分子细胞遗传学技术(精)
细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）
细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）外周⾎培养及染⾊体的识别 (2)⽩⾎病⾻髓及外周⾎染⾊体 (7)外周⾎细胞脆性位点检测技术 (9)⼈⽺⽔细胞培养收获操作程序 (11)绒⽑细胞培养和染⾊体分析 (13)⾼分辨染⾊体操作⽅法和识别 (15)GII式显带法 (21)N式显带法 (21)R(反式)显带法 (23)姐妹染⾊单体互换（SCE）技术 (23)荧光原位杂交操作程序 (25)附:细胞遗传学实验试剂配制标准操作规程（SOP） (27)天平称量操作规程 (27)药匙处理操作规程 (27)PBS配制规程 (28)胰酶配制规程 (28)培养基配制规程 (29)1N HCL配制规程 (29)1N N A OH配制规程 (29)外周⾎培养及染⾊体的识别1. 原理：外周⾎中的淋巴细胞⼏乎都是处在G0期或G1期，⼀般情况下是不分裂的。
当在培养基中加⼊植物⾎凝素（Phytohaemagglutinin PHA）时，这种⼩淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进⾏有丝分裂。
经过短期培养后，⽤秋⽔仙素处理就可获得⼤量中期分裂相的细胞，制⽚后可以清楚地对染⾊体进⾏观察与分析。
2. 外周⾎培养与收获操作步骤：2.1 采⾎：⽤20:1肝素（0.4%）温润⽆菌注射器抽取外周⾎5ml（注意：消毒时需脱碘）。
2.2. 种⾎：将注射器搓捏，使⾎样混匀，在⽆菌条件下，⽤7号针头垂直种⾎0.3ml±抗凝⾎（成年男⼦28滴，成年⼥⼦30滴左右，⼉童32滴）⾄外周⾎培养基内。
2.3. 培养：将培养瓶放⼊37℃恒温箱中培养68-72⼩时，注意第⼆观察培养液有⽆凝⾎、溶⾎或长菌的现象，可每天培养液摇⼀摇，以便细胞可获得充分的营养，但⼀般情况下可不摇。
2.4. 制⽚过程：2.4.1. 加秋⽔仙素：在培养完成前2-3⼩时，加⼊浓度为20ug/ml的秋⽔仙素2-3滴（7号针头竖滴）后，继续培养2-3⼩时。
细胞遗传学及分子生物学检查_概述及解释说明
细胞遗传学及分子生物学检查概述及解释说明1. 引言1.1 概述细胞遗传学和分子生物学检查是生物医学领域中两个重要的研究方向。
细胞遗传学研究的是细胞在遗传层面的结构、功能和变异等方面，而分子生物学检查则聚焦于分子水平的检测与分析。
这两个领域相辅相成，共同推动了现代医学的发展。
1.2 文章结构本文将首先对细胞遗传学进行概述，包括定义、重要性以及常用的研究方法。
接着，对分子生物学检查进行介绍，包括它的定义、应用领域以及常用技术和方法。
随后，我们将探讨细胞遗传学与分子生物学检查之间的关系，并通过一些实际案例展示它们在疾病诊断中的应用价值。
最后，在总结文章内容并强调它们的重要性和未来发展前景时，我们还将探讨可能面临的挑战。
1.3 目的本文旨在为读者提供一个全面而清晰的概述，使他们对细胞遗传学和分子生物学检查有更深入的理解。
我们将强调这两个领域在现代医学中的重要性，并展望其未来发展方向。
同时，希望通过具体案例的描述，让读者认识到细胞遗传学和分子生物学检查在疾病诊断和治疗中的巨大潜力。
通过阅读本文，读者将能够更好地了解细胞遗传学和分子生物学检查在现代医学领域中的应用及其价值。
2. 细胞遗传学概述：2.1 细胞遗传学定义：细胞遗传学是研究细胞内基因的遗传性质和变异以及这些遗传变异如何影响生物体特征和功能的科学领域。
它涉及到细胞的染色体结构、基因组组织与表达、遗传变异的发生机制等方面的研究。
2.2 细胞遗传学的重要性：细胞遗传学对于了解生物体的形态、功能和疾病机制具有重要意义。
通过对细胞内基因组和遗传变异的研究，我们能够揭示生物个体间的遗传关系，推断某些特征或疾病发生发展的机制，并为相关治疗提供依据。
2.3 细胞遗传学的研究方法：细胞遗传学采用多种实验方法来揭示细胞内基因与表型之间的关联。
常见的实验方法包括：染色体分析、DNA测序技术、PCR技术、原位杂交等。
染色体分析主要观察染色体结构和数量异常，帮助判断染色体异常与疾病之间的关系。
细胞和分子细胞遗传学技术
细胞和分子细胞遗传学技术发表时间：2012-08-10T08:14:01.827Z 来源：《中外健康文摘》2012年第19期供稿作者：张亚丽[导读] 经典的细胞遗传学技术是指通过制备染色体标本，分析染色体数目和结构改变与人类疾病之间的关系。
