第二章植物细胞培养

①碳源和能源：蔗糖（2%～4%，高达7%）、 葡萄糖、果糖。 ②维生素：硫胺素（维生素B1）、烟酸、维 生素B6（吡哆辛）、肌醇等。
③氨基酸和有机添加物：甘氨酸、水解酪蛋 白。 ④植物激素 生长素：2,4-D、NAA、IAA、IBA。 细胞分裂素：Kt、6-BA、Zt。
培养基的配制 ⑴母液的配制 a.大量元素母液的配制：配成使用浓度的10倍。 溶解时，应注意先后顺序，把Ca2+与SO42-、 PO43-错开，以免形成沉淀。保存于5～8℃ 冰箱中备用。 b.微量元素母液的配制：配成培养基配方浓度 的100倍。保存于5～8℃冰箱中备用。
扩大100倍 称量(mg) 2230 860 2.5 620 25
备注
用100mL容量瓶 定容于100mL蒸 馏水中。每L培 养基吸此液1mL。
碘化钾(KI)
氯化钴(CoCl2· 6H2O)
0.83
0.025
83
2.5
铁盐单独配制：5.57g FeSO4· 7H2O和 7.45g Na2EDTA溶于1L水中，用时每配 1000mL培养基取该溶液5mL。常温下保存。 c.植物激素和其他母液的配制：一般常用Vit 都是水溶性的，用蒸馏水溶解。生长素类 （NAA、2,4-D、IAA）是醇溶性的，称好后 先用少量95%酒精溶解，再用蒸馏水定容。 细胞分裂素类（Kt、6-BA、2-IP、Zt），先 用少量1mol/L HCl或1mol/L NaOH溶解， 再用蒸馏水定容。叶酸先用少量稀氨水溶 解，再用蒸馏水定容。 5～8℃保存。
常 用 培 养 基 配 方
⑵培养基的制备 首先将各种母液按大量元素、微量元素、 铁盐及有机成分的顺序，依次用移液管吸 取，加入烧杯中混合，再加入所需量的蔗 糖使其溶解，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调整pH值（5.5～5.8），加入琼脂并 加热搅拌，使琼脂完全溶化，用蒸馏水定 容后，分装到培养容器中。

天然植物食用色素的生产 人工合成色素 食用色素 植物色素 天然色素 动物色素 微生物色素 矿物质色素 目前允许使用的天然色素有姜黄素、红 花黄色素、辣椒红素、虫胶色素、红曲米、 酱色、甜菜红、叶绿素铜钠盐和β -胡萝卜 素。

探索阶段：20世纪初期 两个理论基础是细胞学说和细胞全能性学说。 技术建立阶段：20世纪30年代开始至50年 代末期 两个重要模式是培养基模式和激素调控模式。 应用研究阶段：20世纪60年代后期 在农业上，用来培育作物新品种。 在工业上，用来生产药物或其他天然产物。

1、定义： 生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体
的潜能的特性。
2、原理： 生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有
的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所 必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每 一个活细胞都应该具有全能性。
3、差异： （1） 受精卵的全能性最高；
（2） 受精卵分化后的细胞中，体细胞的 全能性比生殖细胞的低。
起动期：细胞准备分裂的时期。起动就 是愈伤组织形成的起点。细胞大小虽无明 显变化，但细胞内的合成活动却极为活跃， RNA的含量很快增加，细胞核也变大。 分裂期：外层细胞出现分裂。细胞最小、 细胞核和核仁最大、RNA含量最高，这也 标志着细胞分裂进入最旺盛的时期。 形成期：细胞大小趋于稳定，细胞分裂 已从分裂期的以组织的周缘细胞分裂为主 而转向较内部的组织。
基本原则：既要杀死材料上附着的微生物， 同时又不能伤及材料。 消毒时采用的消毒剂及其浓度、处理时 间等，均应根据材料的情况及对消毒剂的 敏感性来定。 常用的消毒剂 ⑴ NaClO溶液（漂白粉）：一种常用消毒剂， 杀菌效果好，它能分解成具有杀菌效能的 氯气，散失在空气中对植物组织无害；

⑵ H2O2：灭菌效果好，容易分解成无害的化 合物而散失掉，通常用于叶片的灭菌； ⑶低浓度的HgCl溶液：消毒效果好，但是消 毒后汞离子粘在材料上，不易去掉，使用 后必须用无菌水多次清洗材料； ⑷ 70%的酒精：具有较强的穿透力和杀菌力， 通常作为外植体表面消毒的第一步，因为 它能使材料表面湿润以便于消毒剂的渗入 而增加杀菌能力，但因其杀菌不够彻底， 所以往往需要和其他消毒剂结合使用。严 格掌握时间。
初级及次级代谢物的生产 人类已应用的30 000多种天然物质中有 80%以上来源于植物。目前来自植物细胞培 养的有用物质有400种左右，包括色素、固 醇、生物碱、维生素、激素、多糖、植物 杀虫剂及生长激素等数十个类别。 生物转化 利用植物培养细胞为酶源使某种前体化 合物生成相应产物的技术称之为生物转化。
应用的原理和方法 概念 研究的水平 研究的目的 细胞工程
细胞生物学和 分子生物学
细胞整体水平 或细胞器水平 按照人们的意愿来 改变细胞内的遗传 物质或获得细胞产 品
分类
细胞学说； 植物细胞工程 理论基础 细胞全能 性学说
动物细胞工程
微生物细胞工程
植 物 细 胞 通常采用的 工 技术手段 程
所采用技术 的理论基础
4、潜在全能性的原因： 基因表达的选择性
下列有关细胞全能性的含义，正确的是： A、每个生物体内的所有细胞都具有相同的功 能 B、生物体内的任何一个细胞可以完成该个体 的全部功能 C、生物体的每一个活细胞都具有发育成完整 个体的潜能 D、 生物体的每个细胞都经过产生、分裂、 分化、生长、衰老、死亡的全过程

