蛋白质含量测定法(Bradford法)标准操作规程SOP
实验一Bradford法测定蛋白质浓度
实验一Bradford法测定蛋白质浓度1.目的：练习标准曲线的制作，比较不同pH值的蛋白质标准溶液对测定的影响。
2.试剂：①显色剂：取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%（w/v）磷酸，将溶液用水稀释到1000ml。
②BSA标准溶液（1000µg/ml），分别用0.01N盐酸，去离子水，0.01N NaOH溶液配制，4℃冰箱放置可保存一周。
3.设备与仪器：微量注射器：一支用于专吸BSA；一支用于专吸dH2O岛津UV-265紫外可见光分光光度计4.操作程序：试管号 1 2 3 4 5 6BSA（µl）0 10 20 40 70 100去离子水（µl）100 90 80 60 30 0显色剂（ml） 5 5 5 5 5 5加显色剂混匀，静止2min后测定OD595，建立标准曲线注：①显色液中G-250，出现沉淀不能用。
②定容BSA标准液时，混合次数，以保证混匀。
实验二蛋白质的浓缩（PEG法）1.原理干PEG粉末吸收水分和盐类，大分子溶液即被浓缩。
PEG吸收水分的速度很快，为防止PEG进入蛋白质溶液，最好选用分子量大的PEG。
一般用分子量为20000的PEG。
2.试剂与设备牛血清白蛋白（BSA），聚乙二醇（PEG），玻璃纸，岛津UV-265紫外可见光分光光度计3.操作将一定浓度的BSA溶液20mL放入具有半透膜性质的方形玻璃纸中，用细线扎住口，放入盛有PEG干粉的培养皿中，让盛有BSA溶液的玻璃纸外周涂上PEG；当玻璃纸上的PEG干粉湿透后，抹去PEG，如此反复几次，就可达到浓缩的效果。
当样品浓缩至少于3mL时，进行OD280测值。
4.结果可直接比较浓缩前后OD值的变化；也可制作一个标准曲线，定量描述蛋白质浓度的变化。
表蛋白质浓度的标准曲线管号 1 2 3 4 5 标准BSA溶液（mL） 1 2 3 4 5 蒸馏水（mL） 4 3 2 1 0 蛋白质浓度（mg/mL）0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 ABS280标准BSA溶液的浓度为1mg/mL5.计算求回归方程，并利用该方程计算浓缩前后浓度的变化。
Bradford法测蛋白浓度
Bradford法测蛋白浓度一、考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝G─250 20mg溶于9.5mL乙醇中，加入17mL 磷酸和173.5ml蒸馏水。
二、标准和待测蛋白质溶液1．标准蛋白质溶液IFN-r紫外扫描定量，用0.15mol/L NaCl配制成1OD280/mL蛋白溶液。
2．待测蛋白质溶液。
DH5a 菌体蛋白和XL－Blue菌体蛋白，使用前用0.15mol/L NaCl稀释。
三、器材DU800四、操作方法1.制作标准曲线取7支离心管，按下表平行操作。
试管编号0123456标准蛋白溶液（mL）00.010.020.030.040.050.06 0.15mol/L NaCl（mL）0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂（mL）5mL摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm测定结果如下：蛋白量（ug）580nm 1 580nm 2 580nm平均595nm 1 595nm 2595nm平均10 0.0814 0.0755 0.07845 0.0709 0.0671 0.06920 0.2335 0.2288 0.23115 0.2144 0.2188 0.216630 0.32 0.285 0.3025 0.307 0.2661 0.2865540 0.372 0.389 0.3805 0.3537 0.372 0.3628550 0.443 0.4927 0.46785 0.4196 0.4751 0.4473560 0.6408 0.528 0.5844 0.6224 0.5079 0.56515 实验过程中发现，蛋白与G-250混合后，吸收值不稳定，随时间变化。
2.扫描测试实验1）加20ug IFN-r，混合后扫描595nm吸收变化值，参比：450nm，时间：0——50min，测1次/min ，结果：吸收值随时间逐渐下降，图谱名称:20110321 20 ug2）加60ug IFN-r，混合后扫描595nm吸收变化值，参比：450nm，时间：0——50min，测1次/min，结果：吸收值随时间逐渐下降，10——20min时变化幅度较小，图谱名称:20110321 60ug3）加40ug IFN-r扫描，混合后400——700nm波长扫描，分别在1、2、3、4、5、10、15、20、25、30min时扫描，595nm吸收值随时间逐渐下降，450nm吸收值变化很小，变化值约0.001。
蛋白质含量测定法（Bradford法）标准操作规程SOP
蛋⽩质含量测定法（Bradford法）标准操作规程SOP审批页⽬录1⽬的 (4)2范围 (4)3定义 (4)4环境、健康和安全 (4)5培训 (4)6职责 (4)7程序（内容） (4)7.1原理 (4)7.2实验材料 (4)7.3操作步骤 (5)7.4结果计算 (5)7.5判定标准 (6)7.6注意事项 (6)8相关⽂件 (6)9参考⽂献 (6)10流程图 (6)11附录 (6)蛋⽩质含量（Bradford法）测定记录 (1)蛋⽩质含量（Bradford法）测定记录(适⽤于多个样品) (1)1⽬的规范蛋⽩质含量检测（Bradford法）的操作过程。