张亚丽（黑龙江省森工总医院 150040）【中图分类号】R394.2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）19-0151-02经典的细胞遗传学技术是指通过制备染色体标本，分析染色体数目和结构改变与人类疾病之间的关系。
近代分子生物学技术与细胞遗传学技术相结合，形成了细胞和分子遗传学技术。
其中比较成熟、具有实用价值的技术是：①荧光原位杂交；②比较基因组杂交。
1 人外周血淋巴细胞染色体检测技术人外周血淋巴细胞染色体检测属于经典的细胞遗传学技术。
用作染色体分析的标本包括外周血、脐带血、羊水、胎盘绒毛组织和肿瘤组织等。
外周血是应用最多的材料。
其他组织样本染色体制备方法与制备人外周血淋巴细胞的方法基本类同，只是标本的处理和培养条件有所调整。
1.1 基本原理体外培养的外周血淋巴细胞，在植物凝集素(PHA)的刺激下转化成为能进行有丝分裂的淋巴母细胞；在秋水仙素(纺锤体抑制剂)作用下，淋巴母细胞有丝分裂停滞，从而获得处于有丝分裂中期的淋巴细胞染色体标本。
1.2 基本操作程序(1)取血3ml(空针用0.1～0.2ml肝素抗凝)。
(2)用7号针头向每瓶培养液(内装有5ml培养液)接种血液标本15～16滴，摇匀后，静置于37℃的隔水式恒温培养箱中培养72h。
(3)终止培养前3h，用7号针头向培养瓶中加入秋水仙素3滴(浓度为20μg/ml)并混匀。
(4)按以下程序制片。
①收集细胞：由培养瓶中吸取培养物10ml置于离心管中，离,l～,10min(1 500～2 000r/min)离心后，弃上清液，留下沉淀物。
②低渗处理沉淀物：向沉淀物中加入已预温(37℃)的KCI(0.075mol/L)8ml，充分吹打，以使细胞分散，并将离心管置于37℃水浴中20～30min。
细胞遗传学复习资料
绪论一、细胞遗传学（Cytogenetics）：是研究细胞中染色体遗传规律的学科，由细胞学与遗传学相结合产生的，是遗传学的一门分支。
在细胞水平上研究生物的遗传变异，着重研究细胞中染色体的起源、组成、变化、行为和传递等机制及其生物学效应。
二、细胞遗传学的研究对象：主要是真核生物，特别是包括人类在内的高等动植物的染色体。
具体来说，是染色体的变化引起的遗传性状的变化。
遗传学和细胞学结合建立了细胞遗传学，主要是从细胞学的角度，特别是从染色体的结构和功能，以及染色体和其他细胞器的关系来研究遗传现象，阐明遗传和变异的机制。
三、细胞遗传学的研究内容：1、研究细胞中染色体的数目及其变化。
2、研究细胞中染色体的结构。
如：亚结构-超微结构-DNA结构。
3、染色体工程研究：植物中常用：如小麦六倍体、八倍体、单体、缺体等种质资源。
在高等动物（家畜）中研究很少。
在水产动物中较多。
同源六倍体：甘薯。
异源六倍体：普通小麦、燕麦、猕猴桃。
小麦是六倍体的原因：小麦系由山羊草属、广义的冰草属和小麦属3个属的种类杂交形成的，染色体组为AABBDD，是2n=42的异源六倍体植物。
异源八倍体小黑麦：普通小麦是异源六倍体（AABBDD），其配子中有三个染色体组（ABD），共21条染色体；二倍体黑麦（RR），配子中有一个染色体组（R），7条染色体。
普通小麦与黑麦杂交后，子代含四个染色体组（ABDR），由于是异源的，联会紊乱，是高度不育的。
若子代染色体加倍为异源八倍体（AABBDDRR），就能形成正常的雌雄配子，具有可育性了。
四川省农业科学研究所鲍文奎发明的。
4、通过染色体多态性研究动物进化：牛Y染色体多态性；Ag-NOR多态性用于研究亚洲猪与欧洲猪的起源进化。
5、研究染色体的进化规律：如着丝粒如何进化；常染色体、X、Y染色体之间如何进化。
6、染色体的基因定位研究：FI SH（荧光原位杂交）、转染色体片段、转基因等。
四、细胞遗传学的分科：从细胞遗传学衍生的分支学科主要有：1、体细胞遗传学—主要研究体细胞，特别是离体培养的高等生物体细胞的遗传规律。
细胞遗传学
细胞遗传学
二 细胞遗传学的基础理论
3染色体的基础知识 （5） 正常及异常核型描述
46, XY 46, XXX 46, XX 47, XYY 45, X 45, XX, 1647, XXY 45, XX, E-
46, XX, t(9;22)(q34;q11) 46, XX, t(9;22)(9pter 9q34::22q11 22qter ; 22pter 22q11::9q34 9qter)
细胞遗传学
三．细胞遗传学检验技术
1 2 3 4 5 6 7 外周血淋巴细胞培养及染色体分析 骨髓细胞培养及染色体分析 羊水培养及染色体分析 早孕绒毛及羊水的性染色质检验 胸腹水及实体瘤细胞的染色体分析 荧光原位杂交 (FISH) 技术 X、Y小体检验技术
细胞遗传学
染色体标本制作的基本程序
