WesternBlot的原理和所用试剂汇总
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤一、配胶原理：30% acrylamide mix：产生凝胶的基本物质1.5M Tris(ph 8.8) ：使分离胶PH为8.8（与甘氨酸的pka接近，从而使不同分子量的蛋白产生不同的电泳速度，从而使不同分子量的蛋白分开）1.0MTris(ph 6.8)：使浓缩胶PH为6.8（可以通过甘氨酸和氯离子的作用产生压缩，从而使蛋白条带压细）10% SDS阴离子去污剂：断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质二三级结构，消除蛋白质在迁移过程中结构的影响。
与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物，由于SDS带有大量负电荷，蛋白质本身的电荷被掩盖，从而消除蛋白质迁移过程中自身电荷的差异造成的影响。
同时能够助溶，蛋白质变为亲水，容易在水相中迁移。
每克多肽可以与1.4g 去污剂结合，当分子量在15kd-200kd之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，logMW（分子量）=K-bx（迁移率）AP：提供acr丙烯酰胺和bis亚甲丙烯酰胺聚合的氧自由基，是acr 和bis聚合的引发剂TEMED：催化AP释放氧自由基，是反应的催化剂1、清洗干净1.5mm或1mm玻璃板，检漏（有豁口和字的朝上）2、倒掉水，配10ml 10%的分离胶（1.5mm板需要7ml，1mm 板需要4.5ml）10%方案如下：H2O 4.0ml30% acrylamide mix 3.3ml1.5M Tris(ph 8.8)2.5ml10% SDS 0.1ml10% ammonium persulfate 0.1mlTEMED 0.004ml3、混合后上下摇晃，注意不要放在手中配（否则温度太高凝固的快），静置15s后用1ml枪二档吸一档打（在一角加即可，不用来回加，否则容易出气泡。
不过出气泡了也没事，加水压一下就浮上来了）4、加进玻璃板中，随后均匀来回加水到满5、等待20分钟6、倒掉水，将架子倒置过来让水排干，用纸巾擦拭斜角（一定要擦干净所有的水！否则两层胶之间出现水层就废了），同时配浓缩胶4ml H2O 2.7ml30% acrylamide mix 0.67ml1.0M Tris(ph 6.8) 0.5ml10% SDS 0.04ml10% ammonium persulfate 0.04ml TEMED 0.004ml7、加满分离胶后插入1.5mm或1mm的梳子，注意不要有气泡，等待20min二、测定蛋白浓度原理：A液是质量浓度为0.1g/mL氢氧化钠溶液（20ul protein assayS+1ml protein assay A），B液是质量浓度为0.01g/mL硫酸铜溶液。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。
一、Western Blot的原理Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、操作步骤（一）蛋白质样品获得：1.所需试剂：(1)蛋白酶抑制剂mix：hjjhh储存浓度5ml mix中的加入量终浓度*PMSF（溶于乙醇）100mM 25ul 50uM*Trypsin Inhibitor 1mg/ml 250ul 50ug/ml*EGTA（pH8.0）0.5M 80ul 8mM*EDTA（pH8.0）0.5M 10ul 1mMAprotinin 1mg/ml 25ul 5ug/mlPepstatin（溶于乙醇）0.2mg/ml 50ul 10ug/mlLeupeptin 5mg/ml 100ul 0.1mg/mlBenzamidine 100mM 250ul 5mMNaF 5M 250ul 250mMNaVO4（FW183.8）0.2M 25ul 1mM注意：*代表必须加的试剂(2)细胞裂解缓冲液(培养细胞用)：1% NP40, 25 mM Hepes。
实验时间WB详解（原理、试剂、步骤及问题解答）
实验时间WB详解（原理、试剂、步骤及问题解答）Western Blot 实验原理WB 是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。
对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot 分类根据显⾊⽅法主要有以下⼏种：1. 放射⾃显影2. 底物化学发光 ECL3. 底物荧光 ECF4. 底物 DAB 呈⾊现在常⽤的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈⾊，体同⽔平和实验条件的是⽤第⼀种⽅法，⽬前发表⽂章通常是⽤底物化学发光 ECL。
只要买现成的试剂盒就⾏，操作也⽐较简单，原理如下（⼆抗⽤ HRP 标记）：反应底物为过氧化物 + 鲁⽶诺，如遇到 HRP，即发光，可使胶⽚曝光，就可洗出条带。
实验常见的问题指南01参考书推荐A. 对初学者看什么资料⽐较好？解答：《抗体技术实验指南》和 Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow，david lane）两本书不错。
02针对样品的常见问题此处内容较多，有部分答案省略，想查看更多详情，请点击【阅读原⽂】查看。
B. 做线粒体膜 UCP2 蛋⽩的 Western Blot（以下简写成 Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋⽩酶抑制剂），⽤的博⼠德的⼀抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120 µg，换了个 santa cloz 的⼀抗仍不⾏。
是什么原因？蛋⽩酶抑制剂单加 PMSF ⾏吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋⽩酶抑制剂。
同时，建议检查 Western Blot 过程，提⾼⼀抗浓度。
对于加蛋⽩酶抑制剂来说，⼀般加 PMSF 就可以了，最好能多加⼏中种蛋⽩酶抑制剂。
C. 细胞⽔平要做 Western Blot，多少细胞提的蛋⽩够 Western Blot？解答：⼀般地 5* 106 就⾜够了。
蛋白免疫印迹（WesternBlot）
蛋白免疫印迹（WesternBlot）1.4.9 细胞裂解液50mM Tris-Cl (pH 8.0) ，1% NP-40， 150mM NaCl，0.5%去氧胆酸钠及0.1% SDS1.4.10 PMSF储存液（100mmol/L）称取PMSF17.4mg,溶于1ml异丙醇，分装后储存于－20℃。
