蛋白质含量测定法(Bradford法)标准操作规程SOP

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目录

1目的 (4)

2范围 (4)

3定义 (4)

4环境、健康和安全 (4)

5培训 (4)

6职责 (4)

7程序（内容） (4)

7.1原理 (4)

7.2实验材料 (4)

7.3操作步骤 (5)

7.4结果计算 (5)

7.5判定标准 (6)

7.6注意事项 (6)

8相关文件 (6)

9参考文献 (6)

10流程图 (6)

11附录 (6)

蛋白质含量（Bradford法）测定记录 (1)

蛋白质含量（Bradford法）测定记录(适用于多个样品) (1)

1目的

规范蛋白质含量检测（Bradford法）的操作过程。

2范围

本规程适用于样品中蛋白质含量的检测（Bradford法）。

3定义

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4环境、健康和安全

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5培训

5.1培训部门：分析研究部。

5.2培训对象：分析研究部相关人员。

5.3培训方式和时数：自学，1小时。

5.4考核方式：问答。

6职责

6.1质量保证部：负责监督本文件的执行。

6.2分析研究部：负责严格执行本规程规定。

7程序（内容）

7.1原理

本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G250与蛋白质分子中的碱性氨基酸(精氨酸)和芳香族氨基酸结合形成蓝色复合物，该蓝色复合物在595nm处有最大吸收值，在一定浓度范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

7.2实验材料

7.2.1试药与试液

7.2.1.1超纯水：电阻率不低于18.2MΩ·cm，本方法所有试液均用超纯水配制。7.2.1.2酸性染色液：

（1）自配：称取0.l0g考马斯亮蓝G250，加乙醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加水稀释至1000ml，混匀。滤过，取滤液，即得。本试剂置棕色瓶内避光保存，如有沉淀产生，使用前再滤过，2～8℃保存6个月。

（2）购买商品化试剂：如Quick Start TM Bradford 1X Dye Reagent，Cat#500-0205，厂家BIO-RAD。商品化试剂均根据产品说明书使用。

7.2.1.3标准物质

BSA对照品溶液：取牛血清白蛋白标准品（来源：购自中国食品药品检定研究院），按标示含量加水溶解并制成适宜浓度（建议配制为1.0~2.0mg/ml）。分装后于-20℃及以下温度保存，有效期2年。

7.2.2仪器与用具

移液器、具塞玻璃试管、玻璃比色皿、紫外-可见分光光度计、EP管、漩涡混合仪。

7.3操作步骤

7.3.1标准曲线制作：取BSA对照品溶液，用水稀释至0.10mg/ml。按下表稀释方法制作标准曲线。BSA对照品溶液均直接稀释至具塞试管内。

表7.1 标准曲线制作表

7.3.2供试品稀释：按预估浓度将供试品稀释至终浓度在20μg/ml~ 60μg/ml之间，单次稀释的最高稀释倍数不超过12倍，稀释时取样体积不能低于50μl。每个样品各做一个平行样。分别量取1.0ml样品加入具塞试管内或者最后一步稀释时直接稀释至具塞试管内。

7.3.3若供试品缓冲液较为复杂（如有些工艺中间样品变性液和复性蛋白液中含有尿素），需设立空白缓冲液对照，进行供试品吸光度的校正，详见各品种项下规定，检测时其终稀释倍数与对应供试品相同。

7.3.4分别向各试管中加入已平衡至室温的酸性染色液5.0ml，立即混匀，室温下放置10min。

7.3.5在紫外-可见分光光度计中，在595nm波长处，以0号管作为空白，分别检测1号至5号对照品管和各样品管的吸光值。

7.4结果计算

以对照品溶液OD值为纵坐标、对照品溶液的含量为横坐标做线性回归，求得回归方程和线性相关系数R2。然后将供试品溶液的OD值（如进行了校正，则用校正后OD值）代入线性回归方程，计算供试品溶液的蛋白质含量实测值，并乘以其稀释倍数即得供试品溶液的蛋白质含量。

7.5判定标准

实验成立标准：标准曲线的线性相关系数R2≥0.99，平行样实测值之间的相对偏差≤2.0%。若同时满足以上两个条件则本次实验有效，否则实验无效。

7.6注意事项

7.6.1碱性较强的供试品应将pH调到中性后再进行测定。

7.6.2含有去污剂、Triton x-100、吐温、十二烷基硫酸钠（SDS）等的供试品不能采用该法进行蛋白质含量测定。

7.6.3本法测定时不能使用可与染色物结合的比色皿（如石英比色皿)，建议使用玻璃比色皿或其他适宜材料的比色皿。

7.6.4向各试管中分别加入酸性染色液时，应合理安排好管与管的间隔时间，控制好每管样品的反应时间，使反应时间尽可能保持一致。

7.6.5注：本法通常可测定1~200μg的蛋白质量，依据实际情况（如不同品牌染液、环境温度等因素），对照品溶液取用量可在该测定范围内进行适当调整。

8相关文件

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9参考文献

9.1《中国药典》2015年版第四部，通则0731，“蛋白质含量测定法第五法-考马斯亮蓝法（Bradford法）”。

10流程图

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11附录

蛋白质含量（Bradford法）测定记录

一、实验材料

1、标准物质

2、试药与试液

3、仪器与用具

二、操作步骤

1、样品处理

1.1标准曲线：取BSA对照品溶液（浓度mg/ml），用水稀释至

0.10mg/ml，稀释过程为：。

按下表稀释方法制作标准曲线，对照品溶液均直接稀释至具塞玻璃试管内。