阴道、 阴道、口腔上皮细胞细胞 X、Y小体分析 外周血 骨髓 胸,腹水 性腺活检标本 早孕绒毛 实体瘤 羊水 皮肤,肝,肾标本 皮肤, 体外悬浮培养 不经培养 秋水仙素处理 、 体 带 分 析 带 分 析 带 分 析 带 分 析 单 姐 体 妹 互 染 换 色 实 验 染 迟 色 复 体 制 技 术 X 检 染 测 色 技 体 术 脆 性 部 位 体 技 术 高 分 辨 染 色 杂 交 技 术 荧 光 原 位 体外贴壁培养
46, XY, inv(1)(p32q12)pat 46, XY, inv(1)(pter p32::q12 p32::q12 qter)pat
46, XX, - 4, -12，+der(4) t(4 ;12)(q35:q12),+i(12p) 46, XX, - 4, -12, +der(4)t(4:12)(4pter 4q35::12q12 (12pter 12ter), +i(12p) cen 12qter)
最新FISH-知识培训
FISH实验的基本试剂：
1.荧光探针； 2.甲酰胺； 3.氯化钠； 4.柠檬酸钠； 5.氢氧化钠； 6.吐温20。
FISH实验的基本材料和设备： 1. 暗房； 2. 荧光显微镜（带成像系统）； 3. 恒温水浴锅； 4. 培养箱； 5. 染色缸； 6. 载玻片； 7. 移液器； 8. 暗盒。
实验方法及步骤
1）样品前处理 2）探针变性 3）标本变性 4）杂交 5）洗脱 6）封片 7）荧光显微镜观察
• 探针变性 • 标本变性
变性
70%甲酰
胺 73ºC
5min
DAPI复染
杂交
42ºC 湿盒
孵育过夜
洗涤
• 50%甲酰胺
• 2XSSC
• 0.1%NP40
• 70%乙醇
FISH技术在乳腺癌检测中的应用
FISH-知识培训
荧光原位杂交
（Fluorescence in situ hybridization ,FISH）
FISH是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20 世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础 上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。靶DNA与 标记有荧光基团的探针同源互补，经变性--复性，形 成杂交体，洗脱未结合的探针，在荧光显微镜下对杂 交信号的大小、数目和分布等进行分析。
至100个,或重做FISH实验来判断最终结果。
HER-2/CSP 17 >2.2（阳性结果）
HER-2/CSP 17 <1.8（阴性结果）
HER-2/CSP 17 >2.2（阳性结果）
HER-2/CSP 17 <1.8（阴性结果）
FISH技术在前列腺癌诊断中的应用
遗传学(全套课件752P)ppt课件
遗传学(全套课件752P)ppt课件目录•遗传学基本概念与原理•基因突变与修复•基因重组与染色体变异•遗传规律与遗传图谱分析•分子遗传学技术与应用•细胞遗传学技术与应用CONTENTSCHAPTER01遗传学基本概念与原理遗传学定义及研究领域遗传学定义研究生物遗传信息传递、表达和调控的科学。
研究领域包括基因结构、功能、表达调控，基因突变、重组、进化，以及遗传与发育、免疫、疾病等方面的关系。
遗传物质基础：DNA与RNADNA脱氧核糖核酸，是生物体主要的遗传物质，由碱基、磷酸和脱氧核糖组成。
RNA核糖核酸，在蛋白质合成过程中起重要作用，由碱基、磷酸和核糖组成。
遗传信息传递过程DNA复制在细胞分裂间期进行，以亲代DNA为模板合成子代DNA的过程。
转录以DNA为模板合成RNA的过程，发生在细胞核或细胞质中。
翻译以mRNA为模板合成蛋白质的过程，发生在细胞质中的核糖体上。
基因表达调控机制基因表达基因携带的遗传信息通过转录、翻译等过程转变为具有生物活性的蛋白质分子的过程。
调控机制包括转录水平调控（如转录因子、启动子等）、转录后水平调控（如RNA剪接、修饰等）和翻译水平调控（如蛋白质磷酸化、去磷酸化等）。
这些调控机制使得生物体能够适应不同的环境条件并维持正常的生理功能。
CHAPTER02基因突变与修复点突变包括碱基替换、插入和缺失。
染色体畸变包括染色体结构变异和数目变异。
03生物因素如某些病毒和细菌。
01物理因素如紫外线、X 射线等。
02化学因素如亚硝酸、碱基类似物等。
直接修复切除修复重组修复SOS 修复DNA 损伤修复机制01020304针对某些特定类型的DNA 损伤，通过特定的酶直接进行修复。
通过核酸内切酶将损伤部位切除，再利用DNA 聚合酶和连接酶进行修复。
在复制过程中，当遇到无法直接修复的DNA 损伤时，可通过重组机制进行修复。