2范围本规程适⽤于样品中蛋⽩质含量的检测（Bradford法）。
3定义————4环境、健康和安全————5培训5.1培训部门：分析研究部。
5.2培训对象：分析研究部相关⼈员。
5.3培训⽅式和时数：⾃学，1⼩时。
5.4考核⽅式：问答。
6职责6.1质量保证部：负责监督本⽂件的执⾏。
6.2分析研究部：负责严格执⾏本规程规定。
7程序（内容）7.1原理本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G250与蛋⽩质分⼦中的碱性氨基酸(精氨酸)和芳⾹族氨基酸结合形成蓝⾊复合物，该蓝⾊复合物在595nm处有最⼤吸收值，在⼀定浓度范围内其颜⾊深浅与蛋⽩质浓度呈正⽐，以蛋⽩质对照品溶液作标准曲线，采⽤⽐⾊法测定供试品中蛋⽩质的含量。
7.2实验材料7.2.1试药与试液7.2.1.1超纯⽔：电阻率不低于18.2MΩ·cm，本⽅法所有试液均⽤超纯⽔配制。
7.2.1.2酸性染⾊液：（1）⾃配：称取0.l0g考马斯亮蓝G250，加⼄醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加⽔稀释⾄1000ml，混匀。
滤过，取滤液，即得。
本试剂置棕⾊瓶内避光保存，如有沉淀产⽣，使⽤前再滤过，2～8℃保存6个⽉。
（2）购买商品化试剂：如Quick Start TM Bradford 1X Dye Reagent，Cat#500-0205，⼚家BIO-RAD。
蛋白质含量测定操作细则
蛋白质含量测定操作细则1．试剂与器材：1．1标准蛋白溶液（100μg/ml），经事先标定。
1．2酚试剂：酚试剂贮备液（购买国产或进口）经标准氢氧化钠液滴定，测定酸浓度，用注射用水稀释至1M，即为酚试剂。
1．3 2%酒石酸钠溶液：称取2克酒石酸钠，加注射用水溶解至100ml。
1．4 1%硫酸铜溶液：称取1克硫酸铜，加注射用水溶解至100ml。
1．5 4%碳酸钠溶液：称取4克碳酸钠，加注射用水溶解至100ml。
1．6 0.8%氢氧化钠溶液：称取0.8克氢氧化钠，加注射用水溶解至100ml。
1．7 碱性铜液（用时现配）取试剂1. 3、1. 4各0.5ml，试剂1. 5、1. 6各25ml，混匀。
1．8 分光光度计（有650nm波长）1．9 计算器：CASIO fx－3900 （能计算相关系数）1．10电子天平1．11试剂瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、洗耳球、滤纸等1．12吸管、移液管、中试管、试管架2．操作：2．1标准曲线：精确量取标准蛋白液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分别加入试管中，补加注射用水至1ml，加碱性铜液5ml，混匀，放置10分钟后，快速加入酚试剂0.5ml，混匀，室温放置30分钟，于650nm波长比色，测定其OD值，计算相关系数。
2．2样品测定：精确量取适量样品（蛋白约为50μg）于试管内，补加注射用水至1ml，加碱性铜液5ml，混匀，放置10分钟后，快速加入酚试剂0.5ml，混匀，室温放置30分钟，于650nm 波长比色，测定其OD值，（显色后，若浑浊，经3000rpm离心后再比色）。
3．结果计算：3．1坐标法以蛋白浓度为横坐标，测定的OD值为纵坐标，作一标准曲线，根据样品的OD值从标准曲线上查出相应的结果（μg），进行计算。
查出的结果×稀释倍数蛋白含量（μg/ml）=取样量查出的结果×稀释倍数蛋白含量（μg/ml）=取样量×10×固总3．2计算器法：3．2．1按AC键，打开计算器开关。
(完整word版)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
如核糖核酸酶或溶菌酶。
去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。
如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。
染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。
注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
适用范围考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。
当考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm 变为595nm。
在考马斯亮蓝G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250 从吸收峰为465nm 的形式转变成吸收峰为595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。
一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。
05-Bradford法测定蛋白质含量
Bradford法测定蛋白质含量
一、实验目的 二、实验原理 三、实验器材
四、材料与试剂
五、操作方法
六、注意事项
一、实验目的
1．熟悉Bradford法测定蛋白质含量的 基本原理。 2．掌握Bradford法测定蛋白质含量的 基本操作步骤。
二、实验原理
1．Bradford法是1976年由M.M. Bradford创 建的一种快速的蛋白质定量分析方法。 "Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Anal. Biochem. 72: 248–254 (1976).
