循环肿瘤细胞检测的现状及发展

循环肿瘤细胞检测的现状及发展

作者：上海市第一人民医院检验科李莉教授

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恶性肿瘤远处转移是临床上实体恶性肿瘤治疗失败或复发的主要原因之一。而循环肿瘤细胞的存在正是实体恶性肿瘤远处转移的根源。肿瘤远处转移的最经典依据是1889年Paget[1]提出的“种子和土壤”学说，该学说认为肿瘤转移的发生和发展，是处于活跃或活化状态的肿瘤细胞作为“种子”，当遇到适合的器官、组织的基质环境，即“土壤”时，就会在此定居、生长即发生肿瘤的转移，从而部分解释了肿瘤原发灶与转移灶之间的关系。但原发部位的肿瘤（种子）是如何到达远处器官或组织（土壤）的这一问题一直困扰着人们。直到1869年，托马斯•阿什沃思（Thomas Ashworth）[2]在1例转移性癌症患者血液中观察到了外周血循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）—从实体瘤中脱离出来并进入血液循环的肿瘤细胞。他推测，这些细胞在癌症转移过程中发挥了非常重要的作用，并可能提供疾病进展的相关信息，CTCs的概念初步形成。据统计，90%以上的肿瘤病人死于肿瘤的转移和复发，实体肿瘤或转移灶的肿瘤细胞在特定条件下，通过上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），从形态上发生向间充质细胞表型的转变并获得迁移的能力。间充质细胞与上皮细胞相邻，只是其结构松散，缺乏细胞连接（cell adhesion）和细胞极性，并且具有转移和侵袭能力。因此，脱落的CTCs得以进入外周血液循环，这是肿瘤发生转移的必要前提。脱离原发灶入血的CTCs至少面临着血流剪应力、失巢凋亡、免疫细胞识别杀伤等三重致命考验，进入循环的大部分肿瘤细胞都会失去活性，只有不足0.01%可到达远端器官，通过迁移、粘附、相互聚集形成微小癌栓，并在适合的微环境条件下，CTCs又发生间质-上皮转化（mesenchymal-epithelial transition，MET），生成新的肿瘤，从而导至肿瘤转移的发生。

从提出CTCs概念近一个多世纪的时间里，由于初期实验条件、技术的限制以及学者对CTCs的认识的局限性，CTCs检测及临床应用进展不大。直至上世纪末尤其是本世纪初，随着分子生物学、计算机技术的发展，免疫标记技术以及分子生物学技术的突飞猛进，CTCs分离及分析鉴定技术得以迅速发展，CTCs检测和临床应用取得了重大进步，为早期发现肿瘤的复发转移、评估手术、放疗、化学等疗效、判断预后、确定肿瘤分子特征、选择合适的个体化治疗等方面提供了重要的实验室依据。目前，学者所共识的循环肿瘤细胞的概念是：自发或受外界因素作用（如诊疗操作等）由原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞。肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是肿瘤转移的最初阶段，并为最终形成肿瘤转移灶提供了可能。进入循环系统的肿瘤细胞大部分在机体免疫识别及杀伤等作用下发生凋亡，有极少数肿瘤细胞在循环系统中存活下来，在一定条件下，进入血液循环而未被清除的肿瘤细胞通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶[3]。本文拟就CTCs分离技术、分析鉴定技术、临床应用、CTCs主要分析仪器作一介绍。

1 循环肿瘤细胞分离富集技术

越来越多的分子生物学和临床研究结果表明，肿瘤转移很可能在肿瘤发生的早期就已经出现，在外周血中检到CTCs是预示肿瘤转移最直接、重要的方法，在肿瘤早期转移的临床诊断、预后判断、监测疗效等方面具有重要意义。CTCs的发现有望改变临床上仍依赖于影

像学检查及传统肿瘤标志物的现状。由于外周血中的CTCs含量极为稀少，一般认为在外周血中大约105~107个单核细胞中才有一个CTCs[4]，因此，对CTCs检测技术的灵敏度和特异性提出了极高的要求。目前各种CTCs的检测系统主要包括CTCs分离和富集系统以及CTCs的检测和鉴定系统。而分离和富集系统对检测外周血的CTCs是非常必要的。理想的CTCs分离与富集及检测技术应能达到以下六点要求：（1）高捕获率或高灵敏度，就是可以将样品中的CTCs尽可能多的分离出来，即至少能够在上亿个血循环细胞中发现一个肿瘤细胞；（2）高特异性，要求检测结果准确无误，尽可能降低假阳性或假阴性，目标是分离出来的细胞只有CTCs，其它细胞的含量很少或没有；（3）要求CTCs不能被污染，收集到的CTCs可以进行表型和基因型分析；（4）高通量，即能在短时间内处理大量样品；（5）重复性，回收率高。（6）尽可能降低成本[5、6]。目前用于临床实验研究的CTCs分离和富集技术非常之多，一般来讲根据其物理性质和基于亲和性与识别的生物性质以及两者综合利用可分成3类。但目前来说仍没有理想的方法，每种单独的方法都有自己的优势和缺点。虽然两种或三种方法的结合有可能成为较为理想的方法，但近十几年的研究进展不大。

1.1 密度梯度离心法（Density Gradient Centrifugation，DGC）

密度梯度离心的原理是基于血液中各种正常细胞与CTCs密度的差别，利用其在密度梯度介质（如Ficoll-Paque介质、OnceQuick系统）中的沉降系数不同，将细胞悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力的作用，用分离液将CTCs与其它细胞层分离。离心后在细胞分离液中各种细胞呈现梯度分布，依次为：血浆成分、单个核细胞（淋巴细胞、单核细胞、肿瘤细胞等）、分离液、中性粒细胞和最下层的红细胞，从而获取目标细胞。有报道用OnceQuick系统分离肿瘤细胞得到了632倍的富集效果，标明该系统对CTCs的平均回收率高、富集效果好，而采用Ficoll-Paque介质只有3.8倍。DGC方法操作简便、成本低，但该分离方法一般要求血量较大，且灵敏度和特异性均较低，且在操作过程中可能会损失CTCs。

1.2 细胞过滤技术（Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells，ISET）

ISET方法的原理是基于细胞大小不同和机械性能的差别。一般认为，肿瘤细胞的直径为15~30μm，大于绝大多数血细胞的直径（如红细胞5~9μm），根据细胞大小所设计的滤过膜滤过血液样本后将直径大的肿瘤细胞分离出来。但由于目前还没有报道证实所有肿瘤细胞直径都大于8μm，使其分离敏感性受到质疑。该方法对技术、设备要求不高，但会丢失一小部分直径小于滤膜孔径的CTCs，导至检测灵敏性降低。

1.3 细胞粘附技术（Cell adhesion techniques，CAT）

细胞粘附分离技术是CTCs捕获的一项基本技术，利用的是亲和反应原理，即利用CTCs与生物生化修饰或物理修饰捕获表面的亲和作用，含有CTCs的样本经过捕获表面时，CTCs 则被吸附在捕获表面，随后冲洗掉未被粘附的非目的细胞，从而得到CTCs。此后发展起的多种纳米及微流控技术都采用了这一基本技术。

1.4 免疫磁珠分离技术（Immunomagnetic separation，IMS）