焦磷酸测序常见问题及解决方案
焦磷酸测序反应
(Cat. No 970922 for CpG and long sequencing runs)
E-Mix (Enzyme Mix, lyophilized) S-Mix (Substrate Mix, lyophilized) dATPαS (1200µl) dGTP, dCTP, dTTP (660µl, 1 vial each) PyroMark Q24 Advanced Annealing Buffer* PyroMark Q24 Binding Buffer**
室温1400RPM振 摇5~10min
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
样品准备及上机运行
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
程序设计——Assay
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
设计dNTP分配顺序： 点击工具栏 New Assay图标；文件夹右 键>New Assay；File> New Assay; AQ Assay: 等位基因 SNP Assay:核苷酸多态性 CpG Assay：甲基化 SEQ Assay：未知序列测序
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
程序设计——Assay
引物设计
PCR
程序设计
AQ/SNP Assay设计：
Sequence to Analyze; Generate Dispensation Order; Dispensation Order
SEQ Assay 设计：
直接在Dispensation Order 输入
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文
焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）不仅极大地提高了人类对基因组和相关遗传信息的认识水平，而且促进了生命科学研究技术的发展和应用。
正是在这样的历史背景下，焦磷酸光化测序技术（pyrosequencing）由瑞典研究人员发明。
焦磷酸光化测序技术的基础原理是基于通过合成测序原理进行酶促反应的DNA测序方法，通过基于释放焦磷酸盐时的链式反应的可见光检测，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。
该技术可应用于DNA核苷酸序列和突变的检测、单核苷酸多态性的基因型的鉴定，以及DNA甲基化水平变化的分析等。
近年来，随着摄影器材和成像技术的快速发展，这项技术的原理是基于通过酶促反应而实时检测可见光，因此，有望在检测的敏感性方面得到更进一步的发展。
该文根据笔者在瑞典近三十年的工作经验和积累的文献，首先阐明焦磷酸光化测序的基本原理，然后介绍该技术的应用，最后讨论其发展前景。
关键词：人类基因组计划; 焦磷酸光化测序; 基因变异; 基因型; DNA甲基化;Abstract：The Human Genome Project（HGP）not only greatly improved the understanding of human genome and related genetic information, but also promoted the development of technologies in life science research. It was under this historical context that pyrosequencing was invented by Swedish researchers. Pyrosequencing is a method of DNA sequencing based on the sequencing by synthesis principle with enzymatic reactions, and relies on light detection based upon a chain reaction when pyrophosphate is released. The application of this technology involved the detection of DNA nucleotide sequences and mutations, the identification of genotypes of single nucleotide polymorphisms, the analysis of changes in DNA methylation levels etc. With the recent rapid development of photographic equipment and imaging technology, this technology is expected to have an increasing sensitivity in signal detection. Based upon the working experiences in Sweden for nearly 30 years and accumulated literature, this review first clarified the basic principles of pyrosequencing, then introduced the applications of this technology, and finally discussed its development prospects in the near future.Keyword：Human Genome Project; pyrosequencing; genetic variation; genotype; DNA methylation;1 、引言本世纪是生命科学的世纪。