2. 其它试剂
（1）考马斯亮蓝G-250溶液；
（2）标准蛋白质溶液0.ห้องสมุดไป่ตู้mg/ml；
五、操作步骤
1．蛋白质标准曲线的绘制和未知样品浓度的 测定；1#样：酪蛋白，稀释150倍；2#样：未 知蛋白
2.6＋4＝10个试管编号，加入相应药品，混 匀，静置2min； 3.测定OD595nm下的光吸收值。
4.根据所得数据绘制标准蛋白质曲线，并计算 未知样品的浓度； 5.完成实验报告。
• 下次实验：
• 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
• 时间：5月9日下午1：00
• 今天的值日：第10，11，12组
二、实验原理
2．Bradford法基本原理。 考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，光吸收值 从465nm转变为595nm。 测定样品的灵敏度高，最低检出量为1微克。
反应过程为大约2min，而且1h内稳定。
Bradford法测定蛋白质含量资料1
Bradford法具体操作步骤:（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。
如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。
(SOP-QC-007-01)_Bradford法检测蛋白质含量标准操作规程
Bradford法测蛋白质含量标准操作规程Bradford法检测蛋白质含量1.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
2.器皿与耗品：所有玻璃器皿为清洁级，37度烤干。
tube、tip：一次性使用，容量瓶，96孔酶标板，3.仪器设备：酶标仪：旋涡混匀器。
4.溶液的配置：4.1.G250储存液：95%无水乙醇：100ml88%磷酸：200 ml考马斯量兰G250：350mg室温下可长期保存，稳定。
4.2.G250工作液：双蒸水：425ml95%无水乙醇：15 ml88%磷酸：30 mlG250储存液：30 ml可根据体积相应缩小比例配制，用1号滤纸过滤并保存于室温棕色瓶中，可使用数周。
6.3牛血清白蛋白标准品BSA(实验室购买).配制标准品标准程序：将牛血清白蛋白配制成1mg/ml，取牛血清白蛋白100mg，先用超纯水溶解，待其溶解后定容到一个洁净的100ml容量瓶中，300ul分装，保存于-20度，使用时，将其稀释至200ug/ml，配制标准品备用。
4.3.标准品的鉴定用原有的标准品做标准曲线，随机取三支本分装品为样品，测定样品蛋白含量，得X ±SD（其中X 单位为ug/ml）与RSD, 当X值为98-102，且RSD值小于等于2%者，认为该标准品的标示浓度为200ug/ml。
lBradford法测蛋白质含量标准操作规程5.程序：5.1.样品的处理5.1.1.一次检测过程包括标准不能超过20个样品。
若是原液或成品, 每个样品需做2个或3个稀释度：V水＝V原（d－1）其中V水为需要加入纯化水的体积，V原为稀释前样品的体积，d为稀释度5.1.2.待测样品如为冻干品，则根据标示量稀释至1mg/ml，再稀释10倍；待测样品如为未知浓度的样品，可以根据bradford标准品颜色目测后稀释样品。
5.1.3.待测样品均需溶解后先离心，再进行稀释和检测操作。
5.1.4.稀释后的样品需做同样的三个反应体系。
bradford(分光光度计)
Bradford法测定蛋白含量，建立标曲（分光光度计）。
实验原理：考马斯亮蓝G—250染色液可以与蛋白质上特定结构相结合形成复合物，其最大光吸收峰值也由465nm变为595nm，并且在一定浓度范围内，反应液复合物在595nm处吸光度的变化值与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加值即可测定蛋白含量，建立标曲。
该法测定蛋白浓度的灵敏范围是25μl/ml-200μl/ml。
实验试剂：㈠：考马斯亮兰—G250染色液㈡：牛血清白蛋白㈢：超纯水㈣：无水乙醇实验仪器：㈠：移液器2-20μl PIPETMAN20-100μl PIPETMAN1000μl eppendorf㈡：移液枪头AxyGen㈢：离心管18只 1.5ml AxyGen㈣：分光光度计BIO-RAD Smartspec 3000㈤：漩涡混匀器㈥：比色皿㈦：离心管架实验步骤：㈠：Bsa（5mg/ml）4°c解冻，考马斯亮兰染色液常温放置20分钟㈡：取50μl Bsa加入1.5ml离心管，加超纯水450μl配成0.5mg/mlBsa标准溶液500μl㈢：由于bradford法测蛋白浓度的灵敏范围是25μl/ml-200μl/ml，所以分别取25μl/ml、75μl/ml、125μl/ml、175μl/ml、200μl/ml五个浓度值。