当DNA 受到严重损伤时，细胞会启动SOS 修复机制，通过易错复制方式快速完成复制过程。
分子细胞遗传学技术课件
分子细胞遗传学是研究细胞内遗传信息传递和控制的科学，广泛应用于生物 学、医学和农业等领域。了解这些技术的原理和实验步骤对于我们理解生命 过程和开展研究具有重要意义。
背景介绍
分子细胞遗传学的定义
研究细胞内基因及其表达调 控的科学。
分子细胞遗传学的应用 领域
广泛应用于生物学、医学和 农业等领域。
分子细胞遗传学的重要 性
帮助我们理解细胞功能和疾 病发生机制。
技术原理
DNA测序技术
通过测定DNA序列，揭示基因 组的结构和功能。
基因编辑技术
利用工具酶对基因进行修改， 实现精准的基因组编辑。
基因表达分析技术
研究基因在细胞内的表达模式 和水平。
实验方法与步骤
1
DNA提取方法
从细胞或组织中提取纯净的DNA样本。
基因编辑实验步骤
2
选择合适的编辑技术和工具，进行基因
组编辑。Biblioteka 3基因表达分析实验步骤
收集细胞或组织样本，提取RNA，进行 表达分析。
案例研究
基因编辑的实际应用
针对某种疾病的基因进行编辑， 开发治疗方法。
基因表达分析案例
研究特定细胞中某个基因的表达 模式和调控机制。
基因组研究案例
通过测序和分析基因组，揭示基 因功能和遗传变异。
未来发展和挑战
分子细胞遗传学技术在不断发展，将为我们揭示更多细胞和基因的奥秘。然 而，技术的应用也面临着伦理和安全等方面的挑战。
FISH-知识培训
• 探针变性 • 标本变性 变性
70%甲酰 胺 73º C 5min
杂交
42º 湿盒 C
孵育过夜
பைடு நூலகம்
• 50%甲酰胺 DAPI复染 洗涤 • 2XSSC
• 0.1%NP-40
• 70%乙醇
FISH技术在乳腺癌检测中的应用
2）Ratio＞2.2为阳性结果，提示样本中Her-2基因 发生扩增；
3）Ratio在1.8-2.2之间时，可以选择增加计数细
胞至100个,或重做FISH实验来判断最终结果。
HER-2/CSP 17 >2.2（阳性结果）
HER-2/CSP 17 <1.8（阴性结果）
HER-2/CSP 17 >2.2（阳性结果）
与其它常用技术比较：
1. FISH敏感性虽略低于PCR法，但其假阳性或假阴 性率却大大低于PCR法，特异性更好。 2. 与免疫组织化学法（IHC）相比，FISH具有良好的 稳定性和可重复性，检测信号更强。
FISH的优点： 1. 安全、快速 2. 灵敏度及特异性高 3. 探针能长期保存 4. 杂交信号强且能同时显示多种颜色 5. 信号数目可量化，为数字化病理诊断打下 基础
与荧光PCR的异同：
1. 都有探针，但FISH是杂交探针，荧光PCR是 Taqman 探针。 2. 都是检测核酸，但FISH保持了细胞的完整，荧光 PCR裂解细胞后再提取总DNA。 3. FISH直观判断单位细胞内信号数的多少；荧光 PCR通过机器扩增后判断拷贝数的多少。 4. 都通过荧光检测，FISH是荧光显微镜，荧光PCR是 荧光PCR仪。 5. FISH的检测标本为石蜡切片，荧光PCR为血清、组 织或细胞。
分子细胞遗传学诊断技术简介
分子细胞遗传学诊断技术简介分子细胞遗传学诊断技术是一种用于分析人类遗传物质的方法，可用于诊断遗传疾病、基因突变和遗传性疾病的潜在风险。
该技术可以确定某些疾病所特有的基因突变，在生殖前探测到胚胎患病的风险，帮助家庭进行疾病预防和治疗。
原理分子细胞遗传学诊断技术采用一系列实验室技术，例如聚合酶链反应（PCR）、基因测序和基因芯片。
这些技术均可用于寻找DNA序列、检测基因突变或扩增DNA分子，进而确定个体是否患有特定遗传性疾病。
在PCR过程中，DNA的双链结构会被分解成单链形式，加入引物后，便会被聚合酶复制成为任意长度的片段。
这个过程可以是扩繁出的对基因序列进行测序，或者是检测基因缺陷。
另外，芯片技术可以在单片的微型芯片上同时测出数千个基因的存在情况。
这些技术与其他分子生物学技术相结合，能够在细胞水平上检测遗传性疾病和基因突变。
应用分子细胞遗传学诊断技术广泛应用于分析人类的遗传疾病、基因突变和遗传性疾病。
医生常用该技术寻找导致疾病的基因突变，并筛查携带这种基因突变的个体，便于疾病的早期诊断、预防和治疗。
基因诊断技术还可以用于生殖前诊断，即在妊娠早期对胎儿进行遗传学检测，以确定胎儿是否患有遗传性疾病，从而选择是否终止妊娠。
此外，该技术还可以用于细胞治疗、肿瘤治疗和产前诊断。
优缺点分子细胞遗传学诊断技术有许多优点，例如它具有高敏感性、高特异性、快速、准确和可重复。