1.4.11 5×Tris甘氨酸电泳缓冲液去离子水 500ml，Tris碱 15.1g，甘氨酸 94g，10%(w/v)电泳级SDS 50ml，补去离子水至1000ml，使用前做5×稀释。
1.4.12转膜缓冲液Tris碱3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，补ddH2O 至1000ml , 每次配完可用2～3 次，现用现配。
4℃避光保存。
1.4.13 1.5MTris－HCl(PH8.8)Tris碱18.17g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH8.8，定容100ml。
1.4.14 1.0MTris－HCl（PH6.8）Tris碱12.11g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH6.8，定容100ml。
1.4.15 10%SDSSDS 10g，ddH2O定容100ml。
1.4.16 30%丙烯酰胺（29：1）丙烯酰胺29g，N，N’-Y亚甲双丙烯酰胺1g，温热去离子水分别溶解上述后,再补去离子水至100ml.滤纸过滤,储于棕色试剂瓶中,4℃保存一月。
1.4.17 10×TBST缓冲液浓度为100mmol/L Tris-HCl pH 8.0；1500 mmol/L NaCl；0.2%Tween-20，补水至1000ml. 高压灭菌，4℃保存，使用前再做10 倍稀释。
1.4.18 封闭液（5%脱脂奶粉）脱脂奶粉 5g，1×TBST 80ml,充分溶解后补1×TBST 至100ml。
1.4.19 10%过硫酸胺APS（4℃避光保存）APS 10g，ddH2O定容100ml。
westernblot实验步骤
Western bolt一、实验目的通过实验了解western blot技术的原理和操作。
二、实验原理SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X 为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。
NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。
第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。
第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。
化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂）是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。
显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。
二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。
三、实验器材1.电泳槽，胶板架子2.转膜仪3.NC膜4.电泳电源5.滤纸6.摇床7.X射线摄影暗匣8.X射线胶片9.塑料薄膜四、实验试剂1.runningbuffer5xrunningbuffer(1L)Tris 15.1gGlycine 94.0gSDS 5.0gddH2O 定容至1L使用前稀释5倍2.Transfer buffer10×Transfer buffer(1L)Tris 30.3gGlycine 144.0gddH2O 定容至1L使用前稀释10倍，加入1/4体积的甲醇3.TBS10×TBS(500mL)Tris 12.1gNacl 40.0gddH2O 定容至500mL用HCl调节溶液的pH值至7.64.TBST(1L)1×TBS:Tween-20=1000:1ddH2O定容至1L5.5%的脱脂奶粉溶液(50ml)脱脂奶粉 2.5gTBST 定容至50ml6.一抗溶液7.二抗溶液8.显影液现配现用，溶液A：溶液B=1:1配置。
western blot技术的原理方法注意事项
western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术，其基本原理是蛋白质的印迹技术，即把蛋白质从复杂的样品中分离出来，并转移到固相支持物上，再与特异性抗体结合，通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。
二、方法1.样品处理：首先，需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。
根据样品性质，可以采用不同的提取方法，如细胞裂解液、组织匀浆液等。
2.凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中，通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。
3.免疫反应：将膜上的蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.显色反应：通过化学反应，使抗原-抗体复合物显色，便于观察和拍照。
5.电子显微镜观察：对于较小的样品，可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。
三、注意事项1.样品处理：提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度，避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。
2.凝胶电泳：分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行，以确保蛋白质能够完全分离。
同时，应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数，避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。
3.免疫反应：应注意抗体滴度的选择，确保抗体能够充分识别目标蛋白质。
同时，应避免使用过期或质量不佳的抗体。
4.显色反应：应注意显色试剂盒的质量和操作步骤，确保显色反应充分且颜色易于观察。
同时，应注意显色颜色的稳定性，避免因颜色不稳定影响结果判断。
5.电子显微镜观察：应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护，确保电子显微镜能够正确成像。
同时，应注意样品的制备和处理，确保样品能够被电子显微镜准确观察。
6.实验条件：实验过程中应注意调整实验条件，如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等，以确保实验结果的准确性和可靠性。
7.重复性：在进行Westernblot实验时，应注意重复性实验的开展，以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。