焦磷酸测序
2、复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物 通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
3、延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的 四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合 酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新 的DNA链。
4、 循环特点：
① 上一链的只两 条（无引物存于两个子代DNA分 子中 ） ，其它子代DNA分子都为 双引物分子 ③ 处于两引物之间的DNA序列呈 指数增长1×2N
• 在80-100℃的温度范围内，DNA的 双螺旋结构将解体，双链分开，这个 过程称为变性；当温度缓慢降低后， 两条彼此分离的DNA链又会重新结合 成双链，这个过程称为复性。
三、复制方向（5’~3’）
1、DNA分子的3’端与5’端：-OH端 为3’; 磷酸基团的末端为5’ 。 2、DNA分子由两条反向平行的脱氧核 苷酸链根据碱基互补配对原则形成氢键 连接而成。
焦磷酸测序
峰形图
➢ 峰高与结合模板的dNTP数量成正比 ➢ 原始数据会被软件自动转化为序列信息
✓ 高温变性 ✓ 低温退火 ✓ 适温延伸
具有特异性强、灵敏度高、操 作简便、省时等特点
一、PCR反应的条件
1、一定的缓冲溶液； 2、DNA模板； 3、分别与两条模板链相结合的两种引物； 4、四种脱氧核苷酸：4种dNTP混合物； 5、耐热的DNA聚合酶； 6、控制温度（PCR重要条件）。
二、DNA变性和复性
基因测序
➢ 对DNA分子的核苷酸排列顺序的测 定，也就是测定组成DNA分子的A、 T、G、C的排列顺序。
A-T-T-C-A-C-G-G-T-AC
焦磷酸测序步骤
一 PCR 二 焦磷酸测序
PCR
➢ 聚合酶链式反应 ➢ 亦称之为DNA扩增，是 DNA复制的体外模拟
焦磷酸测序法的原理
焦磷酸测序法的原理
聚焦磷酸测序（Focused phosphor sequencing，FPS）是由分子物理学和计算机科学
联合发明出来的新一代DNA测序技术，它改变了传统测序技术在DNA测序中的传统方法，
可以准确、高效地检测基因组中特定基因的位置。
聚焦磷酸测序原理是借助电子可视显像仪将特定基因座度量为磷酸，并将这些映射的
磷酸聚集到激光光源上，形成数组。
激光以极快的扫描速度在数组上寻找特定的点。
激光
在这些点上发出的能量将磷酸中的DNT链分离，从而使被测序的DNA序列显示出来。
然后，当激光扫描多次后，分子团就会发光，并将发出的能量转换成信号，从而实现DNA序列的
测定。
聚焦磷酸测序的原理是将各个核苷酸的构型用磷酸分子表示出来，使用磷酸捕获和激
发原子，以及用激光源收集磷酸放出的能量及其他光子，利用可视显像仪的传感器和电子
计算机组合系统，进行图像处理和信号处理，最后将得到的数据转化为序列数据。
聚焦磷酸测序是一种基于微电子显像和激光扫描相结合的DNA序列测定技术，相比传
统的测序方法，具有更高的精度和可靠性，准确性高，定位精度高，可以检测基因组中特
定基因的位置，从而使DNA测序技术得到全面的发展，为研究基因组和全基因组提供更多
有用的信息。
焦磷酸测序法原理
焦磷酸测序法原理
焦磷酸测序法原理是一种用于DNA序列测定的方法，也被称为焦磷酸法。
该方法是一种常用的测序技术，具有高效、高精度和高通量的特点，被广泛应用于基因组学研究、疾病诊断和药物研发等领域。
焦磷酸测序法的原理是利用DNA聚合酶在DNA合成过程中选择性地将2',3'-二氟脱氧核苷酸三磷酸酯（ddNTPs）引入合成链中，从而使合成过程中断，形成一系列不同长度的DNA片段。
这些DNA片段经过电泳分离后，根据片段长度的顺序可以确定DNA的序列。
在焦磷酸测序法中，DNA样本首先通过PCR扩增得到模板DNA，然后将DNA模板与引物、DNA聚合酶和四种dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸酯）一起放入PCR反应管中进行DNA合成。
在DNA合成的过程中，添加的每一种ddNTPs
（2',3'-二氟脱氧核苷酸三磷酸酯）会随机地终止DNA链的延伸，从而在不同的位置引入标记。
最后，通过电泳分离不同长度的DNA片段，根据不同的标记位置确定DNA的序列。
焦磷酸测序法的原理基于DNA合成的特性和ddNTPs的选择性终止作用，通过测定DNA片段的长度和标记位置来确定DNA的序列。
这种测序方法的优势在于高通量、高灵敏度和高准确性，能够快速、准确地测定DNA的序列，为基因组学研究和生物医学领域的研究提供了重要的技术支持。
焦磷酸测序法的原理和方法的不断改进和发展，使其在DNA测序领域中具有重要的应用前景。
[详解]焦磷酸测序的道理及引物设计
![[详解]焦磷酸测序的道理及引物设计](https://img.taocdn.com/s3/m/e6cf8656bf1e650e52ea551810a6f524ccbfcbb5.png)
Pyrosequencing RCR1.实验原理：焦磷酸测序采用生物素标记的引物进行PCR扩增，将PCR产物纯化并变性为单链后，向其中加入四种酶的混合物：DNA聚合酶（合成DNA 双链，释放dNTP的焦磷酸基团，释放出来的焦磷酸基团的量与和模板结合的dNTP的量成正比）、A TP硫酸化酶（在adenosine 5´ phosphosulfate存在的情况下催化焦磷酸基团形成A TP）、荧光素酶（在A TP介导下使荧光素转化为氧化荧光素，氧化荧光素能释放与A TP量成正比的可见光信号）及三磷酸腺苷双磷酸酶（降解未参入新链的dNTP及ATP，猝灭荧光）。