㈣：去六只离心管分别编号0、1、2、3、4、5，按下表配置溶液。
㈤：做三组平行组㈥：加样漩涡混匀，静置2-3分钟㈦：设置分光光度计的光吸收值于595nm处，以空白组（0组）为对照测另五组光吸收值（od值），以每个浓度点的离心管为一组（平行3只）建立标曲。
备注：染色液2-8°c保存，标准蛋白-20°c保存，有效期一年。
蛋白质含量测定法（BCA法）标准操作规程SOP
蛋白质含量测定法（BCA法）标准操作规程SOP蛋白质含量测定法（BCA法）标准操作规程文件编码：SOPXXXX目录1. 目的 (1)2. 范围 (1)3. 职责 (1)4. 依据 (1)5. 定义 (1)6. 内容 (1)6.1. 原理 (1)6.2. 实验材料 (1)6.3. 操作步骤 (2)6.4. 结果计算 (3)6.5. 判定标准 (4)6.6. 注意事项 (4)7. 相关文件 (5)8. 附件 (5)9. 变更历史 (5)1.目的1.1.规范蛋白质含量检测（BCA法）的操作过程。
2.范围2.1.本规程适用于BF02及其它适合于BCA法的样品（原液或成品）的蛋白质含量测定。
3.职责3.1.方法学研究员负责严格执行本规程规定；3.2.方法学研究室负责人负责本规程的培训并监督本规程的执行。
4.依据4.1.《中国药典》2015年版，通则0731“蛋白质含量测定法”，第四法2,2，-联喹啉-4,4，-二羧酸法（BCA法）5.定义5.1.BCA：2,2，-联喹啉-4,4，-二羧酸法5.2.BSA：牛血清白蛋白5.3.TCA：三氯乙酸5.4.EDTA：乙二胺四乙酸5.5.EGTA：乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸5.6.DTT：二硫苏糖醇6.内容6.1.原理依据蛋白分子在碱性溶液中将Cu2+还原为Cu+，2,2，-联喹啉-4,4，-二羧酸（BCA）与Cu+结合形成紫色复合物，该复合物在562nm处有最大吸收值。
在一定浓度范围内，其溶液颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液（BSA）作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
6.2.实验材料6.2.1. 试药与试液6.2.1.1. 超纯水：电阻率不低于18.2MΩ·cm ，本方法所有试液均用超纯水配制。
6.2.1.2. 铜-BCA 试液：取2, 2'-联喹啉-4，4'-二羧酸钠l.0g ，无水碳酸钠2.0g ，酒石酸钠0. 16g ，氢氧化钠0. 4 g 与碳酸氢钠0.95g ，加水使溶解成100ml ，调节pH 值至11.25,作为甲液，甲液室温保存不超过6个月；另取4 % 硫酸铜溶液作为乙液，乙液室温保存不超过6个月，临用前取甲液、乙液，按体积比（甲液：乙液=50:1）进行混匀后使用。
Bradford法蛋白质含量的测定
Bradford法蛋白质含量的测定
原理：这一方法基于考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。
在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。
反应化合物在 465-595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。
溶液：
1）Bradford储存液
100ml95%乙醇
200ml88%磷酸
350mgServaG蓝
室温下长期保持稳定。
2）Bradford工作液
425ml双蒸水
15ml95%乙醇
30ml88%磷酸
30ml Bradford储存液
用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。
3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）
做标准曲线：
取样品即可测量。
注意事项：
1、样品制备，样品制备是做好2-d 的关键，样品中离子浓度不能过大，最好用新
鲜的样品提取蛋白质，如果不确定蛋白提取情况，建议先跑sds-page检验。