总之，Westernblot技术虽然复杂，但只要掌握了其原理和方法，并注意以上注意事项，就能够获得准确可靠的结果。
Western免疫印迹 总结版
Western免疫印迹（Western Blot）一.原理：Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
也应用于检测蛋白水平的表达。
二.试剂1.裂解液：碧云天RIPA裂解液（强）主要成分为：50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1%TritonX-100，1% sodiumdeoxycholate，0.1% SDS，以及2mM sodium pyrophosphate，25mM β-glycerophosphate，1mM EDTA，1mM Na3VO4，0.5 ug/ml leupeptin等多种抑制剂。
2.PSMF：中文-苯甲基磺酰氟，有剧毒；在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中；100mmol/L PMSF溶液配制方法：溶解174mg的PMSF于足量的异丙醇中，定容到10ml，分装成小份贮存于-20℃，使用时终浓度一般为1mmol/L。
3.裂解液（含PMSF）的配制：1ml裂解液加100 mM 的PMSF 10 μl（只是比例关系，根据样品量计算出裂解液的实际体积再配制相应的裂解液）。
PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合4.丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N,N’-亚甲双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
Westernblot技术原理及常用产品介绍2016资料
常的样品之间的表达差异性。
目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析
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成功进行Western Blot检测，设置合适正确的对照是必不可少的，只要正 确设置了这些对照，即可快速和准确的找到Western Blot的问题所在，并 保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：
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一、蛋白提取
蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型 选择合适的蛋白制备方法是至关重要的！ 使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞 组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提 取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用商业化的试剂盒进行抽提。
隔条:垫于玻璃板之间，是两块玻璃板之间形成灌胶的空间， 厚度0.75mm，长度8cm,2个包装
隔条:垫于玻璃板之间，是两块玻璃板之间形成灌胶的空间， 厚度1mm，长度8cm,2个包装
隔条:垫于玻璃板之间，是两块玻璃板之间形成灌胶的空间， 厚度1.5mm，长度8cm,2个包装
SE245的灌胶槽
SE211A-10-.75 SE211A-10-1.0 SE211A-10-1.5 SE211A-15-.75 SE211A-15-1.5 SE211A-18-1.0 SE2119T-2-.75 SE2119T-2-1.0 SE2119T-2-1.5
浓缩胶 分离 胶
主要型号： SE250/260/300/600等垂直电泳，其中特别 推荐250和260，可同时跑2块10X8/10X10.5的胶（此3款 标准套件里包含SE245的灌胶槽）
Western blot的原理、操作及注意事项
Western blot的道理、操纵及留意事项之杨若古兰创作道理：通过电泳区分分歧的组分，并转移至固相撑持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物资进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng （最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白.一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗濯后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清.加入βME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于20℃保管，用时取出，直接溶解上样.2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清.加入βME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于20℃保管，用时取出，直接溶解上样.3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入βME、溴酚蓝制样.B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量缘由1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法.在须要快速，但不很精确的测定中，经常使用此法.硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的初期阶段是非常有益的.双缩脲法的道理是Cu2+与蛋白质的肽键，和酪氨酸残基络合，构成紫蓝色络合物，此物在540nm波利益有最大接收.双缩脲法经常使用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定.干扰物有硫醇，和具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等.可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定.2.Lowry法：此法是双缩脲法的进一步发展.他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中构成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷磷钨酸试剂（福林酚试剂），结果得到深蓝色物.