在测序过程中，每次加入一种类型的dNTP，若该dNTP能与模板链互补配对，则在四种酶的作用下发生一系列的反应，最终将荧光信号转换成电信号体现出来，显示为一个个高度不一的峰，峰的高度与碱基的个数成正比。
反之，当dNTP不能与模板链结合时，将直接被三磷酸腺苷双磷酸酶降解，相应的将不会显示峰值。
如下图所示：2.引物设计焦磷酸测序的模板也是经亚硫酸盐修饰后扩增，故其引物设计原则与BSP引物设计基本一致：1）引物长度在18~24碱基；2）避免引物间互补或自身形成发卡结构3）引物中G/C – A/T的分配比例相当，使Tm在62-65°C之间其主要区别在于：1）Pyrosequencing的一条引物的5' 端需使用生物素标记，以和磁珠或琼脂糖beads结合，另一条引物不要标记2）由于游离的生物素将会和生物素标记的PCR产物竞争结合联霉亲和素（beads）而降低信号水平，须使用HPLC纯化生物素标记的引物。
3）要确保PCR产物目标量大，且没有非特异性条带，也没有引物二聚体。
PCR完成后使用电泳鉴定PCR产物。
4）PCR循环数须足够，以保证完全消耗掉引物。
Pyrosequencing 的引物设计可以直接使用PyroMark Assay Design 2.0软件进行设计。
焦磷酸测序原理
焦磷酸测序原理焦磷酸测序是一种常用的测序技术，通过测序仪器对DNA序列进行快速而准确的测定。
它是一种基于合成DNA链延伸的原理，可以在短时间内测定DNA序列。
焦磷酸测序的原理是利用DNA合成过程中的焦磷酸（dideoxynucleotide）来终止链延伸的反应。
焦磷酸是一种具有缺少3'-羟基的核苷酸，它会被DNA多聚酶插入到正在合成的DNA链中，但一旦焦磷酸被插入，DNA链延伸就会停止。
这样，每次加入一个不同的焦磷酸，就可以得到具有不同长度的DNA片段。
焦磷酸测序的步骤如下：1. DNA模板制备：首先，需要从待测DNA样本中提取出目标DNA片段。
这可以通过PCR（聚合酶链反应）或其他方法来进行。
然后，将目标DNA片段加入到一个含有多聚酶和引物的反应混合物中。
2. DNA合成：在反应混合物中，加入四种不同的焦磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），以及四种普通的核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）。
这样，当DNA链延伸到某个位置时，如果接下来要插入的是焦磷酸，链延伸就会终止。
3. 前序列扩增：在DNA合成过程中，每次加入的焦磷酸是不同的，因此会得到不同长度的DNA片段。
然后，将反应混合物分离成不同长度的DNA片段。
4. DNA片段分离：将反应混合物中的DNA片段进行电泳分离，根据片段大小的不同，可以得到一个DNA片段长度的分布图。
5. 数据分析：通过测序仪器对DNA片段进行测定，得到每个片段的长度信息。
根据这些信息，可以推导出DNA序列。
焦磷酸测序的优点是速度快、准确性高、适用于多种类型的样品。
它被广泛应用于基因组学、遗传学、生物医学研究等领域。
然而，焦磷酸测序也存在一些限制，例如不能测定长片段的DNA，且在测序过程中容易产生误差。
焦磷酸测序是一种基于合成DNA链延伸的原理，通过插入焦磷酸来终止链延伸的反应，从而快速而准确地测定DNA序列。
它在基因组学和生物医学研究中具有重要的应用价值，为我们深入了解DNA序列提供了有效的工具。
焦磷酸测序名词解释
焦磷酸测序名词解释焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的原理是通过对 DNA 序列进行扩增，并对扩增产物进行测序，最终得到 DNA 序列信息。
焦磷酸测序主要应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域，可以用于基因表达谱分析、基因突变检测、基因调控机制研究等。
相比其他基因测序技术，焦磷酸测序具有很多优势，如测序成本低、速度快、精度高等。
但是，焦磷酸测序也存在一些缺陷，如测序长度有限、难以测序复杂基因结构等。
尽管焦磷酸测序技术已经发展了多年，但它仍在不断演进和改进。
未来，焦磷酸测序技术将继续发展，并在更多领域得到应用。
1. 什么是焦磷酸测序焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
具体来说，焦磷酸测序技术利用了聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的特性，可以通过检测 ATP 合成过程中的光谱变化来确定 DNA 序列。
焦磷酸测序技术最初由来自瑞典斯德哥尔摩大学的科学家们开发，并于 1998 年由瑞典Pyrosequencing AB 公司商业化。
自此，焦磷酸测序技术就成为了一种广泛应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域的技术手段。
2. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
焦磷酸测序的工作流程如下：1. 先将 DNA 样本进行扩增，得到扩增产物。
2. 然后将扩增产物与一种叫做反转录酶的蛋白质混合，使其能够将 DNA 序列转录成RNA 序列。
3. 将转录后的 RNA 序列与一种叫做聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的蛋白质混合，使其能够将 RNA 序列通过合成 ATP 来反应出 DNA 序列信息。
总结了测序中经常遇到的问题及原因分析,希望对大家有帮助!
