谷氨酸发酵 实验报告材料(1)

兰州大学

生命科学学院发酵工程实验

谷氨酸发酵实验

摘要：谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，为发酵实验准备菌种。还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，所以在发酵过程中，要求每两个小时测定一次还原糖的含量，并据此作出发酵的糖耗曲线。

关键字：种子的制备、发酵罐、谷氨酸棒杆菌、PH的调节

引言：

了解发酵工业菌种制备工艺和质量控制，为发酵实验准备菌种。

了解发酵罐罐体构造和管道系统，掌握对发酵罐及其管道系统的灭菌方法。

了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全过程。

还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，在发酵后期当还原糖降至1％以下时，表明谷氨酸发酵已经完成。所以在发酵过程中，要定时测定还原糖的含量，要求每两个小时测定一次，并据此作出发酵的糖耗曲线。掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。

学习使用茚三酮比色法检测发酵液中谷氨酸浓度的方法。谷氨酸棒杆菌通常在0-12小时为生长期，12小时后为产酸期，所以应该从12小时以后开始检测谷氨酸的含量，每两个小时取一次样。

原理:

谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，得到大量健壮的种子。谷氨酸棒杆菌生长速度较快，接种量一般在1-2%。

谷氨酸发酵是有氧发酵，发酵罐由蒸汽管道、空气管道、加料出料管道等组成，在实验之前必须先对发酵罐进行空消。

谷氨酸产生菌是代谢异常化的菌种，对环境因素的变化很敏感，在适宜的培养条件下，谷氨酸产生菌能够将50％以上的糖转化成谷氨酸，而只有极少量的副产物。如果培养条件不适宜，则几乎不产生谷氨酸，仅得到大量的菌体或者由发酵产生的乳酸、琥珀酸、а－酮戊二酸、丙氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺等产物。生产上的中间分析只测定一些主要数据，只能显示微生物代谢的一般概况而不能反映细微的生化变化。因此，进一步完善生化分析项目，从生化角度对发酵进行控制，从而确定最适宜的工艺条件是提高发酵水平的重要课题之一。

在NaOH存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

L-氨基酸与茚三酮在加热下可发生特有的氨基酸显色反应，产物显示其特有的蓝紫色。不同谷氨酸与茚三酮反应得到的显色产物的最大吸收波长不同，即λ不同；加之显色深浅不同,反应出相应氨基酸的不同含量。以此为依据，可为ma x

谷氨酸定性及定量。在pH 5～6 范围内氨基酸的显色反应最灵敏。

器材与试剂：

试管、三角瓶、高压灭菌锅、摇床、培养箱、显微镜、蒸汽发生器、生物发酵系统、空气压缩机、分光光度计，水浴锅，电炉，18mm×180mm试管。

3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：6.3g DNS和262ml 2M NaOH加到500ml 含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容至1000ml，贮于棕色瓶中。

葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖40mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为0.4mg/ml。

标准样品的制备：谷氨酸纯品稀释溶液：3mg/ml溶液，调节pH5. 5～6。

茚三酮试剂的制备：称取0. 5 g 茚三酮溶于100 mL丙酮中，避光。

pH 调节试剂的制备：① 2 mol/ L NaOH溶液：称取8 g NaOH 溶于100 mL 蒸馏水中；② 1 mol/ L HCl 溶液：量取36 mL 盐酸溶于64 mL蒸馏水中。

步骤:

斜面种子的制备（教师制备）

一级种子培养

一级种的培养目的在于制备大量高活性的菌体，培养基配方如下：葡萄糖2.5％；尿素0.5％；硫酸镁0.04％；磷酸氢二钾0.1％；玉米浆3%；硫酸亚铁2ppm；硫酸锰2ppm。

1000mL三角瓶中装250mL培养基，每组3瓶，0.1MPa灭菌30分钟，冷却后接种，接种量为一支斜面接一瓶。30～32℃摇床培养12小时，如用旋转式摇床，转速为170～190转/分；往复摇床，冲程7.6cm，频率为97次/分。

一级种子质量标准：

种龄：12小时；pH：6.4+0.1；ΔOD（560nm光密度净增值）>0.5

RG（残糖）0.5％以下。

二级种子培养

二级种子的培养目的是制备和发酵罐体积及培养条件相称的高活性菌体。1000ml 三角瓶装300ml培养基，每组3瓶，0.1Mpa灭菌10分钟，冷却后接种，摇床培养7～8小时。

培养基配方：葡萄糖 2.5％；尿素0.34％；磷酸氢二钾0.16％；糖蜜

1.16％；硫酸镁0.043％；消泡剂0.01%；pH 7.0

二级菌种质量标准：种龄7～8小时；pH7.2 ；ΔOD560>0.5；无菌检查阴性；噬菌体检查阴性。

学习发酵罐的构造并进行消毒

1．准备阶段

配料：按工艺要求配制发酵培养基，10升发酵罐定容6升，实际配料时，定容到4升，另40％体积为蒸汽冷凝水和种子液预留。

尿素配成40％浓度，装在1000mL瓶中，每一瓶装800mL。分消备用。

消泡剂配成1%浓度，分消备用。

培养基：葡萄糖13％；硫酸镁0.06％；磷酸氢二钾0.1%；糖蜜0.3％；硫酸锰、FeSO4各2ppm；氢氧化钾0.04％；玉米粉0.125％；消泡剂0.5%。

调整pH为7.0。

2.空气过滤器及空气管路的消毒

（1）关闭空气阀F11（蓝）；打开F12，F2（冷凝水），慢慢打开蒸汽阀阀门F3（红）排尽冷凝水后，F12调为微开。蒸汽出口压力应在0.12—0.14MPa之间（空气过滤器压力表显示值）。压力过低，灭菌不彻底；压力过高，仪器会损坏。

（2）微开F13（空气/蒸汽入罐的阀门，蓝），打开F14（发酵罐出气口阀门），使蒸汽经过