植物多酚氧化酶、超氧化物歧化酶的测定

植物体内多酚氧化酶活性的测定

一、目的

通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。

二、原理

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下：

多酚氧化酶

邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌＋H2O

三、材料、仪器及试剂

1. 材料：马铃薯块茎等

2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。

3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1 pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol·L－1儿茶酚；

20％三氯乙酸。

四、实验步骤

1. 粗酶液的制备

称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol·L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。

2. 活性酶的测定

在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化（A）值。

五、酶活性的计算

以每min内A525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。

A 酶提取液总量（ml）

酶活力（0.01A·min－1）＝———————×———————————

0.01×反应时间测定时酶液用量（ml）

A 酶提取液总量（ml）

酶的比活性(0.01A·g－1Fw·min)＝—————————×——————————

0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml）

公式中：A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。

植物超氧化物歧化酶活性测量

一、实验目的及要求

（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。

（2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。

二、实验原理

超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2→O2+H2O2. 大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，糖果组合组织或者细胞破碎后，可用Ph7.8的磷酸缓冲液提取。

邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40秒-3分钟这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。

颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。

三、实验材料、仪器设备及试剂

1、实验材料：大蒜

2、仪器：离心机

3、试剂：

(1)磷酸缓冲液（pH7.8, 0.05mol/L）)(PH8.3 Tris-HCl )

（2）浓盐酸

(3)邻苯三酚（50mmol.L-1）：称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。

(5) 考马斯蓝G-250：100mg 考马斯蓝G250溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%(W/V)正磷酸，用蒸馏水稀释至1L，过滤。

（6）牛血清蛋白（1mg/100ml, 即ml=1 l）

四、实验方法

1、材料准备：每组30g大蒜，加入90 ml pH7.8 0.05 mol/L 磷酸缓冲液，匀

浆机匀浆，两层纱布过滤，冷冻离心（5000 rpm，20min）得清液测体积，取少量清液进行SOD活性测量。

2、将上清液置于60℃20min,使杂蛋白变性，然后5000r.min-1冷冻离心20min，取上清液测体积，并进行SOD活性测量。

3、SOD活性测定（邻苯三酚法）

采用改良的邻苯三酚自氧化法。邻苯三酚自氧化速率为325 nm, 0.070D /min左右,以1 mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚的速率达到50%的酶量作为一个酶活力单位(U)。

（1）邻苯三酚自氧化速率的测定

取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔1 min读取A 值,连续读取4 min ,取平均值。通过微调连苯三酚的加入量控制自氧化速率在每分钟0.070±0.002。（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。

（2）SOD样液的活性测定

样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。

（3）计算

4、考马斯蓝G-250测蛋白含量：3ml 考马斯蓝加入适量的样品摇匀，2 min 后在595 nm测吸光值，并用牛血清蛋白（1mg/100ml, 即ml=1 l）制标准曲线。SOD比活力(units/mgPr)=总活力（units）/总蛋白量（mg）

（1）标准曲线制作：

分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-可见分光光度计595nm 处测定吸光值。以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。具体操作见下表。

蛋白质标准曲线测定加样

（2）蛋白样品

配制浓度约100ug/ml的待测蛋白质溶液。取一只试管加入1.0ml蒸馏水做空白，一支加入0.5ml待测蛋白质溶液，补充水到1.0ml。然后每支试管加入5.0ml 考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的ug数量，计算出待测蛋白质的含量。

在标准蛋白质和蛋白质样品的测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平行管。

作业：

总活力U=活力单位×总体积