荧光分光光度法

荧光效率（φf）=
2、分子结构与荧光的关系 A 长的共轭结构 例 激发光 荧光 205nm 278nm 286nm 321nm 0.29 356nm 404nm 0.36
荧光效率 0.11
B 分子的刚性和共平面性
荧光效率：0.2
1.0
C 取代基：给电子基团使荧光效率增大，如 -OH、-OCH3、-NH2等。
表面吸 光物质
F
问题（1）不同强度的光照射物质所产生 的荧光光谱形状是否相同？ （2）不同波长的光照射物质所产生的荧 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度? 单色器
I0
λex
I
表面吸 光物质
λem 单色器
检测器
3、激发光谱：荧光λex不变时，记录荧光 强度F与激发波长之间的关系。
单色器 F荧光的产生
（1）振动弛豫：同一电子能级电子从高的 振动能级到最低的振动能级。
电子能级
原因：分子碰撞 结果：热能，无辐射
振动能级
（2）内部能量的转移
产生原因：受激分子常由高电子能级以无辐射 （热）跃迁方式转移至低电子能级。
电子能级 振动能级
（3）荧光发射 无论分子处于哪一个激发单线态，通过内转换 及振动弛豫，均可返回到第一激发单线态最低 能级，然后以辐射的形式发射光量子而返回到 基态的任一能级。 第二激发态 第一激发态
散射光波长与荧光接近，对荧光强度测定 有干扰，使其读数增大。
荧 光 光 谱
散 射 光 谱
不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长 溶剂 水 248 271 313 350 365 416 405 469 436 511
乙醇
环已烷 四氯化 碳 氯仿
267
267 — —
344
344 320 346
409
仪器结构
I0 λex λem 单色器 检测器
单色器
I
表面吸 光物质
F( I 0 I )
F K (I0 I )
'
I I 010
F K I 0 (1 10
'
abc
abc
) K I o (1 e
'
1 2
2.3abc
)
e
2.3 ECl
(2.3abc) (2.3abc) 1 ] 1! 2!
④ 振动弛 豫
特点： λem（荧光）>λex（激发光） 寿命短 10-9—10-7s
二、激发光谱与荧光光谱 1、荧光的检测 单色器 I0 λex λem 单色器 检测器 I
表面吸 光物质
2. 荧光光谱（发射光谱）：
激发波长λex和强度一定时，测定荧光强度（F） 与荧光波长之间的关系。 单色器 I0 λex λem 单色器 检测器 λ I
三、荧光与分子结构的关系
荧光物质发生荧光的过程：
A 荧光物质对光的吸收 B通过无辐射跃迁，跃迁到第一电子激发态 的最低振动能级。 C 跃迁至基态各振动能级 D 各振动能级分子，通过无辐射跃迁回基 态的最低振动能级。
1、荧光物质的必要条件 A 强吸光结构，共轭π—π* B 高荧光效率。 发射荧光的光子数。 吸收激发光的光子数
（5）体系间的跨越 激发态分子的电子发生自旋反转，而使其 多重性发生变化。激发单线态—激发三线态 发生条件：常需物质中含有重原子如Br、I等
电子能级
振动能级
分子由激发单线态跨越到三线态后，荧光强度减弱甚至 熄灭。
（6）磷光：经过体系间跨越的分子降至三线 态最低能级，跃迁至基态而发生的光。 过程： 吸光—单线态—弛豫—跨越—弛豫—基态—磷光
HPLC 荧光分光光度计检测器
TLC
365nm、254nm激发波长
2、利用荧光淬灭 TLC
硅胶GF254
3、制备荧光衍生物
A B AB
无荧光 有荧光 淫羊藿苷+SLS 荧光检测
十二烷基磺酸钠
吸电子基团使荧光效率减少，如-COOH、NO2、-X。
中性基团对荧光效率影响不大。如-R、 NH3+等。
四、影响荧光的外界因素
1、溶剂
A 溶剂的极性：极性越大， λem增大，荧光效率 也增强。通常选择极性溶剂。 B 粘度：粘度系数越大，有利于荧光效率的提 高。
2、温度 温度越高，碰撞机率大，效率减少。热淬灭
(2.3abc) F K ' I o [2.3abc ] 2!