相比传统的遗传学检测技术，该技术对样本要求较低，可以使用体细胞、血液、唾液、尿液等多种样本进行检测，不会受孕前诊断次数的限制，从而大大提高了疾病诊断的效率和准确性。
然而，分子细胞遗传学诊断技术也存在着一些不足之处。
其主要缺点是成本较高、操作要求精密、对实验室设备和技术要求高等。
分子细胞遗传学诊断技术是一种在现代医学和生命科学领域得到广泛应用的技术，可以有效帮助人们诊断和预防遗传性疾病，预测基因突变及风险，为生命科学、医学和治疗提供了强有力的支持。
分子细胞遗传学诊断技术简介
技术优势
➢ 重复性好、稳定；
➢ 高灵敏性及特异性；
➢ 可用于间期细胞，不需要细胞培养；
目前，FISH已成为一种常见检测手段，国外广泛地用 于产前、产后遗传病诊断及血液肿瘤、实体瘤等方面的
检测。在欧美发达国家应用FISH产前诊断检测染色体 异常占30-40%。
技术原理与方法
产前诊断检测非整倍体需要21、13、 18、X和Y染色体上的五种探针。其中21 号和13号染色体检测探针列为一组，为 位点特异探针，分别用Rhodamine (红 色和FITC (绿色)标记。18号、X和Y染色 体探针列为一组，为染色体着丝粒特异性 重复序列探针,分别用DEAC(蓝色) FITC (绿色)和Rhodamine (红色)标记。
➢ 试剂及设备成本高。
aCGH快速检测间期细胞全基 因组拷贝数
Байду номын сангаас
21世纪细胞遗传学的革命 – aCGH
简称：aCGH
英文名：array-comparative genomic hybridization； Microarray based Comparative Genomic Hybridization ）
SpectralWare® software provides a visual representation of the data generated from the microarray
Targeted aCGH
对已知病症提供清晰的信号
避免实验室反复用FISH 方法来 进行实验诊断
结果易懂 将错失不覆盖区域的基因缺失
因。 生育过先天性心脏病患儿父母进行检测，
可以预测下一胎儿患先心病的可能性。
光谱核型分析技术检测染色体异常
分子和细胞遗传学的新技术和方法发展
分子和细胞遗传学的新技术和方法发展近年来，随着科学技术的飞速发展，分子和细胞遗传学的研究也取得了巨大的进展。
在这个领域中，许多新的技术和方法被开发出来，这些技术和方法使得我们能够更深入地了解细胞和分子的运作机制，也为生命科学的发展带来了新的契机和可能性。
一、基因编辑技术基因编辑技术是分子和细胞遗传学领域的一项重要技术，它可以精确地修改生物体的基因组。
其中，CRISPR-Cas9技术是最常用的一种基因编辑技术，它可以在特定的DNA序列上切割出任意基因，并帮助科学家对其进行修饰、删除或添加。
这项技术已经广泛应用于生物学、医学、农业和环境保护等领域。
二、单细胞测序单细胞测序技术是近年来兴起的一项新技术，它可以对单个细胞的基因组、转录组和代谢组进行研究。
这项技术有助于科学家深入了解细胞的不同类型和功能，以及不同细胞之间的互动和沟通机制。
此外，单细胞测序技术也可以用于研究肿瘤细胞的特征和变异，有助于开发更为个体化的肿瘤治疗方案。
三、基因组学基因组学是研究生物基因组的一门学科。
近年来，随着高通量测序技术的发展，科学家们可以更加快速、精确地对基因组进行测序和分析。
这项技术可以帮助我们了解不同物种之间的基因组差异，以及不同群体和个体之间的遗传变异。
此外，基因组学也可以用于发现新的基因和基因型，以及开发基于分子和细胞机制的新型疗法和药物。
四、蛋白质组学蛋白质组学是研究蛋白质表达和功能的一门学科。
随着蛋白质芯片技术、质谱分析技术等的出现，科学家们可以更加深入地了解蛋白质的表达、结构和功能。
这项技术有助于发现新的蛋白质、鉴定蛋白质结构、了解蛋白质的相互作用和信号传递机制，同时也可以用于开发新型的诊断工具和药物。
五、表观遗传学表观遗传学是研究基因组中表型差异的一门学科，它主要关注基因组中非编码性DNA序列的功能。
近年来，随着染色质免疫沉淀、荧光内在性细胞成像等新技术的出现，科学家们可以更加深入地了解表观遗传组的组成和调控机制。
细胞遗传学——精选推荐
细胞遗传学染⾊体原位杂交技术在植物研究中的应⽤摘要：染⾊体原位杂交(chromosome in situ hybridization,CISH)是⼀种新兴的⽇趋完善的技术。
本⽂从以下⼏个⽅⾯对其在植物研究中的应⽤进⾏了综述：（1）外源染⾊质及远缘杂种的鉴定；（2）多倍体起源、⾮整倍体的鉴定；（3）植物基因⼯程及基因表达研究；（4）物种进化及亲缘关系的探讨；（5）植物基因物理图谱的构建等。