2、上样量的问题， ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖。
3、ipg 胶条ph 的选择，根据不同样品选择不同pH值。
4、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度需调整。
_Bradford法检测蛋白质含量标准操作规程
Bradford法测蛋白质含量标准操作规程Bradford法检测蛋白质含量1.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
2.器皿与耗品：所有玻璃器皿为清洁级，37度烤干。
tube、tip：一次性使用，容量瓶，96孔酶标板，3.仪器设备：酶标仪：旋涡混匀器。
4.溶液的配置：4.1.G250储存液：95%无水乙醇：100ml88%磷酸：200 ml考马斯量兰G250：350mg室温下可长期保存，稳定。
4.2.G250工作液：双蒸水：425ml95%无水乙醇：15 ml88%磷酸：30 mlG250储存液：30 ml可根据体积相应缩小比例配制，用1号滤纸过滤并保存于室温棕色瓶中，可使用数周。
6.3牛血清白蛋白标准品BSA(实验室购买).配制标准品标准程序：将牛血清白蛋白配制成1mg/ml，取牛血清白蛋白100mg，先用超纯水溶解，待其溶解后定容到一个洁净的100ml容量瓶中，300ul分装，保存于-20度，使用时，将其稀释至200ug/ml，配制标准品备用。
4.3.标准品的鉴定用原有的标准品做标准曲线，随机取三支本分装品为样品，测定样品蛋白含量，得X ±SD（其中X 单位为ug/ml）与RSD, 当X值为98-102，且RSD值小于等于2%者，认为该标准品的标示浓度为200ug/ml。
Bradford法测蛋白质含量标准操作规程5.程序：5.1.样品的处理5.1.1.一次检测过程包括标准不能超过20个样品。
若是原液或成品, 每个样品需做2个或3个稀释度：V水＝V原（d－1）其中V水为需要加入纯化水的体积，V原为稀释前样品的体积，d为稀释度5.1.2.待测样品如为冻干品，则根据标示量稀释至1mg/ml，再稀释10倍；待测样品如为未知浓度的样品，可以根据bradford标准品颜色目测后稀释样品。
5.1.3.待测样品均需溶解后先离心，再进行稀释和检测操作。
5.1.4.稀释后的样品需做同样的三个反应体系。
Bradford法
蛋白含量的测定一、试剂1．试剂A：考马斯亮蓝G—250原液称取100mg考马斯亮蓝G—250溶于50mL 95%的乙醇，加入100mL 85%（W/V）磷酸。
2．试剂B：0.01%考马斯亮蓝G—250测定工作液将考马斯亮蓝G—250原液与双蒸水按15：85比例混匀，过滤。
4℃，棕色瓶保存。
3．0.1N 盐酸和双蒸H2O（新鲜备制，浓盐酸稀释120倍）4．蛋白标准液：10 mg/ml BSA蛋白溶液储液，将10mg BSA标准品溶于1mL水，室温稳定2小时，12,000g 离心10min，—20℃保存6—8月，—80℃保存1年。
将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。
12,000g离心10min后小量分装，—20℃保存6—8月，—80℃保存1年。
5．稀释液：待测样品的溶剂。
小量分装，—20℃保存。
6．待测样品（12,000g离心10min ）二、器材1．15mm*150mm试管；2．分光光度计；3．5ml、1ml、100 μl、10 μl取液枪4．Excel worksheet操作步骤1．标准曲线的测定（1）准备：将蛋白标准液、稀释液取出融解；考马斯亮蓝G—250测定工作液取出恢复室温；根据测定用量新鲜准备0.1N 盐酸和双蒸水。
（2）将9支干燥洁净的试管编号，按下表加入试剂，摇匀，室温放置半分钟后各管加入3.5ml 考马斯亮蓝G—250测定工作液, 摇匀，室温放置10min后，以0号管为空白调零测定其余各管595nm处相对吸光度。
管号0 1 2 3 4 5 6 7 8双蒸H2O/μL 80 70 70 70 70 70 70 70 70蛋白标准液/μL 0 10 10 10 10 10 10 10 10稀释液/μL 10 10 10 10 10 10 10 10 100.1NHCL/μL10 10 10 10 10 10 10 10 102．样品的测定（1）在一干燥洁净试管内，先加入80μL双蒸H2O，再加入用稀释液调整蛋白浓度到测定范围的样品10μL，加入0.1NHCL10μL混匀半分钟后，加入3.5ml考马斯亮蓝G—250测定工作液, 摇匀，室温放置10min后测定其在595nm处相对吸光度（2）同（1）操作，测定两个平行样，取其平均。