此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液.其干扰物资与双缩脲法不异，而且受他们的影响更大，硫醇和很多其他物资的存在会使结果严重偏差.另外要留意的是，加入福林试剂时要特别当心，试剂只在酸性pH环境中才波动，上述提到的还原反应只要在pH10时才发生，是以，福林试剂加入到碱性的Cu2+蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸磷钨酸试剂在未被破坏之前能无效地被Cu2+蛋白质络合物所还原.3.紫外接收法：大多数蛋白质在280nm波利益有特征的最大接收，这是因为蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的原因，是以，利用这个特异性接收，可以计算蛋白质的含量.如果没有干扰物资的存在，在280nm处的接收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液.部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波利益有最大接收.有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校订，普通按下述公式粗略计算：是蛋白质溶液在280nm波利益（光程1厘米）测得的光密度值.是蛋白质溶液在260nm小波利益（光程1厘米）处所测得的光密度值.此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的.是以，对其他蛋白质和其他核酸纷歧定适用.因为各种蛋白质所含芳喷鼻族氨基酸的量分歧，是以，浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm处的消光系数（）在0.5～2.5之间变更.所有的蛋白质在230nm以下都有强接收.例如，牛血清白蛋白的α0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58.在230nm以下的强接收是因为肽键的存在，是以，此值对所有的蛋白质都是一样的.从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml的蛋白质.蛋白质浓度可以近似地由下式得到：光密度之差求得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分发生的误差.但是，蛋白质之间的分子量差别比较大，是以，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校订.因为蛋白质的接收峰常因pH改变而变更，所以在建造尺度曲线时，必须与样品条件分歧.4. Bradford比色法：Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单敏捷.用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲零碎的干扰.分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20µl），以0.15mmol/l NaCl补足至100µl，同时以两管100µl的0.15mmol/l NaCl作空白对照.每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟.用1cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值对尺度蛋白浓度作图，画尺度曲线，并测量待测样品的A595.从BSA尺度曲线中确定待测样品的浓度.测定10100µg的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行.样品浓度过高，可浓缩后进行，或在10100µg另作一尺度曲线进行测定.5．电泳估算法（我们选择此法）：样品倍比浓缩，SDSPAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度.以提取癌组织总蛋白为例：① 取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的1×PBS洗濯3次，目的是去除样本中的血液.② 每2克组织加入3ml 1×PBS匀浆，坚持在4℃条件进行.③ 加入5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化.再加入0.5ml βME，0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；④ SDSPAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度.二、SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）A：实际操纵1.做胶前的筹办1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子.2)检查是否有新颖的，充足10%APS，没有立刻重配.3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量.2.制胶，电泳1）装好架子.2)按照上面配方配制分离胶.(单位：ml，Total： 8ml)在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集.3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶.(单位：ml，Total： 3.5ml)倒好后拔出事后筹办好的梳子.4)待胶凝集好后，上样，电泳. 上层胶用6080V电压，当样品至分离胶时，用100120V电压.普通电泳时间在1.5小时摆布.B ：留意事项及常碰到的成绩1）分离胶不要倒的太满，须要有必定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩后果.2）上样蛋白量不该超出30ug/mm2 (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：1mm×5mm=5mm2) .3）gel通常在0.51h内凝集最好，过快暗示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶.太慢则说明两种试剂用量不敷或者零碎实际不纯或实效.4）混合搅拌速度太快发生气泡影响聚合，导致电泳带畸形.太慢不均匀，特别是甘油.5）电泳中常出现的一些景象：︶条带呈笑容状，缘由：凝胶不均匀冷却，两头冷却欠好.