引物探针设计原则
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引物探针设计原则
张庆
Field Application Scientist Molecular & Cellular Biology
引物设计原则
• 选择合适的靶序列
– 根据需要选择保守、特异、碱基分布均匀的区域 – 荧光PCR扩增产物不宜过长： <150bp
• • • •
引物长度： 15～30bp Tm值：一般在55～60℃，上下游尽可能一致 G+C含量：一般为40～60％ 4种碱基的随机分布
– 不存在聚嘌呤和聚嘧啶 – 3’端不应超过3个连续的G或C
引物设计原则
• 引物的特异性：
– 与非特异序列的同源性<70％，连续互补碱基<8个；
• • • •
引物之间不应有互补序列，尤其避免3’端的互补； 引物互补区域尽量避开扩增片断的二级结构； 引物的3’端不进行修饰； 密码子兼并：扩增编码区域，引物的3’端不终止于 密码子的第三位，因为密码子的第三位易发生兼并。
探针设计技巧
• 基因表达：探针设计跨过两个外显子
R
TaqMan探针
Q 3'
Exon 1
Exon 2
Exon 3
设计完的序列必须比对验证
Always BLAST the primers and probes !
标记探针的荧光分子的选择
荧光染料 FAM JOE VIC TAMRA NED CY-3 ROX Texas Red CY-5
Biblioteka Baidu
最大发射波长(nm) ~520 ~550 ~550 ~580 ~580 ~580 ~610 ~610 ~670
用途 报告荧光 报告荧光 报告荧光 淬灭荧光 报告荧光 报告荧光(7500) 参比荧光 报告荧光(7500) 报告荧光(7500)
Primer Express v3.0软件
欢
PCR
户 训
Taqman探针设计原则
• • • • • • • •
探针与扩增产物间有完全互补的序列； 序列不易形成二级结构； Tm值高于引物（10℃）； 探针的5’ 端第一个碱基不能是鸟嘌呤（G）； 避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G； 检测SNP或突变时，区分位点尽量位于探针中央； 探针5’端尽可能地接近引物3’端； ……
SNP或基因突变位点在MGB探针中的位置
polymorphism
DO NOT PLACE HERE
NN N N N N N N N N N N N N N N N N N
Try to position the polymorphism here (central third)
If necessary, put the polymorphism here (region of MGB)
张庆
Field Application Scientist Molecular & Cellular Biology
引物设计原则
• 选择合适的靶序列
– 根据需要选择保守、特异、碱基分布均匀的区域 – 荧光PCR扩增产物不宜过长： <150bp
• • • •
引物长度： 15～30bp Tm值：一般在55～60℃，上下游尽可能一致 G+C含量：一般为40～60％ 4种碱基的随机分布
– 不存在聚嘌呤和聚嘧啶 – 3’端不应超过3个连续的G或C
引物设计原则
• 引物的特异性：
– 与非特异序列的同源性<70％，连续互补碱基<8个；
• • • •
引物之间不应有互补序列，尤其避免3’端的互补； 引物互补区域尽量避开扩增片断的二级结构； 引物的3’端不进行修饰； 密码子兼并：扩增编码区域，引物的3’端不终止于 密码子的第三位，因为密码子的第三位易发生兼并。
探针设计技巧
• 基因表达：探针设计跨过两个外显子
R
TaqMan探针
Q 3'
Exon 1
Exon 2
Exon 3
设计完的序列必须比对验证
Always BLAST the primers and probes !
标记探针的荧光分子的选择
荧光染料 FAM JOE VIC TAMRA NED CY-3 ROX Texas Red CY-5
Biblioteka Baidu
最大发射波长(nm) ~520 ~550 ~550 ~580 ~580 ~580 ~610 ~610 ~670
用途 报告荧光 报告荧光 报告荧光 淬灭荧光 报告荧光 报告荧光(7500) 参比荧光 报告荧光(7500) 报告荧光(7500)
Primer Express v3.0软件
欢
PCR
户 训
Taqman探针设计原则
• • • • • • • •
探针与扩增产物间有完全互补的序列； 序列不易形成二级结构； Tm值高于引物（10℃）； 探针的5’ 端第一个碱基不能是鸟嘌呤（G）； 避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G； 检测SNP或突变时，区分位点尽量位于探针中央； 探针5’端尽可能地接近引物3’端； ……
SNP或基因突变位点在MGB探针中的位置
polymorphism
DO NOT PLACE HERE
NN N N N N N N N N N N N N N N N N N
Try to position the polymorphism here (central third)
If necessary, put the polymorphism here (region of MGB)