考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量doc
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）, 蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
由于蛋白质－染料复合物具有很 高的消光系数，因此大大提高了蛋白 质测定的灵敏度（最低检出量为 1µg）。
【器材与试剂】
（一）器材 1. 可见光分光光度计 2. 刻度移液管 3. 移液枪
朗伯—比尔定律:
A=lg(1/T)=Kbc
A为吸光度; T为透光度,是透射光强度比上入射光强度（I/I0); c为吸光物质的浓度; b为吸收层厚度(光程）.
物理意义 当一束平行单色光垂直通过某一吸光物质时,其吸 光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比.
思考题
1.蛋白质的测定方法有几种？比较各种方法 的优缺点。
考马斯亮蓝G-250在游离状态 下呈红色，最大光吸收在 465nm；当它与蛋白质结合 后变为青色，蛋白质-色素结 合物在595nm波长下有最大 光吸收。其光吸收值与蛋白质 含量成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G250的 结合十分迅速，约2min即可 反应完全，其复合物在1h内 保持稳定。
考马斯亮蓝R250与蛋白 质反应虽然比较缓慢， 但是可以被洗脱下去， 所以可以用来对电泳条 带染色。
考马斯亮蓝法（Bradford法） 测定蛋白质含量
【实验目的】 1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量 测定蛋白质的原理与方法。
2. 熟练分光光度计的使用和 操作方法。
【实验原理】
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于 染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕 红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白 质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色， 其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数 更大。
Bradford法测定纯化样品的蛋白含量
Bradford 法测定纯化样品的蛋白含量试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取10mg 牛血清白蛋白（BSA ），溶于10mL 蒸馏水中，即为1 000μg ／mL 的原液。
（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取10mg 考马斯亮蓝G-250，溶于5mL 90％乙醇中，加入85％（W ／V ）的磷酸10mL ，最后用蒸馏水定容到1 00mL 。
此溶液在常温下可放置一个月。
（3）90％乙醇 （4）磷酸（85％） 操作步骤1．标准曲线制作（1）0~500μg ／mL 标准曲线的制作：取96孔板，按表1取样。
混匀，放置2min 后用酶标仪在595nm 波长下吸光度，记录各管测定的光密度OD 595nm ，并做标准曲线，测量应在1h 内完成。
表1 标准曲线制作（每孔重复2次）管 号1 2 3 4 5 6 71 000μg ／mL 标准蛋白液（uL ）0 10 20 40 60 80 100 蒸馏水（uL ） 100 90 80 60 40 20 0 考马斯亮蓝G-250试剂（uL ） 100 100 100100100 100100 蛋白质浓度（μg /ml ） 0 50 100 200 300 400 500 蛋白质含量（μg ）1020406080100OD 595nm2．样品提取液中蛋白质浓度的测定测定：按下表取样。
充分混合，放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色，记录光密度OD 595nm ，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X （μg ）。