总结了测序中经常遇到的问题及原因分析，希望对大家有帮助！Q:测序结果中为什么找不到引物序列?A:找不到用来测序的引物，这是正常的，因为测序的方法是荧光标记测序法，仪器通过检测 ddNTP 上的荧光来读取所测序列，而引物本身是不被标记的，所以仪器无法检测到；找不到所测片段的扩增引物，这种情况是因为您所采用的酶切位点离所用的测序引物距离太近，一般荧光燃料会干扰几十个碱基的读取，这部分碱基会损失掉，损失掉的序列很可能就包含引物的序列，所以引物的序列无法找到；测出的引物序列是原引物序列的反向互补序列，这是因为 TA 克隆的插入没有方向性，如果插入片段是相反的，这时就要反向互补查找引物；测出的结果为空载体，这是因为由于某种原因导致质粒上没有插入外源片段，这时所测的为载体序列，所以就找不到引物了；存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。
Q:为什么测序结果中引物的序列有个别碱基不同了?A: 这是因为引物区同样存在错配的可能，出现这种可能性有两种: 合成错误和引物区有错配我们可以挑选同批次 2个以上的克隆进行测序验证，如果结果完全相同，应该是合成错误；如果在引物的相同位置错误的碱基不一样那就应该是引物区有错配。
Q:哪些引物不适合作为测序引物?A:①兼并引物：简并引物要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果；②随机引物：如 RAPD 引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好地与模板结合；③过长的引物：一般要求测序引物不大于 24bp，过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上有多个结合位点，导致测序结果背景增高。
另外，较长的引物纯度也将难以保证。
通常用于测序的引物纯度要在 90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果；④有特殊标记的引物：该情况主要指荧光标记的引物。
我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，荧光标记的引物将产生干扰。
焦磷酸测序专题知识讲座专家讲座
Instrumentation
第6页
Pyrosequencing 系统平台
PyroMarkTM ID
Complete solution for Clinical Microbiology
Assay Design SW Sample Prep
Pyrosequencing
IdentiFireTM SW
Triple Double Single
T GG CC GGG T C A C G A GG CCC TA ...
1分子dNTP掺入，释放出1分子PPi，生成1分子ATP ，产生单位强度光信号
焦磷酸测序专题知识讲座
第29页
Pyrosequencing： Quantitative Accuracy Test
焦磷酸测序专题知识讲座
第33页
Pyrosequencing焦磷酸测 序系统卓越表现：
99.998% accurate
(based on analysis of 100,000 wells
with known genotype)
焦磷酸测序专题知识讲座
第34页
Integrated Software Package
C
T AG T A GA G
T/T
E
S
G
C
Байду номын сангаас
T AG T A GA G
C/T
Since Pyrosequencing shows polymorphisms
with sequence context, you can
always trust the validity of the
data.