关键词：染⾊体原位杂交；植物；细胞遗传学Abstract: In situ hybridization (chromosome in situ hybridization, CISH) is an emerging maturing technology. Its application in plant research are reviewed as follows: (1) exogenous chromatin and Identification of distant hybrids; (2) polyploid origin, identification of aneuploidy;(3) plant genetic engineering and gene expression studies; (4) the evolution of species and of kinship; (5)physical map construction of plant genes.Keywords: in situ hybridization; plants; cytogenetic引⾔原位杂交技术最早是由Gall和Parue[1]利⽤标记的rDNA探针与⾮洲⽖蟾细胞核杂交建⽴起来的。
该技术是从Southern和Northern杂交技术衍⽣⽽来的，其中染⾊体原位杂交在原位杂交技术中应⽤最为⼴泛。
染⾊体原位杂交技术是根据核酸分⼦碱基互补配对原则，利⽤标记的DNA或寡核苷酸等探针同染⾊体上的DNA进⾏杂交，从⽽对染⾊体的待测核酸进⾏定位、定性或相对定量分析。
FISH原理
实验原理荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500 bp的片段。
而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。
直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
实验用具及材料相关溶液的配制1）20×SSC：175.3g NaCl，88.2g柠檬酸钠，加水至1000mL（用10mol/L N aOH调pH 至7.0）。
分子遗传学
第一章基因的概念及发展一名词解释组成型突变constitutive mutation：与酶的合成有关的调节基因的一种突变。
即原来酶的合成量受调节基因调节的诱导酶或阻遏酶，由于调节基因发生变异，酶的合成变为组成型（不管生长条件如何，酶的合成量总是恒定的）的一种现象。
结构基因:负责编码细胞代谢途径中组成型蛋白质的基因。
其所编码的蛋白质一般不作为调节因子。
调节基因：位于操纵子外，可产生阻遏蛋白或激活蛋白，对操纵子起调节作用。
持家（管家）基因：在个体发育中，能保证发育的必要基因。
常常表达的基因。
奢侈基因：在个体发育不同阶段，有时表达，有时被关闭的基因。
断裂基因：真核生物中含有内含子的基因，成为断裂基因。
启动子：位于操纵子前端，是RNA聚合酶首先结合的地方，决定着结构基因能否被转录。
增强子：一段72bp重复两次序列，可促进其他基因的转录。
沉默子：可降低基因启动子转录活性的一段DNA顺式元件。
与增强子作用相反。
操纵基因：是结合阻遏蛋白的区域。
决定RNA聚合酶能否对结构基因进行转录。
假基因：结构基因的完整序列，不转录更不翻译的基因（无功能的基因）。
二简答1 三位一体学说的内容是什么？（1）基因是一个突变单位，可由野生型变为突变型。
（2）基因可以视为交换单位（重复单位），两基因间可发生交换。
（3）基因是各功能单位，可控制性状的发育。
（4）基因在染色体上按一定顺序、间隔呈线状排列。
2 乳糖操纵子有哪些突变型，各如何表示？（1）调节基因：i+→i-s永远处于开放状态i+→i s s永远处于关闭状态（2）操纵基因：o+→o-s永远处于开放状态（3）启动子：p+→p-s永远处于关闭状态3 在乳糖操纵子中，阻遏物与操纵基因存在什么相互作用？（1）操纵基因与阻遏蛋白的结合部位（2）阻遏蛋白与操纵基因的结合部位（3）诱导物与阻遏蛋白的关系（4）阻遏蛋白抢先占领操纵基因区（5）RNA聚合酶提前结合在启动子区域，抢先到达操纵子区4 在乳糖操纵子中，表达的方式有哪些？（1）本底水平表达（2）乳糖含量与基因表达（3）阻遏物活性和基因表达（4）葡萄糖对操纵子的影响（5）cAMP的控制作用（6）同一顺反子不同结构基因的表达量（7）融合基因——乳糖操纵子与目的基因的结合5 一个基因一个酶学说的内容是什么？有哪些缺陷？内容：任何代谢过程中，都是由多步骤衔接而成，每一步都有酶催化，酶是由基因控制合成的，每个基因控制一种酶的合成。
