淀粉酶及其同工酶

各 2 ml，摇匀 ml， min，冷却，各用水定容至 定容至25ml， 沸水浴 5 min，冷却，各用水定容至25ml，摇匀 号管为空白参比，测定λ=540nm处的吸光值 以0号管为空白参比，测定λ=540nm处的吸光值
六. 结果处理
1、分别计算0时刻、5 min时刻的A540nm平均值。 分别计算0时刻、 min时刻的 时刻的A 平均值。 2、根据图表中的实验结果，并利用实验 “3,5-二 根据图表中的实验结果， 3,5硝基水杨酸比色法测定糖的含量” 硝基水杨酸比色法测定糖的含量”中制作的标准 曲线，计算淀粉酶的活力。 曲线，计算淀粉酶的活力。 需要详细过程。 需要详细过程。
（一）生化特性与组织分布
1. 生化特性 α-amylase（AMY或AMS）是一种不均一性的钙 （ 或 ） 依赖金属蛋白酶。 作用的最适pH在 ～ ， 依赖金属蛋白酶 。 AMY作用的最适 在 6.5～ 7.5， 卤素和 作用的最适 其 他 阴 离 子 有 激 活 作 用 （ Cl−>Br−>NO3−>I− ） 。 分 子 量 40 000～50 000，易从肾脏排出。半寿期很短，约为 。 ～ ，易从肾脏排出。半寿期很短，约为2h。 2. 组织分布 α-AMY分为两种同工酶：S-AMY和P-AMY。 分为两种同工酶： 分为两种同工酶 和 。 利用醋酸纤维薄膜电泳或琼脂糖电泳可将S-AMY分为 1、S2、 分为S 利用醋酸纤维薄膜电泳或琼脂糖电泳可将 分为 S3和S4四个亚型；P-AMY分为 1、P2、P3三个亚型。 四个亚型； 分为P 三个亚型。 分为 P-AMY和S-AMY可单独或联合与抗淀粉酶自身抗体以非共价形 和 可单独或联合与抗淀粉酶自身抗体以非共价形 式结合，形成高分子循环复合物，称为巨淀粉酶 的分子量较大， （Macroamylase，M-AMY）。M-AMY的分子量较大，不易 ， ） 的分子量较大 从肾小球滤过，因此容易造成高淀粉酶血症。 从肾小球滤过，因此容易造成高淀粉酶血症。
三. 实验材料及设备
1、材料 淀粉酶液（粗酶液、盐析液、脱盐液） 淀粉酶液（粗酶液、盐析液、脱盐液） 2、仪器 分光光度计 恒温水浴 沸水浴 3、器材
刻度试管： mL× 刻度试管： 25 mL×17 试管 移 液 管： 1 mL×3（取稀释后的酶液） mL× 取稀释后的酶液） mL× 烧 杯： 250 mL×1 滴 管： 2 洗 耳 球： 2 洗瓶、试管架、移液管架、玻棒： 洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1 专取NaOH 移 液 器：专取NaOH 注 射 器：专取蛋白样品
0 时刻
5 min时刻 min时刻
实验编号 0号管 操作 淀粉酶液 (ml) H2O (ml) pH 6.8缓冲液 6.8缓冲液 0.3 ％ NaCl 预热 NaOH (ml) 预热的淀粉 酶促反应 NaOH (ml) DNS试剂 DNS试剂 显色反应 比色 记录A 记录A540 1 3.5
粗酶液 (1)
淀粉酶及其同工酶的检测
2010100230 石学丹
淀粉酶(amylase，AMY,AMS) ， 淀粉酶
• 一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元 等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的 酶。 • 根据作用的方式可分为 • α-淀粉酶与β-淀粉酶
α-淀粉酶
α-淀粉酶
广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、 山萮菜）及微生物。 此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于 直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α－1， 4-链。 其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的 消失，最终产物在分解直链淀粉时以葡萄糖为主， 此外，还有少量麦芽三糖及麦芽糖。另一方面在分 解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖外， 还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精（又称 α-糊精）。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％， 但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度 的（最终游离出葡萄糖）
五. 操作步骤