︵条带呈皱眉状，可能是因为安装分歧适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完整.拖尾：样品溶解欠好.纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒.条带偏斜：电极不服衡或者加样地位偏斜.条带两边扩散：加样量过多.三、转移在电流的感化下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上.膜的选择：印迹中经常使用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等.我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，和具有更好的化学兼容性.有两种规格：ImmobilonP（0.45um）和ImmobilonPSQ(0.2um for MW<20kDa).A 半干法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的后果.因为电流直接感化在膜胶上，所以其转移条件比较严格，但是其转移时间短，效力高.1 实验条件的选择电流1mA2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整.2 实验操纵（1）滤纸和膜的筹办(在电泳结束前20分钟应开始筹办工作).A.检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制.B.检查是否有合适大小的滤纸和膜.C.将膜泡入甲醇中，约12分钟.再转入transfer buffer中.D.将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer中.（2）转移A.在电转移仪上铺好基层滤纸.普通用三层.B.将膜铺在靠膜滤纸上，留意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，坚持膜的湿润.C.将胶剥出，去掉stack gel，当心的移到膜上.D.剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标识表记标帜出胶的地位.E.将一张靠胶滤纸覆盖在胶上. 倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸.F.装好电转移仪，根据须要选定所需的电流和时间.G.转移过程中要随时观察电压的变更，如有异常应及时调整.靠胶滤纸胶膜靠膜滤纸3 留意事项及常碰到的成绩1）滤纸、胶、膜之间的大小，普通是滤纸>=膜>=胶.2）滤纸、胶、膜之间千万不克不及有气泡，气泡会形成短路.3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完整浸湿.而且在当前的操纵中，膜也必须随时坚持湿润（干膜法除外）.4）滤纸可以反复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸必定不克不及弄混，在不克不及分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的.5）转移时间普通为1.5 小时，( 1mA2mA/cm2，10% gel)，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小.B 湿法我们基本上不必此方法，这里暂不做介绍.C 转移后后果的鉴定1．染胶用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的后果.2．染膜有两类染液选择，可逆的和不成逆的.可逆的有ponceaus red 、Fastgreen FC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用.但是不成逆的染料，如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不克不及用于进一步的分析.四、封闭（block）封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合.经常使用的封闭液有bovine serum albumin(BSA)，nonfat milk，casein，gelatin，tween20等，我们普通用nonfat milk.在转移结束前配好5%的Milk(TBST溶解).转移结束后将膜放入milk中block(必定要放在干净的容器里，防止净化而且要足以覆盖膜)，并清洗清算好用过的滤纸，以便下次使用. Block 4°C O/N，或 RT 1小时.五、孵育一抗A.先将须要检测的抗体筹办好，并决定好它们的浓缩度.B.配好5%的Milk(TBST溶解)，按请求浓缩好抗体.留意，如需高比例浓缩，最好采取梯度浓缩.C.将浓缩好的抗体和膜一路孵育. 普通采取RT 1小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当耽误或缩短时间.留意：为了便于后面分析结果，我们普通会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育.六、洗濯用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉.然后5mins *5.洗濯是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗濯的后果直接影响结果布景的深浅.七、孵育二抗孵育RT1 小时. 普通采取HRP标识表记标帜的二抗，浓缩比例为1:5000.二抗的浓缩比例不克不及太低，否则容易导致非特异性的结合.留意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，和根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者标记其他探针（如核素等）的.八、洗濯用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉. 然后5mins *5.洗濯是为了洗去二抗的非特异性结合，洗濯的后果直接影响结果布景的深浅，所以洗濯必定要干净.九、显色（HRP酶）1．加强化学发光法(ECL)Ecl 显色道理：氨基苯二酰肼类主如果鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最经常使用的一类化学发光剂.鲁米诺（luminol，5＇氨基2，3二氢1，4酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下：鲁米诺在免疫测定中既可用作标识表记标帜物，也可用作过氧化物酶的底物.