遗传病诊断基本技术
长10－100bp的DNA高度重复序列（重复次数通常为几 百到几千次）称为小卫星DNA，由于小卫星可变的串联重 复次数造成许多等位基因，故又称为可变数目串联重复 VNTR。
应用：法医学身份鉴定；亲子鉴定。
遗传病诊断
临床诊断
系谱分析 细胞遗传学
技术
生化检查
基因突变 检测
病史
症状、体征
显带核型分 析技术
分子细胞遗 传学技术
直接检测DNA 突变
DNA突变预筛 查
间接检测DNA
产前诊断 技术
植入前遗传 学诊断技术
羊膜穿刺术
绒毛膜绒毛吸 取术
无创产前DNA
一、细胞遗传学诊断技术 二、基因突变检测技术 三、产前诊断技术 四、植入前遗传学诊断技术 五、生化检查
（4）C带 局部显带 ，每条染色体的着丝粒区特异性着色， 近着丝粒处的次级缢痕及Y染色体长臂远端为结构异染色 质区，呈深染带。C带技术通常用于检测着丝粒区、Y染 色体及次级缢痕区结构上的变化。
（5）N带 硝酸银染色 随体及核仁组织区（NOR） 黑色银染，研究肿瘤细胞及减数分裂等方面。
（6）T带 可使染色体末端端粒特异性深染。用以分 析染色体末端有无异常。
（一）直接检测DNA突变的技术 1、PCR 2、实时定量PCR（QPCR）
在遗传病检测领域，实时荧光PCR的应用并不如在传染病领域 以及肿瘤领域，这是因为遗传病领域所涉及到的检测对象多为 序列变异，而不是传染病领域的靶基因检测或肿瘤领域的体细 胞特定稀有突变检测。
方法局限性：在遗传病检测领域，实时荧光PCR主要用于少数 已知特定突变的检测，所涉及的疾病类型有限。
方法局限性： 操作复杂 临床诊断非特异性
4、多重连接依赖式探针扩增－MLPA 是一种高通量、针对待测DNA靶序列进行定性和半 定量分析的方法，可用于检测大缺失、重复。
人类辅助生殖技术与人类精子库
分 类：
• 人工授精根据精子来源分为
– 丈夫精液人工授精（Artificial Insemination by Husband Semen, AIH） – 供精人工授精（Artificial Insemination by Donor Semen, AID）
• 根据授精部位分为：
– – – – 阴道内人工授精（Intravaginal Insemination, IVI） 宫颈内人工授精（Intracervical Insemination, ICI） 宫腔内人工授精（Intrauterine Insemination, IUI） 输卵管内人工授精（Intratubal Insemination, ITI）
–取己之长，造福他人！ –留得青山在，不怕没柴烧！
无不 后孝 为有 大三 ！，
第一篇 人类辅助生殖技术
第二篇 人类精子库 第三篇 人类辅助生殖技术和 人类精子库伦理原则
第一篇 人类辅助生殖技术ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
概念：
是指利用现代医学的最新成果用人工的手段代 替自然生殖过程的一部分或者全部的技术。
人工辅助生殖的里程碑：
体外受精-胚胎移植的治疗步骤
• 控制性促排卵：自然周期中通常只有一个优势卵泡发育，受精后只能 形成一个胚胎，移植一个胚胎后的妊娠率很低，而且自然月经周期的 长短因人而异，甚至同一患者不同的周期也存在差异，不易安排取卵 时间，所以需要采用控制性促排卵，以达到不受自然周期限制、获取 多个健康、成熟卵子的目的，提供受精后多个胚胎移植，并尽可能使 黄体与内膜功能同时能对妊娠发生与妊娠维持相适应。 • 促卵泡成熟：当主导卵泡发育到18毫米以上时，注射hCG促进卵泡 成熟。 • 采卵：注射hCG后36小时，在阴道B超下穿刺采卵。该手术快捷，创 伤小，病人易接受，可以重复进行，不需麻醉。 • 取精：采卵的同时，丈夫手淫法取精液于一无菌容器内。 • 精液的处理：采用上游法或梯度离心法。 • 受精：取卵后4～5小时加精。 • 胚胎移植：目前我所多在受精后3～5天移植胚胎。 注：目前IVF-ET 的成功率为35%左右。年轻女性成功率较高，年龄 超过35岁，成功率有所下降。
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南京大学医学院 王亚平
2006年11月
基因诊断的中心问题是认识 遗传变异、基因突变 及与表型之间的关系
一、分子细胞遗传学技术
荧光原位杂交技术（fluorescence
in site
hybridization, FISH）：用荧光物质标记特异性DNA探针， 与中期细胞染色体或间期细胞核杂交，鉴别和确定出生缺 陷、肿瘤细胞染色体异常，分辨率可达50－500 kb.