2
当abc<0.05时，可得
F 2.3K ' I 0 abc
低浓度时，荧光强度与浓度成线性关系。 当abc>0.05时，荧光强度不与浓度成线性关系
定量基础：F∞C
定量分析方法：
标准曲线法 比例法（单点校正法）
408 375 410
459
458 418 461
500
499 450 502
？
如何提高检测精度
温度、溶剂（水）、合适的酸碱度、浓度、 改善散射光因素影响：溶液透明，选择合适
测定波长。
§3 定性、定量分析 一、荧光定性：依据激发光谱和荧光光谱。
二、定量
Io 溶液的荧光
I
F
一般在与激发光源垂直的方向观察荧光
③TLC定性、定量
§2 原理
一、分子荧光产生 1、分子的电子能级：
C C C C
ψ4
π*
π* π
ψ3 ψ2 ψ1
π
三线态与单线态比较： UV 基态单线态
① 单线态
②三线态
激发态 E2<E1 ，ε2<ε1， ② 的寿命可达1秒，而①的 寿命为10-8，跃迁几率①是②的106倍。
振动能级：物质分子中存在一系列电子能级， 而每个电子能级中又包含一系列的振动和转 动能级。
V0
V3 V2 V1
c 内部能量转换
d 荧光 e 体系间跨越 f 磷光 (e)
V4 V3 V2 V1 V0
V4 V3V V1 2 V0
T1*
V4
S0 (a) (d)
V3 V2 V1
(f)
V0
（7）荧光的产生 ① 吸收光 基态—激发态 ② 振动弛豫，使电子回到第一电子激发 态最低振动能级 ③ 回到基态不同的振动能级
I λem 单色器 检测器
表面吸 光物质
λ
特征： （1）位移：λem>λex
stokes 位移：说明在激发和发射之间存在一 定的能量损失。 产生原因：振动驰豫、内转换 第二激发态 第一激发态
电子能级 振动能级
（2）荧光光谱的形状与激发波长无关 （3）荧光光谱与激发光谱相似
（4）荧光强度与激发光波长有关
3、 pH值：酸度改变了弱酸弱碱的结构，从而 使其荧光效率受到影响。
+ NH 3
OHH+
NH 2
OHH+
NH
_
pH 2
pH 7 ~ 12
pH 13
4、荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质为荧 光熄灭剂。 荧光熄灭：是指荧光物质分子与溶剂分子或溶 质分子相互作用，引起荧光强度降低的现象。
引起荧光熄灭的形式： 碰撞熄灭：由于碰撞而损失能量
电子能级 振动能级
特点：荧光的能量小于激发光能量。
荧光发射所需时间为10-9~10-7s。
（4）外部能量的转移 激发态分子与溶剂分子及其它溶质分子之间相 互碰撞而失去能量，常以热能的形式放出。
Q M Q M
*
*
这种不同物质间的能量转移现象，叫荧光 淬灭（熄灭）。M叫荧光淬灭剂。 外部能量转换可降低荧光强度。
化学淬灭：荧光物与加入的物质发生反应， 生成新的化合物。 体系间跨越：单线态变成三线态。 自熄灭现象：当荧光物质的浓度升高而产生。
荧光熄灭法：利用荧光强度的减小与荧光熄灭 剂的浓度呈线性关系来进行测定含量的方法。 F
C
5、散射光的影响 引起光的散射原因有：比色皿表面，溶液 内微粒，溶液内气泡。
散射类别：a 瑞利散射 b拉曼散射
仪器
单色器 I0 λex λem 单色器 检测器 I
表面吸 光物质
结构：
激发 光源 单色器 样品池 单色器 检测器
表面吸光物质
光源：氙灯、激光
氙灯：发射的谱线强度大，连续光谱，波长范 围为250-700nm，且在300-400nm强度几乎相 等。 激光：单色性极好，强度大。
§4 应用（在中药） 1、自身发射荧光：先分离—检测
第4章
荧光分析法
§1 概述
hν+
1、光致发光：
吸收
发射 热、光
激发态电子回到低能级而伴随光的辐射
分类：
磷光 紫外线荧光 分子荧光 荧光 原子荧光 X-射线荧光 红外光荧光
激发光 源为紫 外光
2、荧光分光光度法：利用物质的荧光光谱 进行行定性定量分析方法 。 F（强度）、λ 荧光分光光度计：用来测量荧光强度的仪器。 3、特点：灵敏度更高 10-10-10-12g/ml，应用 不如UV广泛。 4、应用：①直接荧光光度法 ②作为HPLC的检测器（用的多）
电子能级 振动能级
特点：（1）λ（磷光）>λ（荧光）
（2）寿命10-4—10s
（3）室温下溶液很少呈现磷光
处于激发态的分子回基态的途径： ①发射荧光 ②发射磷光 ③内部能量转换 ④ 外部能量转换 其中以速度最快，激发态寿命最短的途径占 优势。
a 吸收 b 振动弛豫
V4
S2
*
（b） (c) S1* （b）