以标准曲线1号试管做空白。
表3 待测液蛋白质浓度测定管 号待测液蛋白质待测样品提取液（ul ）20 80 100蒸馏水（ul ） 考马斯亮蓝G-250试剂（ul ）OD 595nm 蛋白质含量（μg ）。
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审批页
目录
1目的 (4)
2范围 (4)
3定义 (4)
4环境、健康和安全 (4)
5培训 (4)
6职责 (4)
7程序（内容） (4)
7.1原理 (4)
7.2实验材料 (4)
7.3操作步骤 (5)
7.4结果计算 (5)
7.5判定标准 (6)
7.6注意事项 (6)
8相关文件 (6)
9参考文献 (6)
10流程图 (6)
11附录 (6)
蛋白质含量（Bradford法）测定记录 (1)
蛋白质含量（Bradford法）测定记录(适用于多个样品) (1)
1目的
规范蛋白质含量检测（Bradford法）的操作过程。
2范围
本规程适用于样品中蛋白质含量的检测（Bradford法）。
3定义
————
4环境、健康和安全
————
5培训
5.1培训部门：分析研究部。
5.2培训对象：分析研究部相关人员。
5.3培训方式和时数：自学，1小时。
5.4考核方式：问答。
6职责
6.1质量保证部：负责监督本文件的执行。
6.2分析研究部：负责严格执行本规程规定。
7程序（内容）
7.1原理
本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G250与蛋白质分子中的碱性氨基酸(精氨酸)和芳香族氨基酸结合形成蓝色复合物，该蓝色复合物在595nm处有最大吸收值，在一定浓度范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
7.2实验材料
7.2.1试药与试液
7.2.1.1超纯水：电阻率不低于18.2MΩ·cm，本方法所有试液均用超纯水配制。
7.2.1.2酸性染色液：
（1）自配：称取0.l0g考马斯亮蓝G250，加乙醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加水稀释至1000ml，混匀。
滤过，取滤液，即得。
本试剂置棕色瓶内避光保存，如有沉淀产生，使用前再滤过，2～8℃保存6个月。
（2）购买商品化试剂：如Quick Start TM Bradford 1X Dye Reagent，Cat#500-0205，厂家BIO-RAD。
商品化试剂均根据产品说明书使用。
7.2.1.3标准物质
BSA对照品溶液：取牛血清白蛋白标准品（来源：购自中国食品药品检定研究院），按标示含量加水溶解并制成适宜浓度（建议配制为1.0~2.0mg/ml）。
分装后于-20℃及以下温度保存，有效期2年。
7.2.2仪器与用具
移液器、具塞玻璃试管、玻璃比色皿、紫外-可见分光光度计、EP管、漩涡混合仪。
7.3操作步骤
7.3.1标准曲线制作：取BSA对照品溶液，用水稀释至0.10mg/ml。
按下表稀释方法制作标准曲线。
BSA对照品溶液均直接稀释至具塞试管内。
表7.1 标准曲线制作表
7.3.2供试品稀释：按预估浓度将供试品稀释至终浓度在20μg/ml~ 60μg/ml之间，单次稀释的最高稀释倍数不超过12倍，稀释时取样体积不能低于50μl。
每个样品各做一个平行样。
分别量取1.0ml样品加入具塞试管内或者最后一步稀释时直接稀释至具塞试管内。
7.3.3若供试品缓冲液较为复杂（如有些工艺中间样品变性液和复性蛋白液中含有尿素），需设立空白缓冲液对照，进行供试品吸光度的校正，详见各品种项下规定，检测时其终稀释倍数与对应供试品相同。
7.3.4分别向各试管中加入已平衡至室温的酸性染色液5.0ml，立即混匀，室温下放置10min。
7.3.5在紫外-可见分光光度计中，在595nm波长处，以0号管作为空白，分别检测1号至5号对照品管和各样品管的吸光值。
7.4结果计算
以对照品溶液OD值为纵坐标、对照品溶液的含量为横坐标做线性回归，求得回归方程和线性相关系数R2。
然后将供试品溶液的OD值（如进行了校正，则用校正后OD值）代入线性回归方程，计算供试品溶液的蛋白质含量实测值，并乘以其稀释倍数即得供试品溶液的蛋白质含量。
7.5判定标准
实验成立标准：标准曲线的线性相关系数R2≥0.99，平行样实测值之间的相对偏差≤2.0%。