在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的感化下，发出荧光来.试验步调：1）将两种显色底物1：1等体积混合（普通各1ml/membrane）.2）将混合物覆盖在膜概况，12分钟，摇摆使均匀.3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中.4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min.5）显影、定影.6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最好结果.留意：荧光在一段时间后会愈来愈弱.DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应发生棕色的不溶终产品.这类棕色沉淀不溶于酒精和其它无机溶剂，对于必须使用传统复染和封固介质的免疫组化染色利用特别理想.对于AP标识表记标帜的二抗我们选用BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP）感化下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强旌旗灯号.十、分析结果及其判断罕见成绩缘由分析及处理方法：见附录一、二.附录一：Troubleshooting Blotting Problems （P43－48）附录二：Western Blotting Troubleshooting Logic Tree （P390－394）附录三：试验中所用到的试剂和缓冲溶液1)5x Stop Solution (Sample buffer)pH6.7:Stock:to use:20% Glycerol 100ml take 9.5ml stock250mM Tris 15.14g bromphenol blue ortotal 475.00ml pyronine 4 to taste2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix):total 100ml3) 2x Laemmli Separation Buffer:0.2% SDS 10ml 20% SDStotal 1000ml4) 2x Laemmli Stacking Buffer:0.2% SDS 1gtotal 500ml5) 10x Laemmli Running Buffer:1% SDS 20gtotal 2 liters6) Transfer Buffer:20% MeOH 200mltotal 1000ml7) TBST:100mM NaCl0.2% Tween20Total 1000ml8) Coomassie Stain :40%MeOH 400ml10%HAc 100ml0.1%BBR 1g Brilliant Blue R total 1000ml9) Destain:30%MeOH 300ml7.5%HAc 75mltotal 1000ml10) 10×丽春红染液配方：丽春红 2g磺基水杨酸 30g三氯醋酸 30gtotal 100ml11）DABDAB 50mg0.05mol/L TB （PH7.6） 100ml30%H2O2 3040ul先配成25倍的储存液，过滤后分装，20℃避光保管，H2O2在工作液中终浓度0.01％.。
westernblot中试剂的用途和配制解析
westernblot中试剂的用途和配制解析Western blot是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断中的实验技术，用于检测和分析蛋白质在样品中的存在和表达水平。
Western blot分析依赖于抗体的选择性结合蛋白质的特异性，通过多个试剂的配制和反应，使目标蛋白质能够被有效地检测和定量。
Western blot的试剂主要包括以下几个方面的组分：2. 蛋白质定量试剂盒：用于准确测定提取的蛋白质浓度，以确保在Western blot分析中加载适量的样品。
主要有比色法和荧光法两种方法，如BCA法和 Bradford法。
3. SDS-凝胶缓冲液：SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是Western blot分析的核心步骤，它通过蛋白质的分子大小和电荷进行分离。
凝胶缓冲液主要包括聚丙烯酰胺凝胶缓冲液（Tris-HCl）、离子缓冲液（glycine）和非离子表面活性剂（SDS）。
4. 转膜缓冲液：用于将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
转膜缓冲液一般包含离子缓冲物（Tris/glycine）、甘露醇和界面活性剂（SDS或Triton X-100）。
5. 膜抗坏血酸：用于防止转膜过程中蛋白质的氧化降解。
膜抗坏血酸（methanol）可降低氧气接触并稳定蛋白质。
6.阻断缓冲液：用于抵消非特异性结合和降低背景信号。
主要有含有蛋白酶抑制剂（BSA或奶粉）的TBST或PBST缓冲液。
7.第一抗体：选择性地结合目标蛋白质的抗体。
第一抗体种类繁多，可以是多克隆或单克隆的，并且需要根据研究目的选择合适的抗体。
8.第二抗体：结合第一抗体的抗体。
第一抗体一般经过免疫动物而产生，第二抗体可通过选择性地结合第一抗体并标记荧光素或酶来进行检测和可视化。
9.显色剂：用于可视化目标蛋白质。
显色剂有不同的选择，如酶联免疫吸附法（ECL）或硫脲铵法。
10. 胶片或成像设备：用于获取Western blot结果的图像。
胶片可以通过X射线或激光扫描仪进行扫描和分析，也可以使用成像设备进行直接图像采集。
western blot 详解
其中甘油可以增大样品密度，使样品沉降到
点样孔上，防止样品漂出
上样
蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动 Anode 内槽缓冲液带有负电荷， 与凝胶顶部接触 标本加入到上 样孔中 外槽中缓冲液带有正电荷， 与凝胶底部接触
小分子量蛋白跑的比较快. 蛋白根据分子量大小分开 电泳进程可以根据前沿 指示剂来确定，等其跑 到底部上面1cm左右即可 停止电泳
具体情况依照说明书
灌分离胶： 用1ml的移液枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓慢 加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左右 ，预留1.5cm高度配制浓缩胶。 用1ml的移液枪吸取1ml左右的异丙醇，压平。沿 玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变形。 温箱放置0.5-1h左右至聚合完全。 注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶， 灌胶速度须缓慢，避免产生气泡 灌胶之上轻轻加一层异丙醇，用来压平