1、淀粉酶的制备 （1）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的粗 酶提取液解冻，取上清液0.05 mL， 酶提取液解冻，取上清液0.05 mL，加蒸馏水稀释 mL， 到25 mL，摇匀备用 （2）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的盐析 蛋白质解冻，取上清液0.05 mL， 蛋白质解冻，取上清液0.05 mL，加蒸馏水稀释到 25 mL，摇匀备用 mL， 取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻， （3）取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻，取 0.05 mL，稀释。 mL，稀释。 收集1管的同学， mL稀释到 稀释到15 收集1管的同学，将0.05 mL稀释到15 mL 收集2管的同学， mL稀释到 稀释到10 收集2管的同学，将0.05 mL稀释到10 mL
四、试剂的配制
1、淀粉溶液（0.5%） 淀粉溶液（0.5%） 称取5 g可溶性淀粉 溶于1000 mL热水中 可溶性淀粉， 热水中。 称取5 g可溶性淀粉，溶于1000 mL热水中。 2、3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂） 3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂 试剂） 3、磷酸缓冲液（ 0.1 mol/L，pH6.8 ），含0.3% NaCl 磷酸缓冲液（ mol/L， ），含 4、NaOH溶液（2.5mol/L） NaOH溶液 2.5mol/L） 溶液（
A Ex B Ea C Ei P → → →
其中， 、 均为中间产物 均为中间产物， 、 都为工具酶 都为工具酶。 其中，B、C均为中间产物，Ea、Ei都为工具酶。最后一 个酶称指示酶Ei，其他外加的酶都为辅助酶（ ）。 个酶称指示酶 ，其他外加的酶都为辅助酶（Ea）。
2．酶偶联反应原理 ．
本实验是以一定量的α 淀粉酶液， 本实验是以一定量的α-淀粉酶液，于37 ℃ 、 pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间内将淀粉 pH6 的条件下，在一定的初始作用时间 初始作用时间内将淀粉 转化为还原糖，然后通过与DNS 试剂作用 试剂作用， 转化为还原糖 ， 然后通过与 DNS试剂作用， 比色 测定求得还原糖的生成量， 测定求得还原糖的生成量 ， 从而计算出酶反应的 初速度， 初速度，即酶的活力 这里规定，一个淀粉酶活力单位为在37 这里规定，一个淀粉酶活力单位为在37 ℃ 、 pH6 .8 的条件下 ， 每分钟 水解淀粉生成 1 mg 还原 pH6 的条件下，每分钟水解淀粉生成 mg还原 水解淀粉生成1 所需要的酶量 酶量。 糖所需要的酶量。 1 U=1 mg 还原糖/min·mL 酶 U=1 还原糖/min·mL
淀粉酶活力的测定 淀粉酶活力的测定 化学法
二、实验原理
• 酶是一种具有高度专一性的催化剂。其催化能 酶是一种具有高度专一性的催化剂。 力的大小用酶的活力来表示。 酶的活力来表示 力的大小用酶的活力来表示。酶活力也称酶活 是以酶在最适温度 最适pH等条件下 最适温度、 等条件下， 性，是以酶在最适温度、最适pH等条件下，催 化一定的化学反应的初速度来表示。 初速度来表示 化一定的化学反应的初速度来表示。
试管排列顺序
室温
粗酶液
1 空白
装约20 mL淀粉溶液 装约20 mL淀粉溶液， 淀粉溶液， 标记，转至37℃ 标记，转至37℃水浴 锅中
37 ℃
淀粉
盐 析 脱 盐
2
B1
B2
B3
F1
F2
F3
3
B1′
B2′
B3′
F1′
F2′
F3′
因淀粉中含有少量还原糖， 因淀粉中含有少量还原糖， 某些溶液有色素、杂质，需 某些溶液有色素、杂质， 查看酶不水解淀粉的情况
5 min时刻吸光值 min时刻吸光值 0 min时刻吸光值 min时刻吸光值 5 min时刻还原糖mg数 min时刻还原糖 数 时刻还原糖mg 0 min时刻还原糖mg数 min时刻还原糖 数 时刻还原糖mg
还原糖/min· 二者相减，计算酶活力。 二者相减，计算酶活力。 1 U=1 mg 还原糖/min·mL 酶*稀释倍数
盐析液 (2)
脱盐液 (3)
0时刻 5min时刻 0时刻 5min时刻 0时刻 5min时刻 5min时刻 5min时刻 5min时刻 B1 B1’ F1 F1’ B2 B2’ F2 F2’ B3 B3’ F3 F3’ B1’ F1’ B2’ F2’ B3’ F3’ 0.3 0.2 各 1 ml 各 1 ml 摇匀， 摇匀， 37 ℃ 水浴 2 min 1 1 1 1 1 各 1 ml，迅速摇匀 ml， 37 ℃ 水浴 5 min (准确计时) (准确计时 准确计时) 1 1 1 1 1 1 0.5
β-淀粉酶