E
S
G
甲基化检测之金标准焦磷酸测序技术
甲基化检测之⾦标准焦磷酸测序技术中科普瑞作为中国⼗万⼈甲基化组计划的执⾏⽅，对甲基化检测的相关技术进⾏了优化升级，建⽴了专业的甲基化检测⼀站式服务平台。
今天⼩编为⼤家介绍甲基化检测的⾦标准—焦磷酸测序技术，后⾯陆续介绍其他甲基化检测技术，敬请期待哦！焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）作为⼀种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进⾏定性及定量检测，已成为甲基化检测的⾦标准。
焦磷酸测序技术原理焦磷酸测序技术是由4种酶（DNA 聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶）催化的同⼀反应体系中的酶级联化学发光反应。
具体过程如下：步骤1：扩增DNA⽚段并对焦磷酸模板链进⾏⽣物素化。
通过变性，分离⽣物素化的单链PCR 扩增⼦并使其与⼀条测序引物进⾏杂交。
步骤2：将杂交引物和单链模板与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶，以及底物腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）和荧光素共孵育。
步骤3：第⼀个脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）被引⼊反应。
DNA聚合酶催化dNTP，使其在互补模板链的情况下对测序引物进⾏延伸。
每个核苷酸的添加都对应着等摩尔数焦磷酸（PPi）的释放。
步骤4：ATP硫酸化酶在腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）存在的情况下将PPi转化为ATP。
⽣成的ATP为荧光素酶介导的荧光素氧化反应提供能量，并⽣成与ATP的数量成⽐例的可见光。
电荷耦合器（CCD）摄像头检测到荧光素酶催化反应所⽣成的光，并将其作为原始输出数据中的⼀个峰值（热解图Pyrogram）。
每个峰值（光信号）的⾼度与核苷酸结合的数⽬呈⽐例关系。
步骤5：腺苷三磷酸双磷酸酶是核苷酸的降解酶，持续地对未结合的核苷酸和ATP进⾏分解。
当分解完成时，便会引⼊另⼀个核苷酸。
步骤6：dNTP的添加反应在持续进⾏着。
应注意脱氧腺苷三磷酸α-硫代三磷酸（dATPαS）能够作者为天然脱氧腺苷三磷酸（dATP）的替代物，被DNA聚合酶有效利⽤，却并不会被荧光素酶所识别。
焦磷酸测序仪常见问题及解答
2875 - What is the reason for signals ceasing in the middle of a pyrosequencing run?The cartridge needle can be blocked or damaged causing a dispensation error. Clean the cartridge following the guidelines or repeat the run with a new cartridge. On the other hand if high amounts of template have been used resulting in very high signals (>100 RLU), the substrate for the sequencing reaction might be depleted. In this case template conditions should be optimized.2879 - What is the reason for a high substrate peak in the pyrosequencing pyrogram?Usually pyrophosphate or dATP/ATP contamination in the sample or in the buffer can cause a high substrate peak. Large amounts of pyrophosphate are generated in the PCR reaction and might be carried over to the sequencing reaction. Check the PyroMark buffers and reagents and use new ones.2871 - How many nucleotides of a homopolymer can be resolved in pyrosequencing?In the range of 3-5 bases can be resolved depending on the sequence context and base. If it is possible sequencing of a homopolymer of more than 3-5 nucleotides should be avoided by resetting the sequencing primer.2870 - What does it mean when I get a "wide peak" error appearing at the end of a pyrosequencing run?Usually wide peaks result from too much template for the used enzyme/substrate activity, or from reduced activity/performance of the enzymes themselves so that the pyrophosphate from previous nucleotide incorporation cannot be degraded as fast as usual. 2881 - What is the reason for split peaks appearing in between dispensations on my pyrosequencing pyrogram?The PyroMark cartridge needle can be blocked or damaged. Clean the cartridge or exchange with a new one. Check for correct reagent cartridge and cartridge method used in the run. Check if the reagent cartridge cover was closed properly. Make sure that the cartridge was dry after cleaning because nucleotide droplets might be caught at the needle tip and fall down at any time. or exchanged.2878 - How do I prevent a drifting baseline in my pyrosequencing pyrogram?Let the PyroMark instrument warm up (about 60 minutes) to adapt to room temperature before use. Make sure the ambient room temperature is within range 18-28°C.2877 - How do I reduce background peaks in the pyrosequencing pyrogram?There are several reasons for a high assay background; the template can form secondary structures which are extended or the primers itself form dimmers which serve as template. Perform accurate sequencing controls (e.g. PCR or sequencing primer only) as recommended in the PyroMark User Manual to observe this kind of background. In addition, an unspecific priming of primer to template or unspecific annealing of sequencing primer to template might also be a background cause. Please check your complete primer design and if needed, perform a redesign. Try to lower the primer concentration as possible to avoid excess of primer. 