（桥抗体），可不受动物
种属限制。
⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹 配的溶液中不应含有叠氮钠； ⑨ 检查复染剂、脱水、透明和封片剂是否和所使用的色原匹配如：HRP用中性 树胶，荧光素用水溶性封片剂，AEC等不能用二甲苯有机溶剂透明。
（二）信号弱
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了上述因素外，还有： 1. 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高； 2. 抗原修复方式不当 ； 3. 抗原位于细胞内，未使用穿孔剂 如0.05%TritonX-100或EDTA，有助于抗 体渗透入细胞内，也可降解内源性Fc受体； 4. 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确 ；
（三）着色部位改变
1. 间质着色：原因很多：抗体与组织中的蛋白质因疏水基团相互作用形成非 特异性的连接造成，血清封闭可避免此中影响因素；靶抗原外溢到组织间隙； 抗体不纯或被污染；
2. 细胞浆着色 ：内源性物质残留如酶、生物素或产生非特异性吸附的蛋白；
3. 细胞核着色：不适当的组织处理可以出现细胞核着色，如组织在二甲苯、 缓冲液中浸泡时间过长、组织变干、修复液pH值和修复时间不当、组织没有 浸没在修复液中等。
2.封闭液的使用：是否选择使用了正确的封闭血清 ；
3.所选择的抗体是否符合试验要求 ，主要是抗体纯度； 4.一抗的使用浓度是否过高 ； 5.清洗是否充分 ，DBA的使用是否正确 ，边缘效应； 6.检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应 ； 7.组织抗原弥散等。
心肌细胞和成纤维细胞免疫组化步骤
心肌细胞和成纤维细胞免疫组化步骤准备：1.心肌细胞培养常规准备（加洗盖玻片），六孔板2.免疫组化前的准备：溶液配制：1000mlPBS (0.02M，ph值为7.2－7.6)，配法：1000ml蒸馏水中加氯化钠8.5g，磷酸氢二钠2.8g，磷酸二氢钠0.4g0.6%H2O2：30％H2O2一份加纯甲醇50份混合4％多聚甲醛一抗：抗体稀释成1：800、1：700、1：600 用抗体稀释液稀释成各1ml，装EP管中。
以上溶液在做免疫组化前配制苏木素染液, SABC, 5％BSA封闭液, DAB湿盒平皿10对实验步骤：1.细胞爬片心肌细胞：差速贴壁后，将心肌细胞以5×106的密度接种至含盖玻片的六孔板中（6个孔），48小时内加BRDU后换液，换成无血清培养基培养24小时后进行实验。
成纤维细胞：48小时后将贴壁的成纤维细胞用0.25％的胰酶消化后重悬细胞于含有盖玻片的小平皿中，24小时后进行实验。
2.ABC免疫酶染色A. 已经爬好的盖玻片，使其浸泡PBS5分钟，两次。
再将玻片浸泡入4%的多聚甲醛中，固定30分钟，风干，－20度保存。
B. 过蒸馏水两次，1－3分钟。
C. 30%H2O2一份加纯甲醇50份混合，室温浸泡30分钟。
蒸馏水洗3次，一次约一钟D. 滴加5％BSA封闭液，室温20分钟，甩去多余液体，不洗。
E. 滴加1：800、1：700、1：600的一抗，放入湿盒中4度过夜或37度1小时。
如4度过夜，拿出后在室温下复温20分钟，再水浴30分钟，37度。
F. 加二抗37度20分钟，用PBS冲3次，每次2分钟。
G. 滴加试剂SABC，37度，20分钟。
PBS洗4次，每次5分钟。
H. DAB显色: 取1ml蒸馏水，加试剂盒中的A,B,C试剂个一滴，混匀后加至切片。
室温显色，镜下控制反应时间，一般再5到30分钟，水中中止。
I．冲蒸馏水，苏木素复染2分钟，自来水冲5分钟J. 烤干，封片。
免疫细胞化学
一．细胞爬片制作：消化脱壁，稀释后每孔中加2ml细胞悬液，37。
C培养2天（勿让细胞密度过大）。
二．吸去培养基，【每孔加2ml PBS，浸泡（勿冲刷、触及爬片）2min，吸去】*3。
此过程中一根吸管专门用于吸来PBS，一根用于吸去。
三．4%多聚甲醛固定10min（加量以覆盖爬片为准），PBS*3。
四．过氧化氢1~2滴，室温6min，PBS*3。