与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次 以麦芽糖为单位切断α－1，4-葡聚糖链。 主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大 豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存 在。对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完 全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支 链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α－1，6-键的 前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的 极限糊精。
（1） 当用酶偶联法测定时，在偶联反应中存在 ） 当用酶偶联法测定时， 几个时期：预孵育期、延滞期、恒态期、 几个时期：预孵育期、延滞期、恒态期、非恒 态期。 态期。 （2）延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个 ） 重要区别。从酶反应开始至稳态期间， 重要区别。从酶反应开始至稳态期间，指示酶 反应较慢且不稳定，称为延滞期。 反应较慢且不稳定，称为延滞期。在这期间指 示酶反应速度不能代表测定酶量多少。 示酶反应速度不能代表测定酶量多少。 （3）设计和选择酶偶联测定方法时，延滞期越 ）设计和选择酶偶联测定方法时， 短越好，测定时间要避开此期。 短越好，测定时间要避开此期。
淀粉酶活力的测定 淀粉酶活力的测定 酶偶联测定法
Hale Waihona Puke Baidu
（二）酶偶联测定法
1. 酶偶联反应
（1）最简单的模式为： ）最简单的模式为： Ex 为待测酶，A为底物，B为中间产物。 A、B二物质的 为待测酶， 为底物 为底物， 为中间产物 为中间产物。 、 二物质的 变化无法直接监测，此时可外加第二个酶Ei（ 变化无法直接监测，此时可外加第二个酶 （为指示 ），其底物为 其底物为B，反应产物为P可直接测定 可直接测定。 酶），其底物为 ，反应产物为 可直接测定。 （2）如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶 ） 联 ， 此时还可在始发反应和指示反应之间加入另一种 将二者连在一起，此反应称为辅助反应。模式为： 酶 ， 将二者连在一起 ， 此反应称为辅助反应 。 模式为 ：
（二）测定方法与临床意义
1. 测定方法 AMY总活性测定：化学法、酶偶联法 总活性测定： 总活性测定 化学法、 同工酶测定：琼脂糖电泳法、免疫抑制法。 同工酶测定：琼脂糖电泳法、免疫抑制法。 2. 临床意义 （1）AMY活性增高 ） 活性增高 发病后3h～ 开始升高， ①急性胰腺炎 发病后 ～6h 开始升高，12h～24h达峰 ～ 达峰 2天 5天下降恢复至正常 超过500U有意义 天下降恢复至正常。 有意义。 值，2天～5天下降恢复至正常。超过500U有意义。 慢性胰腺炎急性发作、胰腺癌等AMY升高。 升高。 ②慢性胰腺炎急性发作、胰腺癌等 升高 急腹症如急性阑尾炎、肠梗阻、溃疡现穿孔等， ③急腹症如急性阑尾炎、肠梗阻、溃疡现穿孔等，血清 AMY可升高。这些病变可波及胰腺，较急性胰腺炎为低。 可升高。 可升高 这些病变可波及胰腺，较急性胰腺炎为低。 （2）AMY活性降低 主要见于肝炎、肝硬化等。 ） 活性降低 主要见于肝炎、肝硬化等。 （3）AMY同工酶增高 ） 同工酶增高 急性胰腺炎和慢性胰腺炎急性发作P型增高 型增高； ①急性胰腺炎和慢性胰腺炎急性发作 型增高； 腮腺炎、肺癌、卵巢癌等S型增高 型增高。 ②腮腺炎、肺癌、卵巢癌等 型增高。
3．对酶偶联反应的要求 ．
（1）指示酶反应必须是一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓 ）指示酶反应必须是一级反应， 度相关。工具酶催化的最大反应速度必须远远大于测定酶， 度相关。工具酶催化的最大反应速度必须远远大于测定酶， 其所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行， 其所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行，并 且将此很快转变为最终产物， 且将此很快转变为最终产物，反应体系中不应有中间产物堆 否则导致误差。 积，否则导致误差。 （2）工具酶 作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为 ） 工具酶。 工具酶。 最常用的偶联指示系统有两类： 最常用的偶联指示系统有两类： 一类是氧化酶系统，利用氧化酶产生过氧化氢（ 一类是氧化酶系统 ，利用氧化酶产生过氧化氢（H2O2）， 再加 上氧化发色剂进行比色，如常用的Trinder反应。 反应。 上氧化发色剂进行比色，如常用的 反应 另一类是脱氢酶系统，利用氧化-还原酶反应使其连接到 NAD(P)-NAD(P)H的正 逆反应后 ， 通过分光光度法或其他方 的正/逆反应后 的正 逆反应后， 法直接测定NAD(P)H的变化量。 的变化量。 法直接测定 的变化量 （3）酶循环法（enzymatic cycling methods） ）酶循环法（ ） 固相酶（ 固相酶（immmobilized enzymes） ）