2876 - What is the reason for low peak signals in pyrosequencing?The main cause is a too low PCR template concentration. Check the PCR product on an agarose gel and eventuallyadapt/increase the amount of PCR template. Check the PCR sample preparation with the PyroMark Vacuum workstation in order to figure out if template gets lost throughout the procedure (e.g. blocked filter probes). Moreover, check that all buffers were diluted correctly and used the correct order.2826 What concentration should be used for the sequencing primer in pyrosequencing?Usually the sequencing primer is used at 0.3µM in annealing buffer but some assays might require additional optimization of the sequencing primer concentration.For PyroMark Q24 and PyroMark Q96 MD the final concentration of the sequencing primer is 0.3µM and for PyroMark Q96ID 0.4µM.。
焦磷酸测序
焦磷酸测序:DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。
在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。
Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。
在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。
新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。
Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。
PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。
Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。
反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。
反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。
焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术
焦磷酸测序(Pyrosequencing) 技术焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA 片段也无须荧光标记，操作极为简便。
Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应（参见Pyrosequecing的原理），在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。
PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。
每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。
瑞典Pyrosequencing AB公司基于Pyrosequencing技术而研究开发的PSQ 96系统是一个理想的遗传分析技术平台，它既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的SNP检测及等位基因频率测定。
我公司是国内最早引进PSQ 96 MA 技术平台的公司之一，它具有以下优点：1.不需要制胶，不需要毛细管，也不需要荧光染料和同位素。
2.10分钟内可分析96个样品的SNP，可满足高通量分析的要求。
3.每个样品孔都可进行独立的测序或SNP分析，实验设计灵活。
4.序列分析简单，结果准确可靠。
Pyrosequencing技术的原理Pyrosequencing是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。
其基本原理如下：第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)。
第2步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。
焦磷酸测序技术
焦磷酸测序技术一、简介焦磷酸（Fluorophosphate）序列测序技术是一种以焦磷酸为序列标记物的DNA测序技术，采用的是大肠杆菌焦磷酸脱氧核酸病毒（T7 DNA polymerase）以及催化的酶促反应。
它是通过双向DNA测序的方法来检测DNA序列，它能够精确地检测每个底片包含的每一个核苷酸的序列，焦磷酸序列测序技术与其他常用的序列测序技术相比，具有可靠性高、分辨率高、序列片段速度快、数据准确性高等优点，因此被广泛应用于生物学、分子生物学和基因组学研究中。
二、原理焦磷酸序列测序技术是一种以单碱基计数（single-base counting）为基础的DNA测序技术，它是一种双向测序（bidirectional sequencing）技术。
焦磷酸测序技术的运行原理是：采用大肠杆菌焦磷酸脱氧核酸病毒（T7 DNA Polymerase），也称为DNA Polymerase I，它是一种酶激活的反应，通过无序采样来合成DNA片段，然后将被标记的焦磷酸（Fluorophosphate）注入DNA测序系统中，当它们反应时，它会对这些片段各个位置的核苷酸（nucleotides）进行标记，通过荧光检测器检测荧光结果，从而得到DNA序列。
三、应用1、病毒分类：焦磷酸序列测序技术可用于病毒的分类和鉴定，根据病毒DNA的焦磷酸序列来确定该病毒的属、种、亚种和株类。
2、研究特定基因：焦磷酸序列测序技术可以用于特定基因的研究，如基因组学研究、表达调控分析等，旨在了解基因的功能。
3、检测突变：焦磷酸序列测序技术也可以用于检测突变，可以检测多态性和突变，这些信息可以用于药理学研究、疾病诊断和基因治疗。
4、检测病毒：焦磷酸序列测序技术可以用于检测病毒，如HIV病毒，可以用来研究病毒的进化变异，从而更好地控制和预防病毒所引发的疾病。
测序常见问题及其分析
测序常见问题及其分析[复制链接]查看:593回复:21#字体大小: t T发表于 2009-05-04 16:29 |只看楼主1、PCR 产物测序时出现重叠峰问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）图1-1图1-2解决方法：将PCR 产物克隆到质粒（如T 载体）中挑单克隆测序，或将PCR 产物进行PAGE 纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。
问题图2（PCR 产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）图2解决方法：主要原因是PCR 产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR 产物进行PAGE 纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。