若同时满足以上两个条件则本次实验有效，否则实验无效。
7.6注意事项
7.6.1碱性较强的供试品应将pH调到中性后再进行测定。
7.6.2含有去污剂、Triton x-100、吐温、十二烷基硫酸钠（SDS）等的供试品不能采用该法进行蛋白质含量测定。
7.6.3本法测定时不能使用可与染色物结合的比色皿（如石英比色皿)，建议使用玻璃比色皿或其他适宜材料的比色皿。
7.6.4向各试管中分别加入酸性染色液时，应合理安排好管与管的间隔时间，控制好每管样品的反应时间，使反应时间尽可能保持一致。
7.6.5注：本法通常可测定1~200μg的蛋白质量，依据实际情况（如不同品牌染液、环境温度等因素），对照品溶液取用量可在该测定范围内进行适当调整。
8相关文件
————
9参考文献
9.1《中国药典》2015年版第四部，通则0731，“蛋白质含量测定法第五法-考马斯亮蓝法（Bradford法）”。
10流程图
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11附录
蛋白质含量（Bradford法）测定记录
一、实验材料
1、标准物质
2、试药与试液
3、仪器与用具
二、操作步骤
1、样品处理
1.1标准曲线：取BSA对照品溶液（浓度mg/ml），用水稀释至
0.10mg/ml，稀释过程为：。
按下表稀释方法制作标准曲线，对照品溶液均直接稀释至具塞玻璃试管内。
1.2供试品稀释处理
1.2.1□原液：取供试品瓶/支，预估蛋白质浓度为mg/ml。
□成品：取供试品瓶/支，分别用ml水复溶，初始蛋白质浓度为
mg/ml。
1.2.2用稀释液按下表稀释方法稀释待测样品，并设置平行样。
2、分别取稀释后待测样品溶液各1.0ml置具塞试管内（或最后一步稀释直接稀
释至试管内），并做好标记。
3、分别向各管中加入ml 已平衡至室温的考马斯亮蓝（G-250）染液，于
室温下放置min后，以0号管作为空白，分别于595nm波长处测定吸光度。
三、结果计算
1、以BSA对照品浓度为X轴，其对应的OD值为Y轴，做直线回归。
直线回归方程为：，线性相关系数R2为。
2、将测得的样品OD值代入标准曲线计算出实测值，并按以下公式计算供试品
蛋白质含量。
□蛋白质含量(mg/ml)=实测值平均值(μg/ml)×稀释倍数÷1000
□蛋白质含量(mg/瓶)=实测值平均值(μg/ml)×稀释倍数×复溶体积÷1000
3、本次实验线性相关系数R2= （□≥0.99□＜0.99）；实测值相对偏差
为（□≤2.0% □＞2.0%），则本次实验结果（□有效□无效）。
四、结果判定
1、标准规定：□
□N/A
2、检验结果：
3、检验结论：□符合规定□不符合规定□复检□N/A
五、备注
1、附原始检测数据共页。
2、
以下无内容。
操作人/日期：复核人/日期：
蛋白质含量（Bradford法）测定记录
一、实验材料
1、标准物质
2、试药与试液
3、仪器与用具
二、操作步骤
1、样品处理
1.1标准曲线：取BSA对照品溶液（浓度mg/ml），用水稀释至
0.10mg/ml，稀释过程为：。
按下表稀释方法制作标准曲线，对照品溶液均直接稀释至具塞玻璃试管内。
1.2供试品稀释处理：
1.2.1供试品前处理：
1.2.2用稀释液按下表稀释方法稀释待测样品，并设置平行样。
2、分别取稀释后待测样品溶液各1.0ml置具塞试管内（或最后一步稀释直接稀
释至试管内），并做好标记。
3、分别向各管中加入ml已平衡至室温的考马斯亮蓝（G-250）染液，于
室温下放置min后，以0号管作为空白，分别于595nm波长处测定吸光度。
三、结果计算
1、以BSA对照品浓度为横坐标（X轴），其对应的OD值为纵坐标（Y轴），
做直线回归。
获得直线回归方程和线性相关系数R2。
直线回归方程为：，线性相关系数R2为。
2、将测得的样品OD值代入标准曲线计算出实测值，并按以下公式计算供试品
蛋白质含量。
□蛋白质含量（mg/ml）=实测值平均值(μg/ml)×稀释倍数÷1000
□蛋白质含量(mg/瓶)=实测值平均值(μg/ml)×稀释倍数×复溶体积÷1000
□蛋白质含量占标示量的百分比=蛋白质含量÷蛋白质含量标示量×100%
3、本次实验线性相关系数R2= （□≥0.99□＜0.99）；实测值相对偏差
为（□均≤2.0% □均＞2.0% □
），则本次实验结果（□均有效□均无效□）。
四、结果判定
1、标准规定：□
□N/A
2、检验结果及检验结论
五、备注
1、附原始检测数据共页。
2、
以下无内容。
操作人/日期：复核人/日期：。