浓缩胶的浓度比较低（5%丙烯酰胺-甲叉双丙 烯酰胺），里面的孔径也比较大，所有的蛋白 都能够在进入分离胶之前在同一水平线上（因 为在你加样的时候蛋白是分布在加样孔中的，
不在同一水平线上。）
分离胶的胶浓度比较大（>10%），里面胶孔 径也比较小，这样施加电压的时候小的蛋白可 以穿过孔跑到下面去，而分子量大的蛋白就可 能被拦住，就跑的慢。通过这种方式以分子量 大小的区别来分离蛋白质
Cathode + 带有负电荷的蛋白质从上 到下运动（负极到正极）， 分开
四 转膜
准备物品：转移槽 黑红夹子 NC膜 滤纸 海绵垫 转
膜缓冲液 （1） 转一张膜需准备6张滤纸和1张NC膜。 切滤纸 和膜时一定要戴手套。将切好的NC膜和滤纸置于1X 转模缓冲液浸湿。 • 10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至 20%
western blot 的原理与操作方法(详细)
Western Blot 原理和操作方法（详细）工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)<104 20-301×104-4×104 15-204×104-1×10510-151×105-5×105 5-10>5×105 2-5③分离胶:电泳凝胶浓度试剂10% 12% 15% 10% 12% 15%H2O(ml) 4.0 3.3 2.3 5.9 4.93.430%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 3.3 4.0 5.0 5.0 6.07.51.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.5 2.5 2.53.8 3.8 3.810%SDS(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.1510%AP(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15TEMED(μl) 4 4 4 6 6 6总体积(ml) 10 15④浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 4 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 1 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 1 0.510%SDS(μl) 80 4010%AP(μl) 60 30TEMED(μl) 84总体积(ml) 6 3蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
WesternBlot原理、protocol
WesternBlot原理、protocol一、组织、细胞总蛋白抽提：参考相关裂解液；二、蛋白浓度测定：BCA法，这个结果要参考说明书！准备：BCA试剂，BSA，PBS/生理盐水，96孔板，100ul、20ul、10ul移液*及*头，1.5ml及4ml EP管，冰河1、配制BSA蛋白标准：配0.5mg/ml BSA，将25mg/ml的母液用RIPA 稀释成0.5mg/ml（RIPA可以换成PBS，下面的也是）；2、将BCA试剂A与B按50:1（2450 A+49ul B）充分混匀，配置成适量BCA工作液(4℃)；3、稀释BSA蛋白标准品和待测蛋白样品：用PBS稀释至20ul，再向每孔加入200ul BCA（在20-1000μg/ml浓度范围内有较好的线性关系）注：按RIPA-BSA-样本-BCA的顺序加入，操作要迅速！4、锡纸遮盖，37℃恒温箱（或酶标仪）放置30min；5、置于酶标仪上测定A562（或A570），用excel建立标准曲线然后计算出蛋白浓度；注意：数据分析可以在Excel里做也可以在GraphPad Prism软件里做，R平方值越接近1数据越好三、Western blot步骤：（一）、玻板的清洗：自来水→75%酒精擦拭→ddH2O→竖放晾干/吹干（做胶的一面朝内）【勿用手指触摸玻板内侧面】装板：低的一面向内，确认玻板底部平齐，插入斜楔板压实卡紧，加ddH2O不漏，滤纸吸干水；（二）、配胶（ 1.0mm）：分离胶 5% 浓缩胶， 3 ml/块胶注意：①、用*吸取胶，沿玻璃板一侧注入，先快后慢，*头不要打到底以防产生气泡，胶面升到绿色板上缘，用75%酒精封闭液面；②、室温放置约30min使胶充分凝固，待水和胶面之间有肉眼可见的折线，小心倒掉上层水，并用滤纸小心吸干水，勿碰触到胶面；③、TEMED作用为促凝胶，如其他试剂放置时间较长或气温较低不易凝胶时，可适量多加1~2倍 TEMED，或者多加点AP，胶就会很快凝固的；④、颠倒混匀后灌胶（约2ml），插入梳子，室温放置约30 min 后，将玻板取出装入电泳装置，竖直向上将梳子拔出，放入电泳槽润湿板子，再拿出将玻璃板卡准；补充下浓缩胶的作用：链接：/content/12/0319/10/2867540_1955684 87.shtml（三）、点样及电泳：1、用10 ul *吸取电泳液，倾斜45°反复吹打上样孔，去掉胶的残渣；2、按顺序加样本，侧边孔加5ul marker，多余孔加入2ul loading buffer，迅速上样避免弥散；上样的量可以根据所测蛋白浓度来调整，有的建议20-40ug，有的50-100ug，其实个人觉得40-80ug比较适合的，主要看你样品浓度吧！3、恒压80V 约20min；待样品进入二胶的分界线时（时间也不一定20min，跑到交界处就可以改变电压），120V 约90min（设I=200，T=2:00）(100mA的条件也跑过-六一产的）；4、溴酚蓝跑至玻板底部，且Marker条带分的足够开时，停止电泳；（四）、转膜：准备（提前30min）：1×转膜液、培养皿、甲醇、PVDF膜、剪刀镊子、尺子、切胶板、托盘、转膜夹、冰袋及冰。
蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡， 否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳 缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
western-blot的原理及应用
Western Blot的原理及应用1. Western Blot的简介Western Blot，又称蛋白印迹法，是一种常用的蛋白质检测技术。
通过将待检的蛋白质样品分离、转移至膜上、以特定抗体探针探测目标蛋白质，然后用染色剂标记抗体来可视化目标蛋白。