封闭血清1~2滴，室温10min，予纸巾吸干。
五．于1.5ml EP管中混合（0.5ml PBS、1ul一抗、1.5ul Triton、封闭血清1滴）。
每孔加适量上述混合物，4。
C过夜。
六．PBS*3，纸巾吸干。
每爬片加二抗1滴，37 。
C，30min。
七．PBS*3，加DAB（预先避光配制，1滴浓缩液+1ml缓冲液），室温暗处放置1~2min后即镜下观察。
阳性反应最强而背景开始着色，即以水冲洗5min停止反应（勿直接冲刷爬片表面）。
八．苏木素细胞核染色1min，自来水洗去。
九．逐级脱水（3个50ml离心管中分别配制70%、95%、无水乙醇），二甲苯透明，树脂封片。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于病理学和生物医学研究中，用于检测和定量分析组织或细胞中特定抗原的方法。
它通过将标记有特定抗体的染色剂与细胞或组织中的相应抗原结合，从而实现对抗原的定位和可视化。
以下是免疫组化操作的详细步骤：准备组织样本：1.选择需要研究的组织样本，可以是固定的组织块、冰冻切片或细胞涂片。
2.如果是固定的组织块，使用福尔马林等适当的固定剂进行固定，并进行脱水和包埋。
3.如果是冰冻切片，将组织冷冻在液氮中，使用微型切片机切割薄片。
4.如果是细胞涂片，将细胞均匀涂布在载玻片上。
脱脂和再脱水：1. 对于固定的组织块和细胞涂片，使用低渗透性石蜡溶液（如xylene）进行脱脂，一般需要多次处理。
2.使用梯度酒精浓度（例如100%，90%，80%和70%）进行再脱水处理，每个浓度的浸泡时间一般为5-10分钟。
抗原修复：1.固定的组织块可使用热诱导抗原修复（如加热高压反应釜中）或酶诱导抗原修复（如2%的蛋白酶）进行抗原修复。
2.冰冻切片和细胞涂片不需要抗原修复。
阻断非特异性结合位点：1.使用一种非特异性抗体，如牛血清蛋白、小鼠和兔血清、杂交小鼠兔血清混合物等，进行阻断非特异性结合位点，减少假阳性反应。
一抗和二抗处理：1.加入特异性一抗，该抗体将结合目标抗原。
一抗的浓度根据实验要求和文献建议进行选择。
2.在室温下，对样本进行适当时间的孵育，以便一抗与抗原结合。
4.加入标记有荧光素或酶素的二抗，如荧光素-同种同型抗体或酶标记的抗小鼠或抗兔免疫球蛋白。
5.孵育样本适当时间，以便二抗与一抗结合。
洗涤：1.使用缓冲液对样本进行洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。
2.洗涤的时间和次数根据实验要求和抗体的特性进行调整。
可视化和显色：1.对于荧光标记的二抗，使用荧光显微镜观察并拍摄图像。
2.对于酶标记的二抗，使用适当的显色物质，如DAB（3,3'-二氨基苯啶）或VIP（维泊酶）等，进行显色反应。
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1.转染48小时后，弃去旧液，1ml PBS洗两遍用BD公司的固定透膜液400ul （Fixation and Permeabilization Solution）于4度冰箱内固定透膜20分钟后，PBS洗两遍
2.用弯曲的针头挑起爬片，镊子夹出置于载玻片上，内源性过氧化物酶阻断剂室温（无色液体）孵育10分钟
3.吸水纸吸去阻断剂后将玻片在摇床上PBS中洗3次，每次5分钟。
（若洗的次数多则细胞脱片程度也有可能加大，摇洗的力度也不宜过高）
4.滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育10分钟，用吸水纸从一侧吸去，勿洗。
5滴加20倍稀释的单抗，800倍稀释的感染血清，于湿盒内37度孵育2小时。
6.吸水纸吸去稀释后的一抗，在摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
7.滴加试剂B（黄色液体）室温孵育10分钟。
8.吸水纸吸去试剂B后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
9.滴加试剂C（橙色液体）室温孵育10分钟。
10.吸水纸吸去试剂C后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
11.显色剂DAB显色。