染色体技术的
应用－2
inv(9)(p12q13)
分子细胞遗传学：DMD基因第46号外显子缺失
细胞遗传学研究中染色体技术的应用
21号染色体涂染探针FISH杂交， 显示21三体
9号染色体涂染探针杂交。 箭头示易位到10号染色体上 的来自9号染色体的片段
比较基因组杂交（comparative genomic hybridization, CGH）
变中最多见的形式。
•。
动态突变：传递中不断改变自己，多见于短重
复序列的突变，在一代代传递中重复次数发生
明显变化。
点突变的结果：
（1 ）同义突变（ samesense mutation ）：碱基替换后，虽 然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码 的兼并性），亦称静止突变。 （ 2 ）错义突变（ missense mutation ）：碱基替换，密码 子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨 基酸。 （3）无义突变（nonsense mutation）：碱基替换后，使 编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。 （4）中性突变：包含两种情况，即“同义突变”和不改变 蛋白质功能的“错义突变”
1. 无义突变和移码突变： 2. 稀有的错义突变： 60％
微小突变
20％
3. DNA大片段缺失或重复: 20％
另外：可能和疾病风险评估有关的大量的多态位点
（二）目前常用的对已知点突变的分析技术
• 限制性片段长度多态性（RFLP）
• 等位基因特异性（PCR）扩增（ASA）
• 等位基因特异性寡核苷酸杂交（ ASO）
基因突变形式—碱基的插入和缺失
• 碱基的插入和缺失：基因编码序列中插入或丢失一个或
几个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编
码氨基酸序列都发生改变，又称移码突变（ frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现终止密码。
碱基的插入和缺失的结果：将导致移码突变
（frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现 终止密码产生截短型蛋白
CGH的优点：
• 经一次染色体原位杂交实验即可在整条染色体或染色体 区带水平对待检基因组DNA序列拷贝数改变进行检测和 定位。 • 无需进行染色体培养，对于不易制备良好分裂相的实体 瘤尤为适用。 • 所需染色体DNA可来自各种组织，如新鲜组织、福尔马 林固定的组织、石蜡包埋组织，可在很少量的基础上检 测，利于做回顾性研究。
• DNA芯片
1.限制性片段长度多态性（RFLP）分析
• 当突变影响到某一限制性内切酶位点时，
可通过酶切PCR产物，电泳分析:限制性片 段长度多态性（RFLP）
2.等位基因特异性（PCR）扩增（ASA）
• 通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补， 一个与突变DNA互补。分别加入这两种引物及3’ 端引物进行两个平行的PCR，分析结果。
CGH的局限性：
• 难以检出以下异常：平衡易位，微小突变，基
因重排，倍体水平改变。 • 结果可能受到一些因素影响：正常细胞存在， 肿瘤自身的遗传异质性，系统的波动。 • 灵敏度：限于检测较大范围的缺失（10 — 30MB）
二、突变分析与分子诊断
（一）基因突变类型
• 点突变：只有一个或几个核苷酸的改变，是突
缺失突变
基因突变形式
• 框内突变（ inframe mutation ）： 3 个或是的 倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢 失或增加1个或几个氨基酸。
• DNA 大片段缺失或复制（ large deletion or
duplication) ：几百个bp至几十个kb的碱基缺
失或复制。
各种类型病理性突变的比例
应用15号染色体一基因特异性 探针（红色）杂交确定其是否 缺失；绿色探针鉴定15号染色 体着丝粒。
24种不同染色体涂染探针杂 交得到的彩色染色体
染色体技术的
应用－1
inv(14)(p12q24)
t(2; 11)(2q34; 11q13)
细胞遗传学研究中染色体技
术的应用—FISH技术检出
t(2; 14)
• 近年在FISH技术基础上发展起来的一种新的分子细胞遗 传学技术（1992，Kallioniemi）。其基本原理是用不 同荧光物质分别标记肿瘤细胞DNA和正常人细胞DNA，然 后与正常人中期细胞染色体杂交。
• 通过检测染色体上两种荧光信号的相对比值，了解肿瘤 细胞DNA拷贝数的变化，并可在染色体上定位。 • 这一技术已广泛应用于肿瘤基因组不平衡的检测。
3.等位基因特异性寡核苷酸杂交（ ASO）
• 设计两段寡核苷酸探针，其中包含发生突变的 位点，一段与野生型链互补，一段与突变型链 互补。 • 杂交分析是否存在突变
荧光原位杂交技术（Fluorescence in site hybridization, FISH）的特异性DNA探针
• 基因座特异性探针：克隆扩增获得。在基因制图方面的努 力，越来越多的这方面探针可以使用 • 着丝粒重复序列探针：这些特异性的探针可在中期染色体 和间期细胞核中产生强烈信号，可以鉴别特异性染色体。 • 全染色体涂染探针：通过对来自特异性染色体分检库或仅 含一条人类染色体的杂种细胞DNA扩增制备。这种DNA 序列的混合物与一条染色体上的多个位点同源。因此在中 期核内，整条染色体得以被涂染。通过使用不同的荧光素， 在一个中期染色体涂片上可以鉴别几条不同的染色体。
比较基因组杂交的原理
• 待测DNA（肿瘤 细胞DNA，test DNA)为绿色
• 参照DNA(正常 细胞DNA， reference DNA） 为红色
• 复染为蓝色
人食管鳞癌细胞株的比较基因组杂交
A. 中期染色体的DAPI的 复染图
B. 中期染色体比较基因组杂 交（CGH）：红色区域表示
丢失，绿色区域表示扩增。