问题图3（测序引物有碱基缺失）测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1 有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。
解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE 纯化2、克隆测序时出现峰形重叠原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。
3、样品有杂合/突变位点模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。
如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重叠峰(如图中箭頭所示)。
解决方法：建议将DNA 片段克隆到载体再测序。
4、polyA/T 和C/G cluster 导致的套峰和测序信号衰减图4-1图4-3图4-4RACE 测序时经常遇到图4-1 和图4-4 的情形，解决方法：从另一端测序；但如果这样的序列出现在中间，呵呵，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。
焦磷酸测序
Pyrosequencing是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的分析的技术。
第一步——测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交，与酶—DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）、荧光素酶（luciferase）、三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）—和底物—adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、荧光素（luciferin）孵育。
第二步——四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。
注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATPS不是荧光素酶的底物。
第三步——ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素（oxyluciferin）的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。
ATP sulfurylasePPi+APS —————————> ATPLuciferase，ATPLuciferin —————————> oxyluciferin光信号由CCD摄像机检测并由软件pyrogram™反应为峰。
每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
第四步——ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。
第五步——然后加入下一种dNTP。
在以上步骤循环进行中，互补DNA链合成，序列从pyrogram™的信号峰中决定。
利用PSQ96系统进行测序分析可期望得到20-30个碱基的读序长度，但是和任何测序技术一样，最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。
e7-3焦磷酸测序与深度测序
e7-3 焦磷酸测序与深度测序1. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由4种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其参入到引物链的3′-端，并释放出等量的焦磷酸基团（PPi）。
PPi可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。
每个峰值的高度与反应中参入的核苷酸数目成正比。
第一轮反应结束后，再加入下一种dNTP，继续下一轮DNA链的合成。
整个测序反应分为四步[图e7-3(1)]：图e7-3(1) 焦磷酸测序的原理（1）将单链DNA模板与其特异性的测序引物结合，然后加入四种酶的混合物，包括：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶（A TP sulfurylase，APS）、荧光素酶（luciferase）和双磷酸酶（apyrase）。
反应底物有腺苷-5′-磷酸硫酸（adenosine-5′-phosphosulfate，APS)和荧光素（luciferin）。
（2）向反应体系中加入1种dNTP，如果它正好能和DNA模板的下一个碱基配对，就会在DNA 聚合酶的作用下，被添加到测序引物的3′-端，同时释放出1分子的PPi。
dA TP 由腺苷-α硫-三磷酸（deoxyadenosine alfa-thio triphosphate，dATPαS）替代，原因是DNA聚合酶对dATPαS的催化效率比对dA TP的催化效率高，且dATPαS不是荧光素酶的底物。
（3）在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合，形成氧化荧光素，同时产生可见光。
通过电荷耦合器（charge coupled device，CCD）光学系统，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。
（4）反应体系中剩余的dNTP和残留的少量A TP在双磷酸酶的作用下发生降解。
（5）加入另一种dNTP，按第2、3、4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。
焦磷酸测序实验注意事项
焦磷酸测序实验注意事项焦磷酸测序，也被称为合成最短寡核苷酸测序，是一种用于测定DNA或RNA 序列的常用方法。
在进行焦磷酸测序实验时，需要注意以下几个方面。
第一，实验准备。
在进行焦磷酸测序实验之前，需要充分准备实验室材料和试剂。
要确保测序仪、PCR机、离心机等设备的正常工作，并检查试剂的储存条件和有效期。
此外，实验人员需要佩戴手套和其他适当的实验室防护设备，以确保实验操作的安全性。
第二，样品处理。
样品处理是焦磷酸测序实验的关键步骤之一。
在样品处理过程中，应严格控制所有可能引入污染物的环节。
为了避免交叉污染，实验人员在处理每个样品时应使用干净的工作区域、离心管和移液器。
此外，实验人员还应注意细菌和其他目标物的安全性处理。
第三，PCR扩增。
PCR扩增是焦磷酸测序实验中的关键步骤之一。
为了确保PCR 扩增的准确性和可复性，需要注意以下几个方面。
首先，从样品中提取的DNA 或RNA应具有足够的纯度和浓度。
其次，一个好的质量控制方法是增加PCR 反应的阴性对照，以确认放大产物的特异性。
此外，在设置PCR反应条件时，还需要注意设置适当的温度、时间和酶浓度等参数。
第四，焦磷酸测序反应。
焦磷酸测序反应是焦磷酸测序实验的核心步骤。
为了保证测序的准确性和可靠性，需要注意以下几个方面。
首先，在设置焦磷酸测序反应中，需要根据实验设计合理选择引物序列和标记方式。
其次，在进行测序反应时，要严格遵守反应体系的比例和浓度，避免测序试剂的过量或不足。
此外，在制备反应体系时，应严格遵守无菌操作规程，以防止污染引物。
第五，测序数据分析。
焦磷酸测序实验产生的数据量庞大，对数据的分析与处理至关重要。
在进行测序数据分析时，需要注意以下几个方面。
首先，选择合适的测序分析软件和工具，根据实验设计和预期目标进行数据分析。
其次，对测序数据进行质量控制，包括滤波、去除接头序列和低质量的片段等。
此外，还需要进行序列比对、碱基召回和突变检测等分析。
最后，实验结果的解读和报告。
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Unused Wells
In principle it’s possible to use so far unused pyrosequencing wells for the next run and leave the already used wells empty. However, due to contamination risk when cleaning and handling plates QIAGEN does not recommend this.
