高效液相色谱-串联质谱法对动物源食品中阿莫西林药物残留的检测

高效液相色谱-串联质谱法对动物源食品中阿莫西林药物残留的检测

摘要：本文通过对前处理以及仪器方法的研究和优化，建立了动物源食品中阿莫西林残留的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测方法。样品经过磷酸盐缓冲溶液提取，乙酸锌沉淀蛋白，HLB固相萃取柱净化，乙腈/0.005%甲酸洗脱后，直接上机检测。采用乙腈-10 mmol/L乙酸铵（0.35%甲酸）为流动相，经Waters XBridgeTM HILIC（2.0 mm× 150 mm i.d., 3 μm）分离后，电喷雾串联质谱测定。在加标水平100~300 ng/g范围内，加标回收率为75.42%~90.22%，相对标准偏差小于10%，方法定量限为0.06 μg/kg。该方法灵敏度高，重现性好，适于猪肉、猪肉成品、鸡肉和鸡肉成品中阿莫西林残留的测定。

关键词：阿莫西林；动物源食品；残留检测；液相色谱-串联质谱法；HILIC色谱柱

Determination of the residue of Amoxicillin in animal origin food stuffs by LC-MS/MS Abstract：A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) method has been established for determination of amoxicillin in animal origin food stuffs by optimization analysis. The samples were extracted with phosphate buffer, precipitated the proteins with zinc acetate, and purified by HLB solid phase extraction column, then eluted with acetonitrile-0.005% formic and directly analyzed by LC-MS/MS. The separation was carried out on a Waters XBridge TM HILIC (2.0 mm×150 mm i.d., 3 μm), using acetonitrile and 10 mmol/L ammonium acetate(0.35% formic) as mobile phases. The analysis used ESI as ion source, confirmed and quantified by MS/MS. The average recovery was 75.42~90.22% and the RSD was less than 10% when the concentrations are in the range of 100~300 ng/g. The limit of quantification of this method was 0.06μg/kg. This method was sensitive, reproducible, and was suitable for determination of amoxicillin in animal origin food stuffs.

Key words：amoxicillin; animal origin food stuffs; residues determination; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; HILIC column

中图分类号：TS251.7 文献标志码： A 文章编号：

阿莫西林(Amoxicillin)，又名安莫西林或安默西林，学名称为羟氨苄青霉素，属于青霉素类β-内酰胺抗生素，为半合成的耐酸广谱青霉素类抗菌素，对金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌、胸膜炎放线杆菌等几种常见的重要致病菌都具有较强的抗菌活性，目前广泛应用于兽医临床[1]。阿莫西林的不当或过量使用都会造成其在动物性食品中的残留，食用后会导致人体内白血球降低，影响内脏功能，发生脏器损害等，对老人、儿童，特别是胎儿的影响更大，严重者会导致胎儿病变、畸形、流产、死亡[2]。2012年底我国出现的速成鸡事件中，使用的兽药中就包括阿莫西林，因此很多国家和地区都对阿莫西林残留量有严格的要求，是欧盟和北美等国家对进口动物性食品的必检项目之一。欧盟要求在动物的肌肉、肝、肾、脂肪中的阿莫西林的最高限量为0.05 mg/kg；美国要求0.01 mg/kg；日本要求0.02 mg/kg。

目前报道的阿莫西林残留分析的方法主要有液相色谱法[3]、免疫分析法[4]、和微生物测定法[5]、液相色谱-串联质谱法[6]。近年来，随着液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术的发展，其不仅具有液相色谱的高分离性能，而且能提供药物结构方面的信息，可以进行确证检测，在药物残留分析领域得以广泛应用，因此本实验选择用液相色谱-串联质谱法分析阿莫西林残留。

目前关于阿莫西林样品前处理方法报道很多，但是在实际应用方面存在很多缺点，从一些企业内部的检测中心和第三方检测机构了解到，目前报道的关于鸡肉产品中阿莫西林的检测方法不能在实际中使用。比如有报道方法[2,7]，采用75mg/L的三氯乙酸进行除蛋白；中国国标方法[8]直接用磷酸盐缓冲液提取，不进行除蛋白，直接进行SPE净化。但是现在养殖场都是大规模饲养，鸡的出栏周期很短，肌肉纤维少，