洗涤

培养瓶和其它器皿应先在清水中浸泡 后，然后刷去瓶内污物，再用洗衣粉、 洗洁净等洗涤。 洗净的器皿应不挂水 珠，内外壁水膜均一，置于烘箱内烘 干。
灭菌

无菌操作是植物组织培养中最关键的技术！ 培养基应用高压灭菌锅灭菌121度15分钟灭菌 一些不耐热的物质将采用过滤灭菌，如生物添 加剂、赤霉酸和玉米素等 玻璃器皿及耐热用具用干热灭菌。 植物材料先刷洗然后冲洗，再用消毒液，如次 氯酸钠、升汞等进行表面灭菌，最后用蒸馏水 清洗。
植物细胞的全能性
植物组织培养 植物体细胞杂交

植物组织培养与细胞培养的区别： 组织培养是指从机体内取出组织或细胞， 模拟机体内生理条件，在体外进行培养， 使之生存或生长成组织。如用于植物快速 繁殖的组培技术。 细胞培养是指动植物细胞在体外条件下 的存活或生长，此时细胞不再形成组织。 如以生产次生代谢产物为目的的大规模细 胞培养技术。

培养条件 ①湿度 ②光照：从光强度、光照时间及光质来衡量。 ③温度：一般保持在23～28℃之间。 ④培养基的pH值：5.5～5.8之间。 ⑤气体调节：CO2/O2

愈伤组织的诱导
分化 脱分化 再分化
形成根、茎、叶等
形成愈伤组织
再形成根、茎、叶
理论基础
细胞的全能性学说
植物材料的来源（外植体） 诱导 生长素：促进细胞的 培养条件→激素 生长和生根 细胞分裂素：促进细 胞分裂和出芽
外植体的选取和消毒 培养方法和条件 愈伤组织培养 愈伤组织的诱导 愈伤组织的形成 愈伤组织的生长和形，
利用人工培养 基对植物体的 器官、组织和 细胞进行培养。
选取的器官 器官的生理状态和发育年龄 取材的季节 外植体的大小 取得离体材料的植株质量。

在生物体内，细胞没有表现出全能性，而 是分化为不同的组织、器官，是因为： A、细胞丧失了全能性 B、基因的表达有选择性 C、不同的细胞内基因不完全相同 D、在个体发育的不同时期，细胞内的基因 发生了变化

实验室设备

无菌操作的工具：酒精灯、广口瓶、镊子、 接种针、接种钩（或铲）、剪刀等。
植物细胞培养 实验室

外植体的大小和形状取决于实验目的及对 外植体的要求。
用于诱导愈伤组织的外植体，材料大小无 严格限制，切成片或小块，0.5cm左右。 定量研究愈伤组织，外植体大小必须一致 ，形状和组成也要基本相同。


切取
接种

培养方法：固体培养和液体培养。 固体培养：植物组织培养在固体的琼脂培养 基上。优点：简便，实验设备要求简单。 缺点：外植体或愈伤组织只有一部分表面 能接触培养基，当外植体周围的营养被吸 收后就容易造成培养基中营养物质的浓度 差异，影响组织的生长速度。同时，外植 体插入培养基的部分，常因气体交换不畅 及排泄物质的积累影响组织的吸收或造成 毒害。而且光线分布不均匀及很难产生均 匀一致的细胞群。
除培养架之外，培养室内还可以放置摇床、 转床等各种培养装置，其式样和大小可因培养室 的大小及使用目的而定。
一些设备
培养室
植物组织培养成功 的两个重要因素
培养组 织的材 料来源
培养 基
定义：含有一定营养成分，供组织培养植 物生长的基质。 培养基的组成 ⑴无机营养物 大量元素：C、O、H、N、P、S、K、Ca、 Na、Mg 微量元素：I、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、 Fe、Pt ⑵有机营养物

生长素IAA、NAA和2,4-D，浓度0.01～ 10mg/L；细胞分裂素Kt和6-BA，浓度0.1～ 10mg/L。在多数情况下仅用2,4-D就可以成 功地诱导愈伤组织，浓度低于10-9mol/L时 ，生长缓慢，浓度高于10-3mol/L时，生长 完全受抑制。在诱导愈伤组织生长时，需 注意因植物种类不同而采用不同的激素， 因激素种类不同而选用合适浓度。
花药的消毒：处于无菌状态，外表消毒。 果实及种子的消毒：用NaClO或Ca(ClO)2浸 泡消毒，难以消毒的用HgCl溶液或溴水。 茎尖、茎段及叶片的消毒：用2% ～10%的 NaClO溶液浸泡10 ～15min，再用无菌水清 洗3次后即可用于接种。

根及地下贮藏器官的消毒：用自来水清洗 →软毛刷刷洗→滤纸吸干→纯酒精漂洗→ 用0.1% ～0.2%HgCl溶液浸5～10min或2% NaClO溶液浸10 ～15min →无菌水清洗3次
备注
定容于1000mL 蒸馏水中，最后 加入氯化钙 (CaCl2· 2H2O)
。每L培养基取 此液100mL。