2. Western Blot的原理Western Blot技术主要分为以下几个步骤：2.1 电泳分离将待检样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据蛋白质大小和电荷来确定聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型（SDS-PAGE、Native-PAGE等）。
2.2 转移将电泳分离出的蛋白质从凝胶转移到膜上，常用的转移方式包括湿式转移、半湿式转移和干式转移。
2.3 阻断使用适当的缓冲液对膜进行阻断，如牛奶、BSA等，用于防止非特异性结合。
2.4 探测抗体加入特异性一抗，与目标蛋白质结合。
一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体，可以选择根据实验需求选择。
2.5 二抗探针加入与一抗来源不同动物的二抗探针，例如兔子抗鼠二抗或羊抗兔子二抗等，二抗探针会与一抗结合。
2.6 可视化通过染色剂等方法来可视化目标蛋白质，常用的方法有辣根过氧化物酶（HRP）标记的次级抗体与发光底物反应产生发光，或使用染色剂如染蓝等。
3. Western Blot的应用Western Blot技术在生命科学领域有着广泛的应用，包括：3.1 蛋白质鉴定与定量Western Blot技术可以快速鉴定蛋白质的存在与纯度，通过与已知标准蛋白质比较可以进行定量分析。
3.2 抗体检测和验证通过Western Blot可以检测抗体的特异性和亲和力，验证抗体的质量和功能。
3.3 蛋白质翻译后修饰的研究Western Blot可以用于检测蛋白质的磷酸化、甲基化、酰化等翻译后修饰，帮助我们了解蛋白质功能的调控机制。
3.4 疾病诊断和治疗研究Western Blot在临床疾病的诊断和治疗研究中起着重要作用，如肿瘤标志物的检测、药物疗效的评估等。
western blot 实验原理
western blot 实验原理Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，通过将待检测样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特异性的抗体探针进行特定蛋白质的检测。
Western blot实验主要包括以下步骤：1. 样品制备：待检测样品通常经过细胞裂解或组织研磨，提取蛋白质。
蛋白质溶液经过蛋白浓度测定后，可进行下一步实验。
2. SDS-PAGE电泳：蛋白质溶液经过加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）的样品缓冲液，并在电泳条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）分离蛋白质。
在电泳过程中，SDS会使蛋白质变成带负电荷的线性结构，相同大小的蛋白质在凝胶中的迁移速度也相似。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜上。
转移通常通过将膜和凝胶在电流作用下接触，使蛋白质通过电场转移到膜上。
4. 阻断：将转移后的膜放入含有蛋白质的牛乳或鸡蛋清中，使未特异性结合位点被占据，阻断非特异性结合。
通过此步骤可以减少假阳性的可能性。
5. 抗体探针结合：将特异性抗体溶解在牛乳或鸡蛋清中，并将膜与抗体溶液接触。
抗体将与目标蛋白质特异性结合。
6. 信号检测：使用染色剂或酶标记的抗体来检测抗体-目标蛋白质结合的位置。
这些检测方法可以根据被标记物的类型而有所不同，如酶方法、放射性方法和荧光方法等。
7. 结果分析：使用成像系统（如X射线胶片或数码成像设备）捕捉膜上的信号，并在计算机软件中进行定量和定性分析。
Western blot技术可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等，广泛应用于生物医学研究、生物制药和临床诊断等领域。
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Western Blot的原理和所用试剂汇总
Western Blot的原理和所用试剂汇总
Western免疫印迹（Western
Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western
Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
分类
western显影的方法主要有以下几种：
1.放射自显影
2.底物化学发光ECL
3.底物荧光ECF
4.底物DAB显色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
主要试剂
1、
丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、
分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后40C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L
HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后40C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、
TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH太低时，聚合反应受到抑制。
10%(w/v)过硫酸胺溶液。
提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.
6、SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS
12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O
32ml混匀备用。
按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L
Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。
临用前稀释10倍。
8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
9、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。
使用后应予以废弃。
10、脱脂奶粉5%(w/v)。
11、NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、过氧化物酶标记的第二抗体。
15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、100mmol/L NaCl。
19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。