用缓冲液提取后，成胶状，即使采用75mg/L的三氯乙酸处理也不能有效去除蛋白，离心效果差，过SPE 柱极其困难，无法操作。而且现在很多出口企业出口成品，即经过加热处理的产品，有些可以直接食用，而目前报道的方法都是关于新鲜肉中阿莫西林的检测，但在实际检测中发现，生肉和熟肉中阿莫西林的前处理方法差异很大。因此，本方法采用LC-MS/MS法，前处理使用乙酸锌除蛋白和脂肪，研究了猪肉和鸡肉中阿莫西林残留的检测。建立一种分析猪肉和鸡肉组织样品中阿莫西林残留量的有效方法。本法具有简便、快速、灵敏、试剂用量少等特点，可用于实际样品的测定。

1材料与方法

1.1 材料与试剂

阿莫西林标准品（纯度98%，批号C 10242500）德国Labor Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；乙睛（色谱纯）美国Fisher公司；甲醇（色谱纯）德国Merck公司；甲酸（纯度≥98%）瑞士Fluka公司；水（色谱纯）美国Fisher公司；其他试剂均为分析纯。固相萃取柱（HLB 6 cc 500 mg）美国Waters 公司。

鸡肉、猪肉、鸡肉成品和猪肉成品均采自于和日本火腿集团进行贸易的相关工厂。成品是指已经完成加工，可直接食用的食品。

磷酸二氢钠缓冲溶液（0.15 mol/L）：称取18.0 g（NaH2PO4），用水定容至1 L，然后用5 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.5。

阿莫西林标准储备液：准确称取阿莫西林标准品适量，用50%（体积分数）乙腈水溶液溶解并定容至50 mL，配制成100 mg/L的标准储备液，密封，-18℃保存。吸取标准储备液1.0 mL，用50%乙腈水溶液定容至10 mL，稀释成10 mg/L的标准工作溶液，-18℃下保存1周。

流动相：由A、B两种溶液组成。A为乙腈；B为10 mmol/L的乙酸铵（含0.35%乙酸）。

1.2 仪器与设备

HP 1200高效液相色谱仪美国安捷伦公司；API 3200三重四极杆串联质谱系统（配有电喷雾离子化源（ESI）和Analyst 1.4.2工作软件）美国ABI公司；NR6891475型拍打式均质器北京陆桥技术有限公司；4K-15型离心机美国Sigma公司；固相萃取装置美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1提取与净化

称取（3±0.01）g匀质样品，置于均质袋中，加入30 mL磷酸二氢钠缓冲溶液，均质拍打5 min。对于鸡肉样品，加入1.0 mL 1 mol/L乙酸锌溶液；对于鸡肉成品和猪肉成品，加入0.5 mL 1 mol/L乙酸锌溶液；猪肉样品不加乙酸锌溶液。继续均质拍打5 min，然后，以4500 r/min离心10分钟，得上清液，待净化。

依次用5 mL甲醇、5 mL水和5 mL磷酸二氢钠缓冲溶液活化HLB柱（6cc，500 mg）固相萃取柱。取上述组织提取液15 mL上样，以3 mL/min的流速通过固相萃取柱后，用5 mL水洗柱，真空将萃取柱抽干，弃去全部流出液。用3 mL乙腈/0.005%甲酸（4:6，V:V）洗脱，收集洗脱液于5 mL刻度样品管中，并用洗脱液定容至3 mL，摇匀后，过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.2色谱条件

色谱柱：Waters XBridge TM HILIC（2.0 mm× 150 mm i.d, 3 μm）；流动相由A、B两种溶液组成：A相为乙腈，B相为10 mmol/L的乙酸铵（含0.35%乙酸），梯度洗脱程序：0~1min，90% A；1~3 min，90% A~5% A；3~8 min，5% A；8~8.5 min，5% A~90% A；8.5~20 min，90% A。流速：200μL/min；柱温：40℃；进样体积：10 μL。

质谱参数：电离模式ESI+；电离电压5500V；气帘气流速（Curtain Gas）30 L/h；离子源温度600℃；雾化气流速（Gas1）80 L/h；辅助加热气流速（Gas2）80 L/h；MRM监测阿莫西林离子对及对应条件见表1。