焦磷酸测序常见问题及解决方案
长沙三济医学检验所
Pyrosequencing遗传分析技术
Pyro.=pyrophosphate焦磷酸 一种全新的基于酶级联反应的 新型遗传分析技术;
一套完整的实验方案； 诸多领域的广泛应用……
测序原理
每次向反应体系中加入一种dNTP 相应位置的峰代表该种dNTP的掺入情况 峰高与掺入的核苷酸数量成正比 多余的dNTP在加入下一种dNTP前就被降解 C G
Use of the PyroMark Control Oligo
★ self-priming oligo ★ installation of the different PyroMark systems and can be used for general troubleshooting. ★ directly for sequencing without previous PCR setup and sample preparation by the vacuum prep tool. ★ check the vacuum ★ The PyroMark Control Oligo can be used on all PyroMark systems including the Q24, Q96 ID, and Q96 MD.
High substrate peak
Usually pyrophosphate or dATP/ATP contamination in the sample or in the buffer can cause a high substrate peak. Large amounts of pyrophosphate are generated in the PCR reaction and might be carried over to the sequencing reaction. Check the PyroMark buffers and reagents and use new ones.
单个高度的参考峰
TT
CC
A
CC
T
两个高度的参考峰
阴性对照
参考峰
Pyrosequencing步骤
结果分析
实验设计 Pyrosequencing序列分 析 PCR 试样预处理，获得 单链模板
1-2h /96 samples
SNP: 10min/24 samples SQA:30 min/24 samples 15 min/24 samples
Reduce background peaks
There are several reasons for a high assay background; the template can form secondary structures which are extended or the primers itself form dimmers which serve as template. Perform accurate sequencing controls (e.g. PCR or sequencing primer only) as recommended in the PyroMark User Manual to observe this kind of background. In addition, an unspecific priming of primer to template or unspecific annealing of sequencing primer to template might also be a background cause. Please check your complete primer design and if needed, perform a redesign. Try to lower the primer concentration as possible to avoid excess of primer.
Drifting Baseline
Let the PyroMark instrument warm up (about 60 minutes) to adapt to room temperature before use. Make sure the ambient room temperature is within range 18-28°C.
Signals Ceasing
The cartridge needle can be blocked or damaged causing a dispensation error. Clean the cartridge following the guidelines or repeat the run with a new cartridge. On the other hand if high amounts of template have been used resulting in very high signals (>100 RLU), the substrate for the sequencing reaction might be depleted. In this case template conditions should be optimized.
PyroMark instrument method or instrument code An instrument method or instrument code encodes the individual pulse time settings of specific cartridge lot batch. These pulse time settings change when e.g. a new batch of capillaries is used with slight variations in the needle diameter. For larger diameters, the pulse settings are lowered to dispense the correct volume of liquid. In addition, the viscosity of enzyme and substrate mixes can change which influences dispensing volumes. The individual instrument method/code number is printed on the cartridge label. The corresponding methods/code settings can be downloaded as a file from the respective instrument webpage and opened in the PyroMark application software.
control oligo single peak height
PyroMark Q24: 75 RLU +/- 25 RLU
Pyromark Q96 MD: ≥ 350 RLU
PyroMark Q96 ID： 35 +/- 10 RLU.
cartridges
When cleaning and storing the cartridges properly the Q24 cartridge can be used up to 30 times and Q96 ID cartridge up to 20 times.
Cross-talk
This can result from very high signal in a well which results in cross-talk between neighbouring wells. It could also be that the PyroMark instrument's camera is misaligned
Reading Length
Typical reading length using Pyrosequencing technology is 40-60 bases. However, as with any sequencing technology, the maximum read length will depend on template secondary structure, base content, quality of PCR-product, and other parameters.
Wide Peak
Usually wide peaks result from too much template for the used enzyme/substrate activity, or from reduced activity/performance of the enzymes themselves so that the pyrophosphate from previous nucleotide incorporation cannot be degraded as fast as usual.